本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及一种建立向日葵抗列当水平标准的方法。
背景技术：
：向日葵列当又称毒根草、兔子拐棍，是一年生草本植物，属双子叶植物，列当科。国内分布在河北、北京、新疆、山西、内蒙古、黑龙江、辽宁、吉林等省。主要为害向日葵、西瓜、甜瓜、豌豆、蚕豆、胡萝卜、芹菜、烟草、亚麻、番茄等。寄生在根部。向日葵列当是目前严重威胁向日葵产业发展的一个主要病害，在我国的向日葵产区均有发生，但以新疆、内蒙古地区发生最为严重。向日葵被列当寄生后，致植株矮小、瘦弱，不能形成花盘，最后全株枯死。筛选和培育抗列当的向日葵品种是目前最为有效的防治列当的措施。而在室内条件下建立一种快速筛选和鉴定不同向日葵品种的抗列当水平的体系是向日葵抗列当育种的前提和基础，但是目前筛选方法较多，没有统一的标准，筛选的参数指标较多，工作量较大。目前已有的营养钵鉴定法在操作过程中有很多的缺点，如该方法需要大量列当种子和土壤按一定比例进行混合；在后期列当数量统计前的洗涤工作，需要大量的人力和时间；该体系不利于观察列当的各个发育阶段。专利申请号为201611263115.5的发明专利提供一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法，即培养皿滤纸法，有以下几个关键步骤：(1)将预先催芽的向日葵幼苗置于铺有滤纸的13×13cm的塑料方皿中培养；(2)向日葵列当种子的清洁和消毒后用向日葵幼苗的根系分泌进行物预处理；(3)向日葵列当种子接种，将预处理好的向日葵列当种子随同滤纸一并移入有向日葵幼苗的方形培养皿中，用封口膜将培养皿封好后放置在光照培养箱中培养，添加蒸馏水保证滤纸处于湿润的状态；(4)列当种子的萌发和寄生瘤的形成的观察和寄生率的计数，但是该专利并没有从多个参数进行比较没有制定出建立向日葵抗列当水平标准的方法。技术实现要素：针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种建立向日葵抗列当水平标准的方法，建立室内条件下快速诱导向日葵列当萌发，从多个参数中筛选出影响较大的参数指标，由于列当种子的萌发率在不同抗性水平品种之间无显著差异，而瘤节形成数在不同抗性水平品种间差异显著，所以用列当寄生的瘤结数作为评价向日葵抗列当水平的标准。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种建立向日葵抗列当水平标准的方法，包括以下步骤：(1)向日葵列当种子的清洁和表面消毒；(2)向日葵种子的催芽；(3)向日葵根系分泌物收集；(4)向日葵列当种子的预处理；(5)向日葵列当种子的接种；(6)向日葵列当种子萌发率、寄生瘤结数及出茎数的观察和统计。优选的是，所述步骤(1)具体包括：(1.1)将向日葵列当种子过筛网去除杂质；(1.2)首先用蒸馏水进行震荡清洗，之后用次氯酸钠溶液充分震荡后静置，弃上清液；(1.3)加入乙醇，震荡后静置，弃上清液，之后无菌水冲洗；(1.4)将清洗后的列当种子进行干燥，收集。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.1)中筛网孔径为0.18mm，去除杂质后置于1.5ml离心管中。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.2)中加入0.1％的次氯酸钠。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.2)的具体操作为：离心管中加入蒸馏水进行震荡清洗，离心后弃上清液加入0.1％的次氯酸钠溶液充分震荡后静置，离心后弃上清液。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.3)中为75％的乙醇。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.3)的具体操作为：向离心管沉淀物中加入75％的乙醇，震荡后静置，离心后弃上清液，然后加入无菌水冲洗3次。上述任一方案优选的是，所述步骤(1.4)的具体操作为：将清洗后的列当种子平铺于滤纸上进行干燥，用毛笔收集干燥后的种子置于1.5ml离心管中备用。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)具体包括：(2.1)挑取颗粒饱满的向日葵种子放入盛有75％乙醇的锥形瓶中，充分震荡后静置；(2.2)将酒精倒出，加入无菌水震荡冲洗，取出消毒后的向日葵种子；(2.3)将脱脂棉铺于玻璃皿中，用无菌水将脱脂棉润湿，将向日葵种子用纱布包裹置于脱脂棉上，然后在培养皿上盖一块湿润的毛巾，将培养皿置于恒温培养箱中培养保持脱脂棉和纱布湿润。上述任一方案优选的是，所述步骤(2.3)中恒温培养箱温度为25℃。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中具体方法为：(3.1)将灭菌后的鹅卵石放入广口瓶中，然后将催芽后的向日葵接种于广口瓶中，(3.2)固定向日葵根系，接种向日葵，(3.3)广口瓶置于恒温培养箱培养后收集向日葵根系分泌物，将向日葵根系分泌物分装于离心管放入-4℃下保存。上述任一方案优选的是，所述步骤(3.1)中鹅卵石灭菌采用清水反复冲洗后放入铝饭盒中进行高温灭菌。上述任一方案优选的是，所述步骤(3.2)中用脱脂棉固定向日葵根系，每瓶接种5株向日葵。上述任一方案优选的是，所述步骤(3.3)中用锡箔纸包裹广口瓶置于25℃恒温培养箱培养48h后收集向日葵根系分泌物。上述任一方案优选的是，所述步骤(4)具体包括：(4.1)在玻璃皿底部铺上灭菌的滤纸，用向日葵根系分泌物将滤纸润湿后；(4.2)将经过消毒处理的向日葵列当种子平铺在滤纸上；(4.3)培养皿置于黑暗条件下进行预处理。上述任一方案优选的是，所述步骤(4.3)中培养皿用封口膜封好，置于23℃～28℃黑暗条件下进行预处理10天。上述任一方案优选的是，所述步骤(5)具体包括：(5.1)将脱脂棉平铺于培养皿底部，脱脂棉上方覆盖一层与滤纸，然后将经过预处理后的列当种子置于滤纸上，用蒸馏水将脱脂棉与滤纸润湿；(5.2)将催芽的向日葵幼苗接种到培养皿，幼苗的根系置于润湿的滤纸上，并固定向日葵的根系；(5.3)对向日葵根系进行避光处理，将培养皿直立竖放到光照培养箱中，每隔一天向皿内加蒸馏水一次。上述任一方案优选的是，所述步骤(5.1)中脱脂棉厚度为3mm，将1mg经过预处理后的列当种子均匀的置于滤纸的1/3～2/3处。上述任一方案优选的是，所述步骤(5.2)中接种时为2株/皿，用少量的湿润的脱脂棉固定向日葵的根系。上述任一方案优选的是，所述步骤(5.3)中对向日葵根系进行避光处理时采用锡箔纸包裹培养皿，光照培养箱中白天25℃，光强66％，夜晚18℃，黑暗，相对湿度为50％。上述任一方案优选的是，所述步骤(6)具体包括：(6.1)接种1周后在体视显微镜下观察向日葵列当种子的萌发情况，每个视野选择100粒向日葵列当的种子进行观察；(6.2)分别在接种7天、10天和13天后统计列当种子的萌发率；(6.3)在接种15天、20天、25天和30天，统计向日葵根上寄生的瘤结数；(6.4)在接种35天、40天，统计列当的幼茎数。上述任一方案优选的是，所述步骤(6)之后还包括利用列当寄生的瘤结数评价向日葵抗列当水平的标准。上述任一方案优选的是，利用列当寄生的瘤结数评价向日葵抗列当水平的标准为：在该鉴定标准中，没有瘤结形成的品种鉴定为免疫品种；每皿向日葵根系上瘤结的数量介于1到5之间的鉴定为高抗品种；瘤结数介于5到10之间为中抗品种；瘤结数介于10到15之间为感病品种；瘤结数超过15的为高感列当的品种。本发明的有益效果是：本发明提供一种建立向日葵抗列当水平标准的方法，建立室内条件下快速诱导向日葵列当萌发，从多个参数中筛选出影响较大的参数指标，由于列当种子的萌发率在不同抗性水平品种之间无显著差异，而瘤节形成数在不同抗性水平品种间差异显著，所以用列当寄生的瘤结数作为评价向日葵抗列当水平的标准。在该鉴定标准中，没有瘤结形成的品种鉴定为免疫品种；每皿向日葵根系上瘤结的数量介于1到5之间的鉴定为高抗品种；瘤结数介于5到10之间为中抗品种；瘤结数介于10到15之间为感病品种；瘤结数超过15的为高感列当的品种。附图说明图1为本发明的一种建立向日葵抗列当水平标准的方法一优选实施例的田间不同抗性品种室内抗列当水平的鉴定；图2为食葵品种室内与田间抗列当结果一致性的比较结果；图3为向日葵列当种子的萌发图；图4为向日葵列当种子瘤结的形成图；图5为列当在向日葵根部的寄生图；图6为列当在向日葵根部的寄生局部放大图；图7为向日葵列当的出茎期图；图8向日葵列当的出茎期局部放大图。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步说明。实施例1为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种建立向日葵抗列当水平标准的方法，即通过培养皿滤纸法，具体包括以下步骤：室内鉴定体系：(1)向日葵列当种子的清洁和表面消毒将田间采集的向日葵列当种子过筛网(直径为0.18mm)去除杂质后置于1.5ml离心管中，然后加入1ml蒸馏水进行震荡清洗。12000r/min离心10min后弃上清液加入1ml0.1％的次氯酸钠溶液充分震荡后静置5min，12000r/min离心10min后弃上清液；向离心管沉淀物中加入1ml75％的乙醇，震荡后静置5min；12000r/min离心10min后弃上清液，然后加入无菌水冲洗3次。将清洗后的列当种子平铺于滤纸上进行干燥。用毛笔收集干燥后的种子置于1.5ml离心管中备用。(2)向日葵种子的催芽挑取颗粒饱满的向日葵种子放入盛有150ml75％乙醇的锥形瓶中，充分震荡后静置5min；然后将酒精倒出，加入无菌水震荡冲洗2次，取出消毒后的向日葵种子用于种子的萌发。将脱脂棉均匀的铺于玻璃皿中(约3mm厚度)，然后，用无菌水将脱脂棉润湿。将消毒后的向日葵种子用纱布包裹置于脱脂棉上，然后在培养皿上盖一块湿润的毛巾，将培养皿置于25℃恒温培养箱中培养，促进种子的萌发。在催芽期间每天向培养皿内浇水一次以保持脱脂棉和纱布湿润。出芽后的向日葵种子将用于后续向日葵根系分泌物的搜集。(3)向日葵根系分泌物收集将鹅卵石用清水反复冲洗后放入铝饭盒中进行高温灭菌。将灭菌后的鹅卵石放入250ml的广口瓶中(约2/3体积)，然后将催芽后的向日葵接种于广口瓶中，用脱脂棉固定向日葵根系，每瓶接种5株向日葵，用锡箔纸包裹广口瓶置于25℃恒温培养箱培养48h后收集向日葵根系分泌物。将向日葵根系分泌物分装于50ml离心管放入-4℃下保存。(4)向日葵列当种子的预处理在直径9cm的玻璃皿底部铺上灭菌的滤纸，用收集好的向日葵根系分泌物将滤纸润湿后，将经过消毒处理的向日葵列当种子均匀的平铺在滤纸上，用封口膜封好培养皿，置于23℃～28℃黑暗条件下进行预处理。10天后便可用于接种处理。(5)向日葵列当种子的接种将脱脂棉均匀的平铺于12×12cm的塑料培养皿底部(厚约3mm)，脱脂棉上方覆盖一层与培养皿等大的滤纸。然后将1mg经过预处理后的列当种子均匀的置于滤纸的1/3～2/3处，然后用蒸馏水将脱脂棉与滤纸润湿。将事先催芽的向日葵幼苗接种到培养皿(2株/皿)，幼苗的根系置于润湿的滤纸上，并且用少量的湿润的脱脂棉固定向日葵的根系。盖上皿盖后用锡箔纸包裹培养皿(对向日葵根系进行避光处理)，将培养皿直立竖放到光照培养箱中(白天25℃，光强66％；夜晚18℃，黑暗，相对湿度为50％)。每隔一天向皿内加蒸馏水一次，一周后可进行观察。(6)向日葵列当种子萌发率、寄生瘤结数及出茎数的观察和统计接种1周后在体视显微镜下观察向日葵列当种子的萌发情况，向日葵列当种子的萌发状态如图3所示，每个视野选择100粒向日葵列当的种子进行观察。分别在接种7天、10天和13天后统计列当种子的萌发率；在接种15天、20天、25天和30天，统计向日葵根上寄生的瘤结数；在接种35天、40天，统计列当的幼茎数。向日葵列当种子瘤结的形成如图4所示，基于列当寄生的不同时间点，我们用接种30天的瘤结数辅助接种40天幼茎数来评价向日葵的抗列当水平。(7)利用列当寄生的瘤结数评价向日葵抗列当水平的标准。列当在向日葵根部的寄生如图5和图6所示，向日葵列当的出茎期如图7和图8所示。具体的：利用列当寄生的瘤结数评价向日葵抗列当水平的标准为：在该鉴定标准中，没有瘤结形成的品种鉴定为免疫品种；每皿向日葵根系上瘤结的数量介于1到5之间的鉴定为高抗品种；瘤结数介于5到10之间为中抗品种；瘤结数介于10到15之间为感病品种；瘤结数超过15的为高感列当的品种。实施例2采用实施例1的方法建立向日葵抗列当水平鉴定标准：供试材料为国家向日葵产业体系岗位和试验站提供的向日葵品种、品系或育种材料(以下都简称为材料)，共计12份，供试材料的相关信息见表1。供试的向日葵列当的种子采自巴彦淖尔市乌拉特前旗西小召镇地块，生理小种鉴定为g小种。表1供试向日葵食葵品种资源信息表选取田间鉴定出的不同抗性水平的向日葵品种在室内条件下利用本发明的方法培养皿滤纸体系进行进一步的抗性鉴定，田间不同抗性品种室内抗列当水平的鉴定结果如图1所示。感列当品种ld5009、抗列当品种jk601及免疫列当品种f917的列当种子萌发率无明显差异，都在70％左右。但是，三个不同抗性品种的瘤节形成数量却呈现极显著差异，其中，感列当品种ld5009的瘤节形成数为16，抗列当品种jk601的瘤节形成数为3，而免疫列当品种f917无瘤节形成。因此，我们认为在培养皿滤纸体系中，由于列当种子的萌发率在不同抗性水平品种之间无显著差异，而瘤节形成数在不同抗性水平品种间差异显著，所以用列当寄生的瘤结数作为评价向日葵抗列当水平的标准。对供试的12份田间已知抗性水平的向日葵食葵品种在培养皿滤纸体系中寄生的瘤节数进行统计，如图2所示，发现在田间条件下呈现免疫的品种tp3313，在培养皿体系中寄生瘤结数为0；而高抗列当的品种如jk601、jk103、巴葵138等品种的室内瘤节数均介于1-5之间，而田间呈现中抗水平的品种如科阳1号、科阳7号等每皿寄生的瘤结数介于6-10之间。田间呈现中感的品种如甘葵2号，t33等每皿寄生的瘤结数介于11-15之间；而感列当品种ld5009每皿寄生瘤结数高于15。通过比对田间抗性鉴定的结果和培养皿滤纸法鉴定的结果，本研究建立了在培养皿滤纸体系下利用列当寄生的瘤结数评价向日葵抗列当水平的的标准。在该鉴定标准中，没有瘤结形成的品种鉴定为免疫品种；每皿向日葵根系上瘤结的数量介于1到5之间的鉴定为高抗品种；瘤结数介于5到10之间为中抗品种；瘤结数介于10到15之间为感病品种；瘤结数超过15的为高感列当的品种如表2所示。表2向日葵列当抗性水平划分标准(培养皿滤纸法)table2standardofresistancelevelofsunflower.注：每皿中2株向日葵上寄生瘤结总数以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
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：的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12