一种金钱鱼的人工繁殖方法与流程

本发明属于繁殖生物学技术领域，具体涉及一种金钱鱼的人工繁殖方法。

背景技术

金钱鱼(scatophagusargus)又名金鼓鱼，隶属鲈形目(perciformes)，金钱鱼科(scatophagidae)，分布于印度洋-太平洋海域，在我国主要分布于东海和南海海域，为兼具观赏与食用的优质经济鱼类。目前，金钱鱼养殖的鱼苗均来自于自然海域捕捞的野生鱼苗，随着金钱鱼养殖业的不断发展，对于鱼苗的需求量也不断增加，金钱鱼野生鱼苗遭到了过度捕捞。因此，金钱鱼的人工繁殖技术的开发与应用可以有效缓解养殖业对于自然资源的过度依赖，有利于保护野生渔业资源。

与大部分的海水鱼类不同，金钱鱼具有生殖洄游习性。在我国南海，待产卵的金钱鱼成鱼在每年的四月到六月有向近岸的短距离洄游。在洄游过程中，金钱鱼需要面临环境因子(如：ph、温度与盐度)的变化对鱼体生理状态的影响，影响性腺发育。同时，绝大部分鱼类的受精以及胚胎发育在体外进行，水体环境因子的变化直接影响鱼类受精与胚胎的发育过程。其中，盐度是一个重要环境因子，鱼类对盐度的变化有一定适应范围和耐受极限，研究证明环境盐度变化可以影响鱼类的性腺发育与繁殖。

研究发现，环境盐度同样也是影响金钱鱼正常繁殖的决定性因素。盐度可以直接影响金钱鱼血浆中类固醇激素的含量(如附图1所示)。另一方面，通过影响渗透压调控中的能量需求，盐度可以直接影响性腺发育以及胚胎存活。盐度的变化可以直接降低受精率、以及胚胎的正常发育和存活率，当水体盐度与最合适盐度存在差异时，会对鱼类的配子以及胚胎产生多种致死或非致死的影响。金钱鱼繁殖对盐度要求苛刻，人工养殖条件下并不能自然产卵，给人工繁殖技术的开发带来较大困难。在鱼类人工繁殖过程中，通过生态模拟方法，设定合适环境条件，辅以相应的激素刺激来人工诱导性腺成熟，可以获得高质量的配子。通过这种方法，已经成功实现了多种海水经济鱼类如：石首鱼、比目鱼以及大西洋鳕鱼的人工繁殖，极大促进这些品种人工养殖业的发展。

选择合适的亲鱼是人工繁殖成功与否的关键。在之前的实验过程中我们发现，养殖的金钱鱼绝大多数为雌鱼，雄鱼个体很少。在海鲈(dicentrarchuslabrax)以及鳗鲡(anguillaaustralis和anguillaanguilla)的养殖中也发现性别比例不平衡的现象，雄鱼的数量远高于雌鱼的数量。在很多鱼类中，某一性别的个体比另一性别的个体生长更快，导致雌雄个体相差较大。因此，雌雄个体分开饲养可以避免个体之间的争斗引起的性别比例不平衡现象。当体长超过10cm后，金钱鱼雌鱼生长速度会快于雄性个体。2龄雌鱼可以达到750-1000g，而2龄雄鱼只有150-200g。另外，由于雄鱼个体较小，在与个体较大的雌鱼一起饲养时不容易获得食物，直接影响它的性腺成熟，导致雌雄性腺发育的不同步，影响金钱鱼繁殖。

综上所述，随着金钱鱼的人工养殖规模不断地扩大，野生鱼苗资源过度捕捞，导致该物种的野生苗种资源日益匮乏。另外，金钱鱼繁殖对环境盐度要求苛刻，人工养殖条件下的金钱鱼亲鱼雌雄性腺发育不同步，不能自然产卵，目前还没有可行的金钱鱼的人工繁殖方法。

技术实现要素：

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种金钱鱼的人工繁殖方法，通过生态模拟方式，将雌雄亲鱼分别培育，利用环境盐度变化辅以催产激素的刺激，促进雌雄亲鱼的性腺发育、成熟，获得高质量的雌雄配子进行人工受精和孵化，培育金钱鱼幼鱼。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

金钱鱼的人工繁殖方法，具体地，包括以下步骤：

(1)亲鱼驯养：选择长度为3-5cm的野生金钱鱼鱼苗在室外淡水池中养殖2-3年，然后挑选重量为600-800g的雌鱼50-150尾、重量为150-350g的雄鱼50-150尾作为亲鱼，转入室内溢流式圆形海水池中分开驯养，其中，所述驯养条件包括：所述溢流式圆形海水池内的盐度为10‰-20‰，优选为15‰；温度为27-29℃，优选为28℃；光照周期为14h光照、10h避光；驯养周期为4周；

(2)人工催熟：对步骤(1)中驯养后的亲鱼分两次注射催产激素，时间间隔为20-24h；其中，第一次所述催产激素的注射剂量为5-10μg/kg；第二次所述催产激素的注射剂量为5-20μg/kg；

(3)产卵与人工受精：经步骤(2)中人工催熟后的亲鱼进入发情期时，轻轻挤压所述亲鱼腹部排出雌、雄配子，将上述雌、雄配子用羽毛轻轻混匀，并用0.9％的生理盐水清洗；再用抗生素处理后，用网目为180μm、直径为1m的网筛转移到5m×3m的缸中轻微曝气，然后进行正常卵裂、胚胎发育；其中，所述缸内的水温为27-29℃、水流速度为3-5l/min；

(4)人工孵化与培养：将步骤(3)中人工受精后的胚胎在水温为26-30℃、盐度为15‰的缸中孵化，直至卵黄囊消失，得仔稚幼鱼；再在所述幼鱼达到5mm前投喂轮虫，长度为5-30mm时投喂卤虫，长度为30mm以上后投喂复合饵料，即得。

优选的，步骤(1)中，所述雌鱼驯养的溢流式圆形海水池内每天换水30％-50％。

优选的，步骤(1)中，所述溢流式海水池内的盐度为15‰、温度为28℃。

优选的，步骤(2)中，所述的催产激素为促黄体生成激素释放激素(lhrh-a2)。

优选的，步骤(2)中，所述第一次催产激素的注射剂量为5μg/kg，所述第二次催产激素的注射剂量为10μg/kg，且时间间隔为24h。

优选的，还包括人工催熟前对所述驯养的亲鱼进行激素检测。

更优选的，所述激素检测的具体过程为：对所述驯养的亲鱼尾部采血，加入5倍体积、ph7.4的磷酸盐缓冲液，在4℃、4000rpm离心10min，取上清，通过elisa法检测血浆中睾酮(t)与雌二醇(e2)激素水平。

优选的，步骤(3)中，所述抗生素为50iu/ml亲霉素与50μg/ml链霉素的混合物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明利用环境盐度刺激结合催产激素注射来诱导亲鱼性腺成熟，进行人工受精与孵化，培育金钱鱼鱼苗，填补了金钱鱼的人工繁殖技术的空白，旨在解决金钱鱼在人工养殖条件下不能自然产卵的问题，缓解了金钱鱼养殖业对于自然资源的过度依赖。

附图说明

图1为金钱鱼雌雄亲鱼在盐度驯化下血液中类固醇激素含量变化，其中，a-雄亲鱼，b-雌亲鱼；

图2为不同盐度下胚胎存活率；

图3为金钱鱼胚胎发育-卵裂期；

图4为金钱鱼胚胎发育-囊胚期；

图5为金钱鱼胚胎发育-原肠胚期；

图6为金钱鱼胚胎发育-分节期、咽囊期以及孵化期；

图7为孵化后45天的金钱鱼幼鱼，其中，a-投喂藻类，b-投喂颗粒饲料；

图8为金钱鱼人工繁殖的效果图；其中，a-金钱鱼，b-亲鱼人工催熟，c-金钱鱼配子收集。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

亲鱼来自于广东珠海的养殖基地，由捕自万山群岛的野生金钱鱼鱼苗(3-5cm)在淡水池(50m×30m)中经过3年养成(金钱鱼的首次性成熟在2-3龄)。金钱鱼的人工繁殖方法，包括以下步骤：

(1)亲鱼驯养：挑选重量为600-800g的雌鱼50-150尾、重量为150-350g的雄鱼50-150尾作为亲鱼，转入室内直径10m的溢流式圆形海水池中分开驯养，其中，所述驯养条件包括：所述溢流式圆形海水池内的盐度为10‰-20‰，温度为27-29℃，光照周期为14h光照、10h避光，驯养周期为4周，亲鱼池内每天换水30％-50％。

(2)人工催熟：对步骤(1)中驯养后的亲鱼分两次注射催产激素促黄体生成激素释放激素(lhrh-a2)，时间间隔为20-24h；其中，第一次所述催产激素的注射剂量为5-10μg/kg；第二次所述催产激素的注射剂量为5-20μg/kg。

(3)产卵与人工受精：经步骤(2)中人工催熟后的亲鱼进入发情期时，轻轻挤压所述亲鱼腹部排出雌、雄配子，将上述雌、雄配子用羽毛轻轻混匀，并用0.9％的生理盐水清洗；再用50iu/ml亲霉素与50μg/ml链霉素混合的抗生素处理后，用网目为180μm、直径为1m的网筛转移到5m×3m的缸中轻微曝气，观察胚胎发育情况；其中，所述缸内的水温为27-29℃、水流速度为3-5l/min。

(4)人工孵化与培养：将步骤(3)中人工受精后的胚胎在水温为26-30℃、盐度为25‰的缸中孵化，直至卵黄囊消失，得仔稚幼鱼；再在所述幼鱼达到5mm前投喂轮虫，长度为5-30mm时投喂卤虫，长度为30mm以上后投喂复合饵料，即得。

效果例1：在盐度驯化下雌雄亲鱼血液中类固醇激素含量变化

人工繁殖的盐度驯化过程中，每周对每条鱼进行尾部采血，同一性别三条鱼的血样形成一个混样。设置对照组(淡水)与实验组(15‰海水)各取五组样品，每管样品中加入5倍体积的磷酸盐缓冲液(ph7.4)，4℃，4000rpm离心10min，取上清，elisa法检测血浆中睾酮(t)与雌二醇(e2)激素水平，如附图1所示，血浆中t与e2的含量与盐度驯养时间密切相关。血浆t在未驯养的雄性亲鱼中含量较低(7.41±0.87ng/ml)，但经15‰海水驯养一周后，其含量达到9.72±1.53ng/ml。在驯养的四周内，雄性亲鱼血浆中t含量持续升高，四周后达到14.35±0.96ng/ml(图1a)。同样，雌性亲鱼血浆中的e2在经15‰海水驯养后显著提高(从开始的1.38±0.21ng/ml增加至1.73±0.11ng/ml)。驯养四周后，雌鱼血浆中的e2含量达到2.82±0.19ng/ml(图1b)。

效果例2：催产激素注射剂量对金钱鱼性腺人工催熟的影响

激素注射前两周，每天随机检测雌雄个体性腺成熟度，每次检测雌雄鱼各3条。利用取卵器收集卵子，精子通过轻压亲鱼腹部获得，在显微镜下进行镜检。将亲鱼分为五组，每组雌雄亲本各5条，其中四组为实验组，一组为对照组。以促黄体生成激素释放激素(lhrh-a2)作为催产激素，注射前利用ms-222(50mg/l)进行麻醉。从背鳍基部，对亲鱼进行肌肉注射。首次注射只对雌鱼进行，注射剂量为5μg/kg，20-24h小时后，对所有的亲本进行二次注射，注射剂量见表1，对照组注射相应剂量的生理盐水(0.9％nacl)。从表1中可以看出，第一次注射剂量为5μg/kg、第二次注射剂量为10μg/kg时，金钱鱼的受精率最高。

表1：金钱鱼性腺人工催熟时催产激素注射剂量

效果例3：不同盐度下胚胎存活率

当亲鱼到了发情期进行人工受精，通过轻轻挤压亲鱼腹部排出配子，对获得的卵子称重，与雄鱼精子进行混合，用羽毛轻轻混匀后经生理盐水(0.9％nacl)进行清洗，得受精卵。再用抗生素(50iu/ml亲霉素和50μg/ml链霉素)处理后的受精卵用网目180μm、直径1m的网筛转移到5m×3m的缸中，水温28.0±1.0℃，水流速3-5l/min，轻微曝气，显微镜下观察胚胎发育情况，如附图3-6所示，能进行正常卵裂视为受精成功，并进行计数。随机从第二次注射剂量为10μg/kg组的亲鱼产得的受精卵中选取100颗胚胎用于测试盐度(5‰、15‰、25‰、35‰和45‰)对胚胎发育的影响，计算卵裂期至孵化期的存活率，每小时检测一次，结果如附图2所示。在0到5h内，各个盐度下的胚胎均出现死亡，5h后死亡率降低，胚胎存活率趋于平稳。胚胎存活率最高的为25‰盐度驯养组的胚胎存活率最高，并且该组胚胎的孵化率达到92％。

人工受精后的胚胎在水温为26-30℃、盐度为25‰的缸中孵化，直至卵黄囊消失，得仔稚幼鱼；再在所述幼鱼达到5mm前投喂轮虫，长度为5-30mm时投喂卤虫，长度为30mm以上后投喂复合饵料，如附图7所示，通过上述方法人工繁殖的金钱鱼如附图8所示。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。