本发明属于植物生物技术领域，具体涉及水稻两种锌指蛋白基因创制观赏型水稻种质的方法。
背景技术
植物的花器官发育是一个由多基因参与调控的复杂生物学过程。20多年来，利用拟南芥、矮牵牛和金鱼草中的一系列突变体开展研究，双子叶植物花器官发育的分子遗传机制研究取得了很大进展，提出了多个由“a、b、c、d、e”五类功能基因决定的植物花器官发育模型。这五类基因以mads-box为主，对植花器官的形态建成起关键作用，因而又被称之为“花器官特征”基因。作为花器官形成的最基本、最关键决定因子，大部分花器官特征基因的功能保守，它们之间相互作用、共同决定花器官发育的时空顺序。
尽管花器官特征基因对植物花器官形成起关键作用，但它们并不是唯一的决定因因。近年来发现，作为花器官特征基因的上游调控基因，也被证实在不同时期、不同部位或不同调控路径中，通过激活或抑制花器官特征基因的表达，参与决定植物花器官的形成。与花器官特征基因的功能普遍具有强保守性不同，这些调控基因在单、双子叶植物中的功能明显分化。锌指蛋白是一类普遍存在于植物中、具有指状结构域的转录因子，在植物等真核生物基因组中数量多、且分布广泛。目前已有的研究表明，部分锌指蛋白基因对植物的花器官形成起重要调节作用。其中，两个含锌指结构域的基因osjag和dl（含锌指结构域的yabby基因）被证实在水稻的花器官（特别是性器官）形态建成中发挥关键作用。osjag主要通过促进b类基因的表达来调控花器官（特别是雄蕊）的发育（horigomeetal,2009;xiaoetal,2009;duanetal,2010）；而dl基因则是通过抑制b类基因在第4轮的表达来调节水稻雌蕊的发育（nagasawaetal,2003；yamaguchietal,2004）。这些研究进展，为遗传改良水稻的穗部性状、创制水稻新种质奠定了基础。
水稻是重要的粮食作物，人们种植水稻的主要目的是获取稻谷、提供主食。稻穗是水稻的一个重要农艺性状，它由若干小穗组成。小穗是水稻籽粒形成的基础，其发育状况直接影响稻谷产量，任何一个与之有关的重要基因发生功能性突变都会导致小穗发育异常而不能结实。随着人们生活水平的提高，人们对花卉等观赏型植物的消费越来越多，对其种类和品种的多样性需求也越来越高。水稻的小花从外到内依次由内稃和外稃、浆片、雄蕊和雌蕊组成。正常的水稻花朵小、且花期短而无观赏价值。但水稻具有生长旺盛、株形美观、再生能力强、种植养护简单、且人们对其有天然亲近感等有利因素，若能对其穗部进行改造，开发出花型大而奇异、花期长、观赏价值高的水稻种质，将具有很好的推广应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于利用两种水稻的锌指类转录因子基因对水稻穗部性状进行改造，创制观赏型水稻的方法。这两种水稻花器官发育调控基因分别为c2h2型锌指蛋白基因osjag和含锌指结构域的yabby家族基因dl，这两种基因能够特异性调节水稻小穗的发育，这为利用这两种水稻锌指蛋白基因改良水稻的穗部性状、从而培育出具有很高观赏价值水稻新种质提供了新的途径。
本发明的技术方案如下：
本发明所述控制水稻花器官发育的两种锌指蛋白基因osjag和dl的核苷酸序列可从水稻基因组数据库下载获得（http://www.ricedata.cn/gene/index.htm）。
所述的osjag的等位突变体osjag和dl的等位突变体dl均是从籼稻品种明恢86组培后代中获得。其中，osjag为osjag基因缺失8054bp的片段；dl为dl基因的第1内含子中插入了一个5124bp的反转座子基因，导致dl基因不表达。
将含上述两种突变等位基因通过杂交的方法导入到同一个水稻植株中，产生的双突变体osjagdl的小穗发育异常，形成穗大而结构奇特、花期长、能稳定遗传、具有极高观赏价值的水稻新种质。
利用两种锌指蛋白基因osjag和dl的等位突变基因osjag和dl为原料，通过杂交和分子标记选择，将这两种等位基因导入到同一种分蘖与再生能力强的籼型水稻种，获得能稳定遗传、具有极高观赏价值的种质。
具体包括以下步骤：
(1)以携带osjag的植株作母本与以携带dl且花粉发育正常的植株作父本进行杂交，获得杂交f1；
(2)种植步骤(1)获得的f1，成熟期单株收种获得f2种子；
(3)种植步骤(2)获得的f2，从能同时分离出osjag和dl两种突变体的株系中，利用分子标记技术快速鉴定出结实正常、且同时携带osjag和dl的杂合基因型植株，于成熟期收种，获得能稳定遗传的双突变杂合基因型种质；
(4)种植步骤(3)收获的种子，于幼苗期利用分子标记技术从中快速鉴定出双突变体osjagdl。
所述的等位突变基因osjag为osjag基因缺失8054bp片段；所述的等位突变基因dl为dl基因的第1内含子中插入了一个5124bp的反转座子基因。
作为本发明的一种改进，在osjag和dl基因的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的等位基因或其衍生序列也能达到本发明的目的。
本发明的优点在于：正常水稻小花的结构简单，从外到内依次由内稃和外稃、浆片、雄蕊和雌蕊组成，其花型小、花期短而无观赏价值。本发明以水稻两种锌指蛋白基因osjag和dl的突变等位基因为原料，通过杂交和分子标记选择，将这两种等位基因快速导入到同一种籼型水稻种质中，创制了一种能稳定遗传、花型大且结构奇特、花期长、观赏价值高、易养护与繁殖等诸多优点的水稻种质，用于培育观赏型水稻，其培育成本低但经济效益高，因而具有很好的应用前景。
附图说明
图1：osjag与dl的双突变体osjagdl小穗的表型；其中a：野生型、单突变体osjag和dl小穗的表型；b：去除内外稃后的野生型小穗；c：去除内外稃后的osjag小穗；d：去除内外稃后的dl小穗；e-g：开花后3周时的双突变体osjagdl的小穗；h：开花后3周时的双突变体osjagdl小穗的一个小分支；i-j：开花后6周时的双突变体osjagdl的小穗；比例尺=1mm（a-d），2mm（e-j）。
图2：反转座子基因插入dl基因的位点。
图3：不同发育阶段的双突变体幼穗的原基分化与发育特征（图中数字1-6和7表示第3轮的6个雄蕊原基和第四轮的1个雌蕊原基完全转化为7团其它的器官原基）。比例尺=50μm。
具体实施方式：
下面结合实例，对本发明作进一步说明。
实施例1：osjag和dl的鉴定与保存
osjag的鉴定与保存：如图1a与1c所示的水稻突变体osjag为本发明者从籼型水稻品种明恢86幼胚培养的后代群体中获得（duanetal,2010）。如图1a与1c所示的花器官发育明显异常的突变体osjag，其小穗的第1轮内外颖变窄、细、硬而不能闭合，内颖弯曲呈月牙形；第2轮白色、肉质状的浆片变薄而大；第3轮的六枚雄蕊完全转化为雌蕊或肉质状的雌蕊-雄蕊嵌合体；第4轮的雌蕊发育异常，子房的柱头增多且高度不育。遗传分析表明，该突变性状由隐性单基因突变控制。测序结果表明，突变体的osjag基因检测到8054bp片段的缺失（包括5’-端起始密码子atg前缺失4492bp，基因区1416bp，以及3’-末端终止密码子tga后2146bp）。因此，osjag是一个零等位突变体（duanetal.,2010）。
因osjag的无雄蕊、且雌蕊高度不育，突变体性状只能通过杂合基因型osjag/osjag保存，在其自交后代会分离出野生型（1/4）、杂合体（1/2）与osjag突变体（1/4）。根据osjag突变体中该基因缺失序列的长度，设计3条特异引物组成两对（引物1+引物3，引物2+引物3）混合在一起，利用1次pcr反应（94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），即可从osjag杂合体自交后代的幼苗中快速鉴定出这三种基因型植株，于成熟期收获杂合基因型植株的种子。所用引物序列及检测结果如表1所示。
表1osjag杂合体自交后代三种基因型植株的鉴定
dl的鉴定与保存：如图1a和1d所示的水稻突变体dl为本发明者从籼型水稻品种明恢86的幼胚培养的株系后代中获得。取籼稻品种明恢86开花后12天的未成熟种子，经75%乙醇消毒2分钟、2%的次氯酸钠浸泡20min、无菌水漂洗3-5次，挑取幼胚接入nb培养基（nb+2,4-d2mg/l；ph5.8-5.9），置于27℃恒温箱中黑暗培养15天，诱导愈伤生长；将长出的愈伤组织转入新的nb培养基中，继代培养15天；挑选颜色鲜黄、表面光滑的胚性愈伤组织转至分化培养基（nb+kt10mg/l+naa0.4mg/l；ph5.8-5.9），20-30天后分化出再生植株；将生长至2-3cm高的再生苗移至1/2ms的生根培养基（1/2ms；ph5.8-5.9）培养10-15天；经炼苗处理后的再生植株移至大田种植。
从明恢86幼胚组织培养株系的后代中找到了如图1a与1d所示的花器官明显异常的突变体dl。该突变体的雌蕊完全退化、完全转变为多枚数目不定的雄蕊状器官，因而表现为多雄蕊而无雌蕊。测序结果表明，突变体在如图2所示的dl基因的第1内含子中插入了一个5124bp的反转座子基因（序列如seqidno.1所示），导致dl功能完全缺失。因dl突变体的花粉可育但无雌蕊而表现不育，突变体性状只能通过杂合基因型保存，在其自交后代会分离出野生型（1/4）、杂合体（1/2）与dl突变体（1/4）。根据dl突变体中在该基因中插入的反转座子序列，设计3条引物组成两对（引物4+引物5，引物4+引物6）混合在一起，利用1次pcr反应（94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s），即可在从dl杂合体自交后代中的幼苗中快速鉴定出野生型与杂合体植株，于成熟期收获杂合基因型植株的种子。而可依据叶片表型的特征，可直接鉴定出dl突变体植株。所用引物序列及检测结果见表2。
表2dl杂合体自交后代野生型与杂合体植株基因型的鉴定
实施例2：双突变体osjagdl的创制、快速鉴定与保存
(1)以携带osjag的等位突变基因的植株作母本（实施例1获得的osjag突变体杂合体）与以携带dl等位突变基因且花粉发育正常的植株（实施例2获得的dl突变体杂合体）作父本进行杂交，获得杂交f1；
(2)种植步骤(1)获得的f1，成熟期单株收种获得f2种子；
(3)种植步骤(2)获得的f2，从能同时分离出osjag和dl两种突变体的株系中，利用分子标记技术快速鉴定出结实正常、且同时携带osjag和dl的杂合基因型植株，于成熟期收种，获得能稳定遗传的双突变杂合基因型种质；
(4)种植步骤(3)收获的种子，于幼苗期利用分子标记技术从中快速鉴定出双突变体osjagdl。
因两种单突变体osjag和dl均不能正常结实，且它们的突变性状只能分别通过突变杂合体植株保存，在它们各自的杂合体自交后代中分别有1/4比例的osjag突变体和dl出现。因此，不能利用两种单突变体直接杂交的方式创制双突变体。由于dl的雄蕊发育正常、且花粉可育，而杂合体植株osjag/osjag的雄蕊与雌蕊均发育正常而可育。因此，以osjag/osjag作母本与dl的可育花粉杂交获得雄蕊与雌蕊均发育正常且可育的f1植株，其自交的f2中会分离出如图1e-j所示的双突变体osjagdl植株。所有单个osjagdl小穗是由无数新的异常发育的小穗组成“花中穗”结构，这些小穗的外围均由无数细小的绿色稃片状器官包裹，中间充满淡黄色、肉质状的器官；在适宜的光温环境条件下，osjagdl的花期可长达40天以上。图3所示的扫描电镜观察表明，双突变体osjagdl小穗的表型其各轮花器官原基数目不变，但随后其四轮花器官的发育方向均发生明显转变，最终发育成结构特异、表型与两种单突变体osjag与dl完全不同的小穗。
因这两种突变体均来自同一个亲本明恢86，osjagdl双突变体的突变性状可稳定遗传。因此，只需要选择出同时含有两种杂合基因型的植株，于成熟期收获双突变杂合基因型植株的种子，以保存双突变体的性状，在其自交后代的群体中可分离出双突变体osjagdl植株。根据osjag与dl各自的突变特点，利用上述表1与表2中的引物，通过2次pcr的方法，可在苗期从osjag与dl的双突变杂合体自交后代的群体中快速鉴定出osjag与dl的双突变杂合体基因型植株及双突变体植株。因osjagdl双突变体植株与dl单突变体一样，呈现出叶片披垂的特性，在鉴定双突变体时，可先根据叶片的表型直接鉴定出dl突变体；然后再利用pcr的方法，鉴定dl突变体中是否存在osjag突变体基因型。
表3osjag与dl的双突变杂合体自交后代7种基因型的鉴定
本发明所创制的osjagdl种质具有极高的观赏价值，可用于培育观赏型水稻。以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对与本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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<110>福建农林大学
<120>利用水稻两种锌指蛋白基因创制观赏型水稻种质的方法
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