本发明涉及一种适合葡萄微嫁接苗液体培养的方法。
背景技术
微嫁接技术是一种组织培养与嫁接相结合、将不同品种的砧木与接穗组培苗在组织培养条件下进行嫁接的技术。从20世纪50年代杜林博斯利用常春藤最先应用茎尖嫁接技术以来,微型嫁接技术获得飞速的发展。美国、法国、意大利、西班牙、南非、以色列、日本和中国先后相继在柑橘、苹果、桃、樱桃、杏、李、草莓、葡萄、鳄梨、巴旦杏、枣、库尔勒香梨等果树微嫁接时应用。该项技术现主要用于果树嫁接苗快速繁育、脱毒苗培育、嫁接亲和性鉴定、病毒检测及果树嫁接苗抗逆性机理研究等。
当前，果树微嫁接苗培育的方式主要以固体培养为主，且研究主要集中在培养基配方、嫁接方式、砧穗亲和性等方面，对微嫁接的具体方法研究较少，而在具体操作过程中，由于砧穗结合不牢固或砧木、接穗处理不当导致嫁接容易失败。相对于固体培养而言，液体培养更利于微嫁接苗根系的生长，且更适合通过短时间逆境胁迫(在培养基中添加peg、aba等)进行嫁接苗抗逆机理研究。虽然有极少数研究已经开展了果树微嫁接苗的液体培养，但其液体培养的支撑物主要是纸桥，在培养过程中容易因纸桥损坏而导致嫁接苗培育失败。在国内，葡萄微嫁接苗的培育已有相关的研究报道，但嫁接成活率偏低(低于70％)，且未见有葡萄微嫁接液体培养的相关报道。针对以上问题，本发明主要对葡萄嫁接苗培育的生根培养基、砧木、接穗处理方式、嫁接固定方式和液体培养支撑物等进行了创新，并建立了一种完善的适合葡萄微嫁接苗液体培养的方法，该方法可以应用于多个不同的葡萄砧穗组合嫁接苗培育，通过该方法嫁接的葡萄苗，根系发达，嫁接成活率超过85％，远远大于现有的葡萄微嫁接苗培育的成活率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适合葡萄微嫁接苗液体培养的方法，该方法操作简单，葡萄微嫁接苗成活率高、根系发达，不仅能够适用于葡萄嫁接苗的工厂化生产，还便于葡萄嫁接苗抗逆性研究。
一种适合葡萄微嫁接苗液体培养的方法，其特别之处在于，包括如下步骤：
(1)以培养30-40天的砧木品种组培苗为材料，去掉上端细小的部分和下端木质化部分，留取长度为2～3cm并且粗度大于1mm的中间茎段作为砧木，用手术刀剔除掉茎段上所有的叶片和腋芽；
(2)以培养30-40天的接穗品种组培苗为材料，取带有饱满腋芽的茎段作为接穗，去掉叶片，每个茎段上部只留一个腋芽，要求接穗长度大于1cm，粗度大于1mm；
(3)在无菌条件下，用手术刀在步骤(1)中准备好的砧木上端切开一个0.4-0.6cm的切口，将步骤(2)中准备好的接穗下端斜切一个斜面，斜面角度≤30度，然后将接穗斜面端插入砧木的切口，形成嫁接苗；
(4)选用厚度为1-1.2mm的铝箔片，将铝箔片剪成长2cm宽0.5cm的矩形小条，然后对折成u型卡子，将制备好u型卡子置于耐高温的密闭容器中进行高压灭菌，用灭菌后的u型卡子夹在步骤(3)中嫁接苗的嫁接口上，用镊子压迫u型卡子两端使u型卡子夹紧固定住嫁接苗的嫁接口；
(5)选取成熟的丝瓜瓤，晒干后去籽，然后将其剪成边长为4-5cm的正方形小块，放入耐高温的密闭容器中，再加入少量蒸馏水，密封后高压灭菌备用；
(6)将嫁接好的微型嫁接苗插入步骤(4)中准备好的丝瓜瓤上，然后将插有微型嫁接苗的丝瓜瓤放入盛有50ml液体培养基的培养瓶中培养。
步骤(6)中培养瓶直径6cm，高度12cm，液体培养基组成为：1/2b5大量元素+b5铁盐+b5微量元素+b5有机+吲哚丁酸0.2～0.4mg·l-1+蔗糖30g·l-1，ph6.0。
步骤(6)中培养条件为培养前5天弱光培养，要求光照强度1000lx，之后强光培养，要求光照强度大于2500lx，培养温度为25±2℃，培养40d后即可成苗。
本发明方法是一种适合葡萄微嫁接苗液体培养的方法，其有益效果为：①筛选出一种适合多个葡萄砧穗组合培养的液体培养基配方，利用该培养基培养的葡萄嫁接苗生根率达100％，且培养出的根系较固体培养更发达；②选用厚度为1-1.2mm的铝箔为材料做成的“u”卡子，在固定嫁接口时较其他材料更方便，易操作，首先是选用铝箔做材料可以用高压灭菌，灭菌更彻底，其次是选用1-1.2mm厚度的铝箔既可以保证在固定嫁接口时有足够的力度，保证嫁接的材料不易脱落，又具有良好的可塑性，能随着嫁接枝条的粗度而任意改变形状；③选用丝瓜瓤做嫁接苗液体培养的支撑物，不仅可以用高压灭菌，灭菌更彻底，而且多孔，有弹性，便于嫁接苗的插入，且不易变形损坏，操作更简便快捷。
具体实施方式
本发明方法包括以下几个步骤：
(1)培养基的配制与分装：
按照培养基配方：1/2b5(大量)+b5(铁盐)+b5(微量)+b5(有机)+吲哚丁酸0.2～0.4mg·l-1+蔗糖30g·l-1ph6.0配制培养基，并分装于直径6-8cm、高度12-15cm的玻璃培养瓶中，每瓶分装40-50ml的培养基，高压灭菌后冷却备用。
(2)铝箔卡子和丝瓜瓤支撑物的准备
选用厚度为1-1.2mm的铝箔片为材料，将其剪成长2cm，宽0.5cm的矩形小条，对折成u型卡子，将u型卡子置于耐高温的密闭容器中，然后高压灭菌后备用；选取成熟的丝瓜瓤，晒干后去籽，将其剪成边长为4-5cm的正方形小块(视培养瓶的直径大小而定)，将其置于耐高温的密闭容器中，再加入适当蒸馏水，密封后高压灭菌备用。
(3)葡萄砧木、接穗的准备与嫁接
①砧木的准备：以培养30-40d的砧木品种组培苗为材料，去掉上端细小的部分和下端木质化部分，留取长度为2～3cm的中间茎段(粗度大于1mm)作为砧木，并用手术刀剔除掉茎段上所有的叶片和腋芽；
②接穗的准备：以培养30-40d的接穗品种组培苗为材料，取带有饱满腋芽的茎段，去掉叶片，每个茎段上部只留一个腋芽，茎段长度1-2cm，粗度大于1mm；
③嫁接：在无菌条件下，用手术刀在准备好的砧木上端切开一个0.4-0.6cm的切口，在准备好的接穗下端斜切一个斜面，斜面角度≤30度，然后将接穗斜面端插入砧木的切口，形成嫁接苗。
(4)嫁接固定：
用灭菌后的“u”型铝箔卡子夹在嫁接苗的嫁接口，用镊子轻轻压迫u型卡子两端，使u型卡子牢固固定住嫁接口。
(5)液体培养：
将嫁接好的微型嫁接苗插入备用的丝瓜瓤上，然后将插有微型嫁接苗的丝瓜瓤放入准备好盛有液体培养基的培养瓶内进行正常培养。培养条件：培养前3-5天弱光培养(光照强度小于1000lx)，后期强光培养(光照强度大于2000lx，小于3000lx)，培养温度为25±2℃，培养30-40d后即可成苗。
实施例1：
(1)砧木品种：山葡萄、110r(110richter)、140r(140ruggeri)、5bb(kober5bb)、so4(selectionoppenheim4)。
(2)接穗品种：黑比诺、赤霞珠。
(3)砧穗组合：黑比诺-山葡萄，赤霞珠-山葡萄、赤霞珠-110r、赤霞珠-140r、赤霞珠-5bb、赤霞珠-so4。
(2)具体步骤：
①培养基的配制与分装：按照培养基配方：1/2b5(大量)+b5(铁盐)+b5(微量)+b5(有机)+吲哚丁酸+蔗糖30g·l-1ph6.0配制培养基，并分装于直径6cm、高度12cm的玻璃培养瓶中，每瓶分装50ml的培养基，高压灭菌后冷却备用。
②铝箔卡子和丝瓜瓤支撑物的准备：选用厚度为1.2mm的铝箔片为材料，将其剪成长2cm，宽0.5cm的矩形小条，对折成u型卡子，高压灭菌后备用；选取成熟的丝瓜瓤，晒干后去籽，将其剪成边长为4cm的正方形小块，放入玻璃瓶中，再加入适当蒸馏水，密封后高压灭菌备用。
③葡萄砧木、接穗的准备与嫁接：
砧木的准备：以培养35d的山葡萄、110r、140r、5bb、so4等砧木品种组培苗为材料，去掉上端细小的部分和下端木质化部分，留取长度为2～3cm的中间茎段(粗度大于1mm)作为砧木，并用手术刀剔除掉茎段上所有的叶片和腋芽；
接穗的准备：以培养35d的黑比诺、赤霞珠、霞多丽等接穗品种组培苗为材料，取带有饱满腋芽的茎段，去掉叶片，每个茎段上部只留一个腋芽，茎段长度大于1cm，粗度大于1mm；
嫁接：根据不同砧穗组合的要求，在无菌条件下，用手术刀在准备好的砧木上端切开一个0.5cm左右的切口，在准备好的接穗下端斜切一个斜面，斜面角度30度，然后将接穗斜面端插入砧木的切口。
④嫁接固定：
用灭菌后的“u”型铝箔卡子夹在嫁接苗的嫁接口，用镊子轻轻压迫u型卡子，使u型卡子牢固固定住嫁接口。
⑤液体培养：将嫁接好的组培苗插入备用的丝瓜瓤上，然后整体放入准备好的液体培养基上进行正常培养。培养条件：培养前5天弱光培养(光照强度1000lx)，后期强光培养(光照强度大于2500lx)，培养温度为25±2℃，培养40d后即可成苗。(上述液体培养基具体成分见下表)
通过本实例的实施，葡萄微型嫁接苗成活率达到95％，且生根快，较固体培养提前2天；生根率达到92％，平均根数3.6个根，根系生长旺盛，根系生长量较固体培养提高15％。