一种禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法与流程

本发明属于植物生物
技术领域：
，具体涉及一种禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法。
背景技术：
芒草(miscanthus)是一类重要的c4类禾本科能源草和饲草，具有生物质产量高、抗逆性强等特点，自然分布于东亚及东南亚地区，我国主要有芒(m.sinensis)、五节芒(m.floridulus)、荻(m.sacchariflorus)、南荻(m.lutarioriparius)等种类，它们均具有严格的自交不亲和性(self-incompatibility，si)，即自交不结实。自交不亲和性对于植物避免近亲繁殖和保持遗传多样性具有重要意义，同时也是植物杂种优势利用的主要途径之一，利用自交不亲和系做母本，与其它自交不亲和系、自交系或正常品系进行配组杂交，既避免了繁琐的去雄操作，又可以获得杂种优势，自上世纪四十年代以来，科学家利用十字花科植物的自交不亲和性机制配制甘蓝型油菜以及甘蓝、大白菜和萝卜等蔬菜优良杂交种获得成功，大幅度提高了产量及品质。但另一方面，自交不亲和性植物在自然界中长期以杂交方式进行有性繁殖，个体基因组杂合度高，遗传背景复杂，由于无法获得自交纯系，杂交f1代中即有性状分离，既降低了其杂种优势的表现，不适宜大规模生产杂交种子推广种植，也极大地限制了基因定位、基因图位克隆和全基因组测序等遗传学研究的开展，阻碍了进一步的遗传改良，因此需要寻找克服其自交不亲和性的途径。在芒草等植物的杂交育种及遗传学研究中，往往需要测定自交不亲和性指数或不同基因型之间的杂交亲和性指数，目前，自交不亲和性指数或杂交亲和性指数等自交不亲和性表型的常规测定方法是在田间或盆栽植株上采用人工套袋强制自交授粉或人工异花授粉，待植物进入成熟期后，统计不同处理下植株自交或杂交的种子结实率，该方法的试验周期一般需要数个月时间，不仅费时、工作量大，而且试验结果易受温度、湿度、风力、降雨等外界环境条件的影响，导致试验的可重复性差，准确性不高。因此发明一种简便高效、可重复性好的芒草自交不亲和性鉴定方法具有十分重要的意义。很多具有自交不亲和性的禾本科植物例如柳枝稷、多年生黑麦草、羊草、天蓝虉草、多花黑麦草、黑麦、球茎大麦、草甸羊茅和大穗看麦娘等的生长特点也和芒草类似，因此，也存在上述芒草测定自交不亲和性指数或不同基因型之间的杂交亲和性指数上的问题，可以采用本发明相似的方法解决。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种禾本科植物自交不亲和性表型的细胞学离体鉴定方法，该方法适合于禾本科植物的遗传学分析以及杂交育种研究。以芒草为例，将完整的芒草雌蕊切下做离体培养；然后在条件可控的室内环境下对离体雌蕊进行人工授粉；最后采用荧光显微观察检测花粉管在雌蕊柱头中的生长情况，从而确定芒草雌蕊柱头与花粉(自体花粉或异体花粉)之间的亲和性程度。该方法操作简单、成本低、条件可控、重复性好、准确性高，而且显著节省了鉴定时间，提高了禾本科植物遗传学以及杂交育种研究的效率。本发明的目的是通过下述方式实现的：一种禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，该方法包括如下步骤：1)雌蕊离体培养：从母本花序上选取成熟小穗，将完整雌蕊切下，在固体培养基中离体培养；2)授粉：用父本花粉给雌蕊授粉；3)显微观察：显微镜下观察并统计雌蕊与花粉之间的亲和度。所述的禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，步骤1)从母本花序上选取成熟小穗，在显微镜下将完整雌蕊切下，插入0.5％～1％(w/v)琼脂糖固体培养基中离体培养。所述的禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，所述的固体培养基为0.4mmol/l硼酸+300mmol/l蔗糖+0.5％～1％(w/v)琼脂糖。所述的禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，步骤2)授粉控制在雌蕊开始离体培养3天之内，优选24小时内。授粉之后室温放置至少1小时(优选2～3小时)进行软化和染色，再进行显微镜观察。所述的禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，步骤3)观察雌蕊柱头上花粉管的生长情况，统计花粉管已伸长进入胚囊的花粉所占的百分比。所述的禾本科自交不亲和性表型的离体鉴定方法，雌蕊授粉后进行软化和染色，再进行显微镜观察；雌蕊软化：授粉后雌蕊用8～10mol/lnaoh软化处理至少3小时，之后蒸馏水冲洗；雌蕊染色：软化后雌蕊用0.1％～0.5％苯胺蓝染色。所述的芒草自交不亲和性表型的离体鉴定方法，父本花粉的获得过程如下：(1)花序整理：从作为父本的植株上选取大部分小穗即将在次日开放的大型穗状花序，将花序连同茎秆一起剪下，茎秆保留1米的长度，然后将花序上少量已经开放的小穗修剪掉；(2)人工催花：将整理好的带花序枝条插入到hoagland营养液中，22℃～25℃放置于完全黑暗的条件下8～12小时，进行催花处理，促进花药从小穗外稃中露出，准备用于授粉试验。所述的芒草自交不亲和性表型的离体鉴定方法，所述的自交不亲和性禾本科植物包括芒草、柳枝稷、多年生黑麦草、羊草、天蓝虉草、多花黑麦草、黑麦、球茎大麦、草甸羊茅或大穗看麦娘等。所述的芒草自交不亲和性表型的离体鉴定方法，所述的自交不亲和性禾本科植物包括芒草。所述的芒草自交不亲和性表型的离体鉴定方法，芒草包含了芒、五节芒、荻或南荻。本发明方法优选以下方式：1、花序整理：从作为父本的芒草植株上选取大部分小穗即将在次日开放的大型穗状花序，用枝剪将花序连同茎秆一起剪下，茎秆保留约1米的长度，然后将花序上少量已经开放的小穗修剪掉，避免已失活花粉对试验结果的干扰。2、人工催花：芒草穗状花序上的小穗开花是渐进式的，一般是花序中上部的小穗最先开始开放，然后同时向上、向下推移，整个花序上的小穗开放完毕通常需要7天左右。为了使花序上大部分小穗能够同步开放，将上述整理好的带花序枝条插入到hoagland营养液中，室温放置于完全黑暗的条件下8～12小时，进行催花处理，促进花药从小穗外稃中露出，确保有足够量的新鲜花粉用于授粉试验。3、雌蕊离体培养：从作为母本的芒草花序上选取即将在次日开放的成熟小穗(通过反复观察发现，此时的羽毛状雌蕊柱头呈鲜艳紫红色)，在olympus体式显微镜下用尖头镊子将其内外稃剥开，暴露出雌蕊，然后用锋利的手术刀片从子房基部将完整的雌蕊切下，将羽毛状雌蕊柱头朝上，插入1％琼脂糖固体培养基(0.4mmol/l硼酸+300mmol/l蔗糖+1％琼脂糖(w/v))中离体培养，置于4℃下低温保存备用。取离体培养不同天数后的雌蕊放置于洁净的凹面载玻片上，滴几滴现配的3％h2o2溶液覆盖雌蕊，10分钟后在olympus普通光学显微镜下观察雌蕊柱头表面释放出气泡的数量及频率，估计雌蕊柱头可授性的强弱。结果表明，芒草雌蕊在培养基中离体培养3天内仍然具有100％的活力，完全具备授粉受精的能力(表1)，因此可应用于建立雌蕊柱头与花粉亲和性识别反应的鉴定技术。表1不同离体培养时间的芒草雌蕊柱头可授性雌蕊离体培养时间柱头可授性可授性强弱0小时100％+++24小时100％+++48小时100％++72小时100％++96小时63.8％++100小时55.3％++表示柱头具有可授性；++表示柱头具有较强可授性；+++表示柱头具有强可授性。4、室内授粉：次日清晨穗状花序上大部分成熟小穗的花药从内外稃两侧伸出之后，将盛有离体雌蕊的培养皿置于黑暗诱导处理之后父本的穗状花序下方，然后轻轻抖动花序促使花药裂开释放出花粉，给雌蕊柱头进行人工授粉。用i2-ki染色法测定的芒草花粉初始活力为86.6％～100％，符合试验要求。授粉完毕后，将培养皿在室温下放置2～3小时，使离体雌蕊充分完成受精进程。5、雌蕊软化：用镊子将授粉后的离体雌蕊浸入盛有10mol/lnaoh溶液的微孔板中软化和脱色处理3-4小时，然后转移到蒸馏水中漂洗2-3次。6、雌蕊染色：在一块洁净的载玻片上滴两滴0.1％苯胺蓝溶液，然后将经naoh软化后的雌蕊放入液滴中染色30分钟，盖上盖玻片制成装片。7、显微观察：将玻璃装片置于zeiss倒置荧光显微镜下观察雌蕊柱头上花粉管的生长情况，统计雌蕊柱头中花粉管已伸长进入胚囊的花粉所占的比例。本发明优势：(1)本发明首次采用雌蕊离体培养之后，在离体人工环境下进行授粉观测的方式鉴定芒草自交不亲和性表型，全方位解决了自交不亲和性鉴定方法领域存在的问题。(2)本发明方法简单易掌握，省去了传统鉴定方法中需要的田间花序套袋、植株授粉、留种、考种等诸多环节。(3)本发明方法试验条件可控，重复性好，筛选结果的准确度高。(4)本发明方法检测的周期短、效率高，在植物开花期，一个试验周期可以在24小时内完成，并且可以同步检测数十甚至上百个试验组合，因此可以快速、准确地鉴定出芒草大群体中不同基因型自交或相互杂交过程中雌蕊柱头与花粉之间的亲和度，显著提高了芒草遗传学以及杂交育种研究的效率。(5)很多具有自交不亲和性的禾本科植物生长特点也和芒草类似，因此，也存在上述芒草测定自交不亲和性指数或不同基因型之间的杂交亲和性指数上的问题，例如费时、工作量大、易于受环境影响、重复性差等，可以采用本发明相似的方法解决。因此，本发明方法应用前景广泛。附图说明图1为接种于固体琼脂糖培养基上的离体雌蕊；图2为芒草雌蕊柱头与花粉识别为0％亲和性的荧光显微分析图；图3为芒草雌蕊柱头与花粉识别为50％亲和性的荧光显微分析图；图4为芒草雌蕊柱头与花粉识别为75％亲和性的荧光显微分析图；图5为芒草雌蕊柱头与花粉识别为100％亲和性的荧光显微分析图。具体实施方式以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例1取材：江苏大学保存的20份芒(m.sinensis)基因型，编号为ms01～ms20。1、花序整理：从不同芒基因型的植株上选取即将在次日开放的穗状花序，用枝剪将花序剪下，下端保留长度约1米的茎秆，并将花序上少量已经开放的小穗修剪掉。2、人工催花：将整理好的花序枝条插入到hoagland营养液中，室温放置在完全黑暗的条件下8～12小时，进行催花处理。3、雌蕊离体培养：从同一芒基因型植株的花序上取即将在次日开放的成熟小穗，在olympus体式显微镜下用尖头镊子将小穗内外稃剥开，暴露出雌蕊，然后用锋利的手术刀片从子房基部将完整的雌蕊切下，将羽毛状的雌蕊柱头朝上，插入1％琼脂糖固体培养基(0.4mmol/l硼酸+300mmol/l蔗糖+1％琼脂糖(w/v))中离体培养，置于4℃下低温保存备用。4、室内授粉：次日清晨，待花序上大部分成熟小穗的花药从内外稃两侧伸出之后，将接种有离体雌蕊的培养皿置于花序下方，然后轻轻抖动花序促使花药裂开释放出花粉，给雌蕊柱头进行人工授粉。授粉完毕后，将培养皿在室温下放置2～3小时。5、雌蕊软化：用镊子将授粉后的离体雌蕊浸入盛有10mol/lnaoh溶液的微孔板中，软化处理3～4小时，然后转移到蒸馏水中冲洗2～3次。6、雌蕊染色：在一块洁净的载玻片上滴一滴0.1％苯胺蓝溶液，然后将经naoh软化后的雌蕊放入液滴中染色30分钟，盖上盖玻片制成装片。7、显微观察：将装片置于zeiss倒置荧光显微镜下观察雌蕊柱头上花粉管的生长情况，统计不同基因型的自交亲和性。分析结果表明，上述芒的基因型均具有严格的自交不亲和性，自交花粉仅能在雌蕊柱头表面萌发，但不能伸长进入雌蕊花柱组织中。实施例2取材：芒(m.sinensis)ms344及其与ms425正反交后代群体的不同单株。1、花序整理：从作为父本的正反交后代植株上选取即将在次日开放的穗状花序，用枝剪将花序剪下，下端保留长度约1米的茎秆，并将花序上少量已经开放的小穗修剪掉。2、人工催花：将上述整理好的花序枝条插入到hoagland营养液中，室温放置在完全黑暗的条件下8-12小时，进行催花处理。3、雌蕊离体培养：从ms344植株的花序上取即将在次日开放的成熟小穗，在olympus体式显微镜下用尖头镊子将小穗内外稃剥开，暴露出雌蕊，然后用锋利的手术刀片从子房基部将完整的雌蕊切下，将羽毛状的雌蕊柱头朝上，插入1％琼脂糖固体培养基(0.4mmol/l硼酸+300mmol/l蔗糖+1％琼脂糖(w/v))中离体培养，置于4℃下低温保存备用。4、室内授粉：次日清晨，待作为父本的花序上大部分成熟小穗的花药从内外稃两侧伸出之后，将接种有母本离体雌蕊的培养皿置于花序下方，然后轻轻抖动花序促使花药裂开释放出花粉，给雌蕊柱头进行人工授粉。授粉完毕后，将培养皿在室温下放置2-3小时。5、雌蕊软化：用镊子将授粉后的离体雌蕊浸入盛有10mol/lnaoh溶液的微孔板中，软化处理3～4小时，然后转移到蒸馏水中冲洗2～3次。6、雌蕊染色：在一块洁净的载玻片上滴一滴0.1％苯胺蓝溶液，然后将经naoh软化后的雌蕊放入液滴中染色30分钟，盖上盖玻片制成装片。7、显微观察：将装片置于zeiss倒置荧光显微镜下观察雌蕊柱头上花粉管的生长情况，统计不同正反交后代单株与亲本ms344之间的杂交亲和性。不同杂交组合分别呈现出0％亲和性、50％亲和性、75％亲和性和100％亲和性等四种类型(表2)。表2正反交后代单株之间的杂交亲和性测定对比例1取材：江苏大学保存的芒(m.sinensis)基因型，编号为ms344和ms420，种植于实验圃内，两者的开花期相近。1、花序套袋：从进入盛花期的母本植株上选取小穗尚未开放的花序，用硫酸纸袋套袋并封口，然后编号。2、强制自交：将一部分花序持续套袋，强制其进行自交。3、人工杂交：清晨从父本植株的小穗正在开放(此时雄蕊已伸出小穗外稃但未释放花粉)的花序上收集花粉，然后解开母本花序上的套袋，立即用收集到的父本花粉给母本花序的雌蕊柱头进行人工授粉；授粉结束后，仍然用硫酸纸袋套袋并封口，防止其它来源的花粉飘入造成混杂。4、结实率统计：授粉一个月后开始收集已成熟的自交或杂交套袋花序，每个处理随机选取3个花序(相当于3次重复)进行结实率统计：从花序上取下单个小穗，从小穗柄处挤压小穗将种子挤出并统计收获的种子数量，结实率＝(种子粒数/花序上小穗总数)×100％。结果表明，ms344和ms420自交结实率均为0，表现为自交不亲和；而两者的正反交组合中均收获到种子，表现为杂交亲和，但每个杂交组合中3次重复的结果之间差异显著，这主要是受到父母本开花期的一致性、授粉时父本的花粉量和母本花序上已开花小穗的比例，以及授粉后田间气候条件(温度、湿度、风力、降雨)等多种因素的影响，导致可重复性差，准确性不高。见表3。表3芒基因型ms344和ms420自交及正反交组合的结实率当前第1页12