急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型及其microRNA筛选方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型及其microrna筛选方法和应用，尤其是急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型、急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型内的microrna的筛选方法、以及该模型和该筛选方法的应用。

背景技术

脑卒中是由脑部血液循环障碍导致局部神经功能缺失为特征的一组疾病。在我国，脑卒中已超过心血管疾病成为发病率、病死率和致残率最高的疾病。急性脑卒中构成中，大约85％属于出血性卒中。

时间窗(发病3.0-4.5小时)内重组组织纤维蛋白溶酶原激活物(rt-pa)静脉溶栓仍是治疗急性缺血性卒中(ais)的首选治疗方法，各国指南均以最高级别予以推荐，然而静脉溶栓对时间窗的严格限制以及溶栓再通率偏低的现状，一直在促使大家寻找更为有效的血管再通措施。近年来，越来越多的确凿证据，明确了介入支架取栓技术是卒中治疗领域的一项重大进展，并确立了介入支架取栓是急性缺血性卒中的重要治疗方法。

颅内出血转化(hemorrhagictransformation)是中重度急性缺血性卒中自然转归过程的一种表现，颅内出血作为脑缺血再灌注损伤的严重表现也是tpa药物溶栓和介入取栓两种再灌注治疗的最主要并发症。血管再通治疗后导致的颅内出血转化进一步加重了脑损伤，导致部分血管再通的卒中患者临床预后差。介入取栓再通治疗对颅内闭塞大血管产生快速再通，导致缺血的血管床瞬间发生再灌注，但是再通治疗后引起颅内出血的发生机制尚不明确。因此，从分子生物学的角度对出血转化的发生机制进行深入研究，积极寻找有效的分子标志物和治疗靶点，具有重要的临床价值。

mirna是一类长约22个核苷酸的非编码rna，通过与靶mrna的非翻译区结合，在转录后水平调节基因表达。mirna具有重要的生物学功能，参与调节生长发育、细胞增殖、分化、信号通路、新陈代谢和凋亡。近年来，与缺血性脑卒中相关的mirna研究取得了一定成果。

目前已有报道使用micrornas芯片对大脑中动脉闭塞(mcao)诱导的脑缺血小鼠模型梗塞脑组织显著差异的micrornas表达谱进行分析，并运用go和pathway进行生物信息学分析，共筛选出12个显著上调2倍的micrornas，18个显著下调2倍的micrornas。进一步分析发现显著上调和下调表达micrornas的靶基因均参与凋亡反应，并与mapk信号通路有关(liuc,zhaol,hans,etal.identificationandfunctionalanalysisofmicrornasinmicefollowingfocalcerebralischemiainjury.intjmolsci.2015；16(10):24302-24318.)。对脑缺血再灌注损伤大鼠模型的血液和脑组织进行micrornas表达谱分析，鉴定了7个不同调节模式的micrornas簇，这7个micrornas簇控制了4个与脑缺血进展密切相关的基因(aqp-4、vsnl1、transgelin和mmp-9)的表达(jeyaseelank,limky,armugama.micrornaexpressioninthebloodandbrainofratssubjectedtotransientfocalischemiabymiddlecerebralarteryocclusion.stroke.2008；39(3):959-966.)。此外，发现了短暂性大脑中动脉闭塞的成年大鼠脑组织中显著差异micrornas所调节的靶基因参与介导炎症，转录，神经保护，受体功能和体内离子稳态等生物学过程(dharapa,bowenk,placer,etal.transientfocalischemiainducesextensivetemporalchangesinratcerebralmicrornaome.jcerebbloodflowmetab.2009；29(4):675-687.)。然而目前尚未有关于急性脑缺血性卒中机械再通后颅内出血转化动物模型、该模型内的micrornas的筛选方法的公开报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型及其microrna筛选方法和应用，为诊断和治疗急性缺血卒中血管内介入再通后再灌注损伤提供新的方法和手段。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型的建立方法，包括步骤如下：采用多次高糖注射诱发大鼠急性高糖血症，联合线栓法闭塞大脑中动脉(mca)5小时后再通19小时的方法，建立急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型。

进一步地，具体步骤如下：

a)选取大鼠，麻醉，在插线闭塞大脑中动脉前15分钟，腹腔注射葡萄糖溶液，诱发急性高血糖症；

b)在颈部中线旁左侧0.5cm行旁正中切口，分离颈前浅、深筋膜、胸锁乳突肌和二腹肌；暴露左侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)及其远端分支翼腭动脉；

c)在eca远端备2根5-0丝线，结扎并剪断eca，牵引eca残端使其与cca保持方向平行；ica远端和cca近端放置动脉夹，阻断血流并保持eca残端充盈；ica近端及eca残端各备一根线并打结，但未收紧；

d)然后在eca残端剪一小口，取头端为光滑球形的尼龙线栓，由左侧eca残端逆行经ica插入左侧大脑中动脉(mca)，线栓进入距离cca分叉处约18-20mm并遇到阻力时停止进一步插线，收紧ica和eca处的备线，固定尼龙线栓，达到闭塞一侧mca主干，缝合切口并将线栓埋在皮下；

e)在闭塞后1h、2h、3h和4h分别腹腔注射葡萄糖溶液以维持大鼠呈高血糖状态；

f)持续闭塞mca主干形成缺血5h后，撤出丝线模拟机械再通恢复脑血流量；

g)再通恢复脑血流量19h后，完成模型的建立。

另一方面，本发明所建立的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型可用于研究预防或治疗机械再通后颅内出血转化药物或干预方法中的应用。

另一方面，本发明提供一种急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织microrna的筛选方法，具体过程如下：

1)选取急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织；

2)trizol法提取脑组织中rna，纯化；

3)测量rna浓度，电泳检测rna完整性后，荧光标记；

4)荧光标记的样本与microrna芯片进行反应，清洗，检测得到显著差异表达的micrornas；

5)采用荧光定量qrt-pcr技术对步骤4)所得结果进行验证，从而筛选得到表达存在显著性差异的micrornas。

进一步地，所述步骤4)中检测得到显著差异表达的micrornas包括

显著上调的microrna：mir-125b-2-3p、mir-195-3p、mir-214-3p、mir-320-5p、mir-465-3p、mir-487b-5p、mir-877、mir-3557-5p、mir-3596b；和

显著下调的microrna：mir-1-3p、let-7e-3p、mir-25-5p、mir-26a-5p、mir-27b-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-30a-3p、mir-98-5p、mir-101b-3p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-132-5p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-143-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-190a-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-344a-3p、mir-352、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-376b-5p、mir-376c-5p、mir-381-3p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p、mir-434-3p、mir-434-5p、mir-540-5p、mir-582-3p、mir-708-3p。

进一步地，所述步骤5)中筛选得到表达存在显著性差异的micrornas包括：

显著上调的microrna：mir-125b-2-3p、mir-195-3p、mir-214-3p；和

显著下调的microrna：mir-1-3p、let-7e-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-98-5p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p。

进一步地，所述步骤5)中验证的方法如下：

i)选取完整的rna进行cdna合成；

ii)对步骤i)所得cdna进行荧光定量pcr。

进一步地，所述cdna合成过程如下：pcr管中加入rna和引物混合物，加无rna酶的水使总体积至13ul，65℃保温5分钟后迅速在冰上冷却2分钟；离心后，加入12μlrna/引物变性溶液、0.5μl10mmdntp混合液、0.25μlrnase抑制剂、4μl5×m-mlv缓冲液、0.5μlrtasem-mlv，并用无rna酶的双蒸水稀释至20μl；37℃保温1分钟。所述引物混合物为表1中相应基因f和r的混合。例如基因名称为mir-195-3p，其引物混合物即为f:5’gcttcggcagcacatatactaaaat3’

r:5’cgcttcacgaatttgcgtgtcat3’的混合物。

进一步地，所述荧光定量pcr过程如下：

①构建cdna反应体系：2×mastermix5μl、10umpcr特异引物f0.5μl、10umpcr特异引物r0.5μl和cdna2μl，加水至总体积为10μl；手指轻弹管底使溶液混匀，5000rpm短暂离心；混合液待用；所述pcr特异引物f为表1中相应基因的特异引物f；所述pcr特异引物r为表1中相应基因的特异引物r；例如基因名称为mir-195-3p，

其特异引物f即为f:5’gcttcggcagcacatatactaaaat3’；

其特异引物r即为r:5’cgcttcacgaatttgcgtgtcat3’。

②pcr反应：将8ul混合液滴加到384孔pcr板中；再加入对应的2μlcdna；然后粘上密封薄膜封口膜，短暂离心混匀；在pcr程序进行设置前将准备好的pcr板置在冰上；将上述384孔pcr板置于realtimepcr仪器上进行pcr反应。

更进一步地，所述pcr反应所有的指标均按以下程序进行：95℃，10分钟；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒，收集荧光)。

更进一步地，所述pcr反应结束后，采用以下的程序进行溶解曲线分析：95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒；并从60℃缓慢加热到99℃，仪器自动进行ramprate为0.05℃/秒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明所述急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型的建立方法符合目前人类脑缺血疾病的发病基本理念，能真实模拟急性脑缺血机械再通后颅内出血转化的病理过程；所建立的模型成功率高，稳定性好；造模过程简单高效，手术切口小、有效防止大面积手术区域损失对生物模型造成的影响。

2)本发明采用microrna芯片对脑组织rna进行microrna表达检测分析，结果显示，与假手术组相比，颅内出血转化模型组有57个micrornas显著差异表达(p<0.05)，其中9个(mir-125b-2-3p、mir-195-3p、mir-214-3p、mir-320-5p、mir-465-3p、mir-487b-5p、mir-877、mir-3557-5p、mir-3596b)显著上调，48个(mir-1-3p、let-7e-3p、mir-25-5p、mir-26a-5p、mir-27b-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-30a-3p、mir-98-5p、mir-101b-3p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-132-5p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-143-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-190a-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-344a-3p、mir-352、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-376b-5p、mir-376c-5p、mir-381-3p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p、mir-434-3p、mir-434-5p、mir-540-5p、mir-582-3p、mir-708-3p)显著下调。

3)本发明采用荧光pcr对2)所得结果进行验证，证实了33个microrna显著差异表达(p<0.05)，与micrornas芯片结果一致；其中机械再通组显著上调3个(mir-125b-2-3p、mir-195-3p、mir-214-3p)，显著下调30个(mir-1-3p、let-7e-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-98-5p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p)。为后续研发急性缺血性卒中机械再通后再灌注损伤相关诊断试剂盒提供依据。

4)本发明提供的急性脑缺血介入治疗后颅内出血转化模型中，共33个micrornas的表达具有显著性差异，为急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型及其microrna筛选方法和应用提供了新的方法，将成为诊断和治疗急性缺血性卒中血管内介入再通后再灌注损伤的创新性手段。

附图说明

图1为实施例1中急性脑缺血机械再通治疗后颅内出血转化大鼠模型不同类型颅内出血；

图2为实施例2中急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型显著差异表达micrornas的芯片聚类图；

图3为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-195-3p差异表达柱状图；

图4为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-125b-2-3p差异表达柱状图；

图5为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-214-3p差异表达柱状图；

图6为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-1-3p差异表达柱状图；

图7为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中let-7e-3p差异表达柱状图；

图8为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-29a-5p差异表达柱状图；

图9为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-29c-3p差异表达柱状图；

图10为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-98-5p差异表达柱状图；

图11为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-103-3p差异表达柱状图；

图12为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-126a-3p差异表达柱状图；

图13为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-126a-5p差异表达柱状图；

图14为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-132-3p差异表达柱状图；

图15为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-136-3p差异表达柱状图；

图16为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-138-5p差异表达柱状图；

图17为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-139-5p差异表达柱状图；

图18为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-142-3p差异表达柱状图；

图19为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-149-5p差异表达柱状图；

图20为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-153-5p差异表达柱状图；

图21为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-212-5p差异表达柱状图；

图22为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-218a-5p差异表达柱状图；

图23为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-219a-2-3p差异表达柱状图；

图24为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-330-5p差异表达柱状图；

图25为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-335差异表达柱状图；

图26为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-337-3p差异表达柱状图；

图27为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-369-5p差异表达柱状图；

图28为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-376a-3p差异表达柱状图；

图29为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-376a-5p差异表达柱状图；

图30为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-383-5p差异表达柱状图；

图31为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-409a-5p差异表达柱状图；

图32为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-410-3p差异表达柱状图；

图33为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-411-3p差异表达柱状图；

图34为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-412-3p差异表达柱状图；

图35为实施例3中qrt-pcr分析急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中mir-425-5p差异表达柱状图；

图中，ttcstainingttc染色；non-ttcstaining未ttc染色；nohemorrhage无出血；hemorrhagicinfarctiontype出血性梗塞模型；parenchymalhemorrhagetype实质性出血模型；colorkeyandhistograrr颜色键和直方图；relativeexpression差异表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

实施例中所有数据采用spss20.0软件进行统计学分析，所有计量资料用均数±标准差(x±s)表示，采用单样本ks检验判断计量资料是否呈正态分布；正态分布资料采用单因素方差分析检验，而非正态分布资料采用mann-whitney非参数检验分析。计数资料采用fisher精确或卡方检验。p值小于0.05认为差异存在统计学意义。

实施例1急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型的建立

采用多次高糖注射诱发大鼠急性高糖血症，联合线栓法闭塞大脑中动脉(mca)5小时后再通19小时的方法，建立急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型，即血管内机械再通治疗后颅内出血转化模型。

1.1mca缺血再灌注模型

选取健康大鼠，术前12h禁食，不禁水。10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，维持大鼠肛温37±0.5℃。无菌条件下，在颈部中线旁左侧0.5cm行旁正中切口，分离颈前浅、深筋膜、胸锁乳突肌和二腹肌。暴露左侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)及其远端分支翼腭动脉。在eca远端备2根5-0丝线，结扎并剪断eca，牵引eca残端使其与cca保持方向平行。ica远端和cca近端放置动脉夹，阻断血流并保持eca残端充盈。ica近端及eca残端各备一根线并打结，但未收紧。然后在eca残端剪一小口，取头端为光滑球形的尼龙线栓，由左侧eca残端逆行经ica插入左侧mca，线栓进入距离cca分叉处约18-20mm并遇到阻力时停止进一步插线，收紧ica和eca处的备线，固定尼龙线栓，达到闭塞一侧mca主干，缝合切口并将线栓埋在皮下。持续闭塞mca主干形成缺血5h后，撤出丝线模拟机械再通来恢复脑血流量。

采用激光多普勒血流仪测量大鼠同侧mca供血区域的脑血流量。颈部皮肤切开前，取前囟后2mm和中线旁左侧5mm为中心，切开头皮，激光多普勒血流仪检测左侧mca区域的基础脑血流量。当丝线插入mca时脑血流量值下降为基础值的30％以下，表明已成功闭塞mca；拔出丝线5-10分钟时，mca血流量值恢复到基础值的50％以上，表明闭塞的mca成功再通。拔除线栓再灌注19h后取大鼠脑组织。

1.2诱发大鼠急性高糖血症的方法

所有大鼠麻醉后尾静脉采血，测量基础血糖值。参照以往研究，诱发大鼠急性高糖血症。简述如下，插线闭塞mca前15分钟，腹腔注射50％葡萄糖溶液(6ml/kg)诱导急性高糖血症，血糖值高于16.7mmol/l则为达到高糖血症。然后分别在初次腹腔注射葡萄糖后0.5h、1h、2h、4h尾静脉取血测量血糖值，并且在mca闭塞后1h、2h、3h和4h分别腹腔注射50％葡萄糖溶液(1.5ml/kg)以维持大鼠呈高血糖状态。

1.3实验分组

大鼠随机分为2组，即假手术对照组、机械再通治疗组。假手术对照组，手术过程和诱发高糖血症的方法相同，但不插入丝线。mca闭塞缺血24h，处死大鼠取材进行下述各项分析。

剔除发生以下几种情况的大鼠，包括(1)注射50％葡萄糖溶液后，血糖值没有达到高糖血症的标准；(2)激光多普勒监测，mca闭塞及再通后血流量下降或恢复程度没有达到标准；(3)取材脑组织后，证实发生了蛛网膜下腔出血。

1.4颅内出血转化标准

取材留取整个大脑半球，按照冠状面切取2mm厚度脑片，大体上分析脑皮层和基底节区的出血情况。参照影像学的ecass标准判断颅内出血转化，分为出血性梗塞(hi)和脑实质血肿(ph)两大类，每类分为两个亚型。即出血性梗塞1型(hi-1)，沿梗塞灶边缘有小瘀点、瘀斑；出血性梗塞2型(hi-2)，在梗塞区内有融合的瘀点、瘀斑，但未形成占位效应；实质性血肿1型(ph-1)，可见脑实质血肿占小于30％的梗塞面积，伴一些轻微的占位效应；实质性血肿2型(ph-2)，脑实质血肿占大于30％的梗塞面积，有大量占位效应。

结果显示，采用诱发高糖血症联合线栓法mca闭塞5h后再通19h的方法，在大鼠mca梗塞区域发生了不同程度的颅内出血转化，该模型模拟了急性缺血性卒中血管内机械再通治疗后的颅内出血转化。假手术对照组8只大鼠无死亡。颅内出血转化组27只大鼠。27只颅内出血转化组大鼠在基底节和(或)皮层出现不同程度的颅内出血，按照ecass分型标准，1只hi-1型出血、17只hi-2型出血、8只ph-1型出血以及1只ph-2型出血(见图1)。

实施例2颅内出血转化大鼠脑组织micrornas芯片检测

大鼠mca闭塞缺血24h，过量注射10％水合氯醛深度麻醉。以剑突为标志，“v”型剪开胸壁，暴露心脏，于心尖搏动最强点插入留置针，并将软管送入胸主动脉。经右心房灌注预冷的生理盐水约200ml，直至灌注液清澈。断头处死大鼠后，快速取全脑，去除嗅球、小脑和脑干，留取整个大脑半球。取材分别留取缺血侧大脑和非缺血侧大脑半球，rna保存液保存于-80度冰箱。

采用microrna芯片(mircurylnav.18.0；包含大鼠3100个micrornas,exiqon,vedbaek,denmark)检测急性脑缺血机械再通后颅内出血转化的大鼠脑组织，分为颅内出血转化组和假手术组两组(每组大鼠n＝3)，获取缺血侧大脑半球组织。每组各3张microrna芯片，获得颅内出血转化的脑组织micrornas表达谱。

使用trizol法提取缺血侧脑组织rna，并用rnaseyminikit(qiagen)对rna进行纯化。使用nanodropnd-1000测量纯化后的rna浓度，并通过电泳检测两组脑组织rna完整性。rna质量合格后，使用mircurytmarraypowerlabelingkit(cat#208032-a,exiqon)对样本的micrornas进行荧光标记，将荧光标记的样本与microrna芯片在杂交系统上进行反应。杂交反应结束后，对芯片进行清洗。使用芯片扫描仪扫描芯片，genepixpro6.0软件对扫描的图像进行分析，将所得实验结果转换成数字型数据，使用spss20.0统计学软件对原始数据进行运算和统计分析。按照倍数变化(foldchange)>2或<0.5和p值<0.05为标准，对两组样本间的显著差异表达的micrornas进行筛选。

micrornas芯片结果显示，与假手术组相比，颅内出血转化模型组有57个micrornas显著差异表达，其中9个显著上调(mir-125b-2-3p、mir-195-3p、mir-214-3p、mir-320-5p、mir-465-3p、mir-487b-5p、mir-877、mir-3557-5p、mir-3596b)，48个显著下调(mir-1-3p、let-7e-3p、mir-25、mir-26a-5p、mir-27b-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-30a-3p、mir-98-5p、mir-101b-3p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-132-5p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-143-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-190a-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-344a-3p、mir-352、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-376b-5p、mir-376c-5p、mir-381-3p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p、mir-434-3p、mir-434-5p、mir-540-5p、mir-582-3p、mir-708-3p)(见图2)。

实施例3荧光定量rt-pcr验证micrornas的差异表达

采用荧光定量qrt-pcr技术对上述芯片差异表达的micrornas进行进一步验证，分为颅内出血转化模型组和假手术组两组(每组大鼠n＝5)，获取缺血侧大脑半球组织。设计合成的qrt-pcr引物序列见表1。

3.1提取脑组织rna

将100g脑组织样品与1ml的trizol试剂混匀，并充分震荡。匀浆后样品于室温放置约10分钟，以使核酸蛋白复合体解离完全。每1mltrizol匀浆样品中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒后，30℃孵育5分钟。在4℃，12000g离心15分钟。移液管将水相添加到含异丙醇的新离心管中，充分混匀。30℃孵育10分钟后，于4℃，12000g冷冻离心10分钟。吸除上清液，在每1mltrizol试剂匀浆的样品中至少加入1ml冷冻的75％乙醇，对rna沉淀进一步清洗。振荡后，4℃、7500g冷冻离心5分钟。移去乙醇溶液，风干rna沉淀约10分钟，溶解rna时，加入depc水，反复吹打，然后55-60℃放置10分钟。获得的rna溶液-80℃保存。

表1荧光定量pcr使用引物序列

3.2rna质量检测

使用nanodropnd-1000测定脑组织样本的rna浓度和纯度，以depc水为空白对照组。取1g琼脂糖溶于72ml去离子水中，加热煮沸后冷却至60℃，加10ml的10×mops电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3mol)，并加入10ulgoldview核酸染料，轻微摇晃后，往胶板倒胶。取rna300ng，加3倍体积的甲醛上样染液，使goldview核酸染料终浓度为1μl/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。样品上样于胶孔中，在5-6v/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。在紫外透射光下观察并拍照。

3.3样品rna进行cdna合成

pcr管中加入rna和引物混合物(引物混合物为表1中rna相应基因f和r的混合)，加无rna酶的水使总体积至13ul，65℃保温5分钟后迅速在冰上冷却2分钟。离心后，加入12μlrna/引物变性溶液、0.5μl10mmdntpmixture、0.25μlrnaseinhibitor、4μl5xm-mlvbuffer、0.5μlrtasem-mlv，并用无rnaase的双蒸水稀释至20μl。37℃保温1分钟。充分混合均匀，高温变性使酶失活。

3.4合成cdna进行荧光定量pcr

构建cdna反应体系，包括2×mastermix5μl、10umpcr特异引物f(为表1中所列相应基因的特异引物f)0.5μl、10umpcr特异引物r(为表1中所列相应基因的特异引物r)0.5μl和cdna2μl，加水至总体积为10μl。手指轻弹管底使溶液混匀，5000rpm短暂离心。

将8ul混合液滴加到384孔pcr板中。再加入对应的2μlcdna。然后粘上密封薄膜封口膜，短暂离心混匀。在pcr程序进行设置前将准备好的pcr板置在冰上。将上述384孔pcr板置于realtimepcr仪器上进行pcr反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10分钟；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒，收集荧光)。为了建立pcr产物的熔解曲线，在扩增反应结束后，采用以下的程序进行溶解曲线分析：95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒；并从60℃缓慢加热到99℃，仪器自动进行ramprate为0.05℃/秒。

3.5pcr数据分析

将脑组织样品的目的基因和内参基因分别行pcr反应。所有样本重复3次，结果采用比较循环阈值(ct)法定量，计算方法为2-δδct法。

qrt-pcr检测发现，同假手术组相比，颅内出血转化模型组均显著增加了缺血半球mir-195-3p、mir-125b-2-3p、mir-214-3p的表达(p均<0.05)(图3～5)。同假手术组相比，颅内出血转化模型组均显著下调了缺血半球mir-1-3p、let-7e-3p、mir-29a-5p、mir-29c-3p、mir-98-5p、mir-103-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-132-3p、mir-136-3p、mir-138-5p、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-149-5p、mir-153-5p、mir-212-5p、mir-218a-5p、mir-219a-2-3p、mir-330-5p、mir-335、mir-337-3p、mir-369-5p、mir-376a-3p、mir-376a-5p、mir-383-5p、mir-409a-5p、mir-410-3p、mir-411-3p、mir-412-3p、mir-425-5p的表达(p均<0.05)(结果如图6～35所示)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。