本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种防治菜青虫发酵剂的制备方法及其应用。
背景技术
菜青虫属鳞翅目粉蝶科，是蔬菜作物的常发性害虫，其成虫称菜粉蝶、菜白蝶或白粉蝶等，全国各省均有分布。菜青虫严重危害十字花科蔬菜，其中较喜好甘蓝、花椰菜、白菜、萝卜；也可危害莴苣、苋菜等其他植物。由于化学防治易造成菜青虫的抗药性，进一步加大菜青虫防治困难，严重影响蔬菜品质和产量，因此，具有杀虫功能的微生物植物次生代谢产物的研究已经备受关注。
青蒿是一种对鳞翅目昆虫生长发育具有显著抑制作用的植物，已经发现其次生代谢产物青蒿素是主要的活性成分之一。茵陈蒿常作为青蒿的代用品用于中药之中，也具有一定的杀虫效果。但传统的植物性杀虫剂多用有机溶剂或煎煮提取，但存在以下缺陷：1）不利于节能，也有较大的环境风险；2）影响活性物质的稳定性和遗失活性物质；3）增加成本，使得开发应用困难较大，作用效果缓慢，给植物源杀虫剂的研发和生产带来巨大经济困难。相比于传统提取方法，利用合适的植物促生菌发酵青蒿和茵陈蒿，不仅有利于生理活性物质的提取，还不易造成活性物质的失活，此外，促生菌本身还有较好的杀虫防病和促生作用，有利于改善植物生长和增强杀虫效果。
技术实现要素：
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种防治菜青虫发酵剂的制备方法及其应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种防治菜青虫发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
s1：选育发酵用菌种
a.配制富集培养液；
b.筛选芽孢杆菌；
c.驯化芽孢杆菌；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液；
b.配制茵陈蒿发酵培养液；
s3：分步发酵
a.一次发酵；
b.二次发酵；
s4：配制发酵剂母液。
一种防治菜青虫发酵剂的制备方法，包括以下具体步骤：
s1：选育发酵用菌种
a.配制富集培养液：按100g/l的料水比将青蒿粉、茵陈蒿粉依次溶解于蒸馏水中，灭菌备用；
b.筛选芽孢杆菌：在青蒿和茵陈蒿生长茂盛、环境条件好的区域，选取根际土壤，并在富集培养液中接种1-5%青蒿根际土壤和1-5%茵陈蒿根际土壤，富集培养3d后,分离出土壤微生物，并对其进行分子鉴定，筛选出解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，4℃下冷藏备用；
c.驯化芽孢杆菌：向富集培养液中加入1-5%蜂蜜，再接种1-5%所得芽孢杆菌，驯化培养9轮，制得发酵用菌种；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：按100-500g/l、10-50g/l的料水比将预处理青蒿和蜂蜜依次混入自来水中，打浆，灭菌备用；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：按100-500g/l、10-50g/l的料水比将预处理茵陈蒿和蜂蜜依次混入自来水中，打浆，灭菌备用；
s3：分步发酵
a.一次发酵：分别在青蒿发酵培养液和茵陈蒿发酵培养液中接种1-5%发酵用菌种，30℃下，厌氧发酵5-15d；
b.二次发酵：对一次发酵后的两种发酵液进行过滤，等体积混合后，加入1-5%蜂蜜，30℃下，厌氧发酵7d，制得发酵原液；
s4：配制发酵剂母液：按10-25g/l、0.1-10g/l的料液比向发酵原液中添加磷酸二氢钾、硼酸钠，搅拌均匀后，即得防治菜青虫发酵剂。
优选的是，所述青蒿或茵陈蒿的预处理过程：青蒿或茵陈蒿洗净后，置于0.9%食盐水中浸泡1-2min，再用自来水冲洗1次。
一种防治菜青虫发酵剂在十字花科、菊科、苋科或旋花科蔬菜病虫害防治技术中的应用。
优选的是，该应用方法：将防治菜青虫发酵剂的100-500倍稀释液喷施于蔬菜叶面上。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用青蒿和茵陈蒿根际土壤芽孢杆菌对青蒿和茵陈蒿进行发酵，避免传统有机溶剂萃取过程和高温高压煎煮过程中，活性物质的变性和热敏性物质的散失，有利于青蒿素、青蒿内酯、陈蒿素等成分的提取，提高微生物植物次生代谢产物含量，增强对鳞翅目类昆虫的防治作用；
（2）本发明利用芽孢杆菌发酵过程中产生丰富的酶系和有机酸，促进蔬菜中有害物质降解，提高食用安全性；
（3）本发明发酵用的芽孢杆菌属于职务促生菌，有利于合成植物生长调节物质、改善植物无机营养和促进植物生长发育；
（4）本发明生产的发酵剂可改善土壤微生物多样性，促进土壤农残的降解和土壤修复，无毒、无害，不产生抗药性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
s1：选育发酵用菌种
a.配制富集培养液：按100g/l的料水比将青蒿粉、茵陈蒿粉依次溶解于蒸馏水中，灭菌备用；
b.筛选芽孢杆菌：在青蒿和茵陈蒿生长茂盛、环境条件好的区域，选取根际土壤，并在富集培养液中接种1%青蒿根际土壤和1%茵陈蒿根际土壤，富集培养3d后,分离出土壤微生物，并对其进行分子鉴定，筛选出解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，4℃下冷藏备用；
c.驯化芽孢杆菌：向富集培养液中加入1%蜂蜜，再接种1%所得芽孢杆菌，驯化培养9轮，制得发酵用菌种；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：将青蒿洗净后，置于0.9%食盐水中浸泡1min，再用自来水冲洗1次，按100g/l、10g/l的料水比将预处理青蒿和蜂蜜依次混入自来水中，打浆，灭菌备用；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：将茵陈蒿洗净后，置于0.9%食盐水中浸泡1min，再用自来水冲洗1次，按100g/l、10g/l的料水比将预处理茵陈蒿和蜂蜜依次混入自来水中，打浆，灭菌备用；
s3：分步发酵
a.一次发酵：分别在青蒿发酵培养液和茵陈蒿发酵培养液中接种1%发酵用菌种，30℃下，厌氧发酵5d；
b.二次发酵：对一次发酵后的两种发酵液进行过滤，等体积混合后，加入1%蜂蜜，30℃下，厌氧发酵7d，制得发酵原液；
s4：配制发酵剂母液：按10g/l、0.1g/l的料液比向发酵原液中添加磷酸二氢钾、硼酸钠，搅拌均匀后，即得防治菜青虫发酵剂。
实施例2
制备方法同实施例1，区别在于：
s1：选育发酵用菌种
b.筛选芽孢杆菌：青蒿根际土壤和茵陈蒿根际土壤接种量均为1-5%；
c.驯化芽孢杆菌：蜂蜜添加量为2%，芽孢杆菌接种量为2%；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡1min青蒿与自来水的料水比为200g/l，蜂蜜与自来水的料水比为20g/l；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡1min，青蒿与自来水的料水比为200g/l，蜂蜜与自来水的料水比为20g/l；
s3：分步发酵
a.一次发酵：发酵用菌种接种量为2%，厌氧发酵8d；
b.二次发酵：蜂蜜添加量为2%；
s4：配制发酵剂母液：磷酸二氢钾与发酵原液的料液比为13g/l，硼酸钠与发酵原液的料液比为2.5g/l。
实施例3
制备方法同实施例1，区别在于：
s1：选育发酵用菌种
b.筛选芽孢杆菌：青蒿根际土壤和茵陈蒿根际土壤接种量均为1-5%；
c.驯化芽孢杆菌：蜂蜜添加量为3%，芽孢杆菌接种量为3%；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min，青蒿与自来水的料水比为300g/l，蜂蜜与自来水的料水比为30g/l；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min青蒿与自来水的料水比为300g/l，蜂蜜与自来水的料水比为30g/l；
s3：分步发酵
a.一次发酵：发酵用菌种接种量为3%，厌氧发酵11d；
b.二次发酵：蜂蜜添加量为3%；
s4：配制发酵剂母液：磷酸二氢钾与发酵原液的料液比为17g/l，硼酸钠与发酵原液的料液比为5g/l。
实施例4
制备方法同实施例1，区别在于：
s1：选育发酵用菌种
b.筛选芽孢杆菌：青蒿根际土壤和茵陈蒿根际土壤接种量均为4%；
c.驯化芽孢杆菌：蜂蜜添加量为4%，芽孢杆菌接种量为4%；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min，青蒿与自来水的料水比为400g/l，蜂蜜与自来水的料水比为40g/l；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min，青蒿与自来水的料水比为400g/l，蜂蜜与自来水的料水比为40g/l；
s3：分步发酵
a.一次发酵：发酵用菌种接种量为4%，厌氧发酵13d；
b.二次发酵：蜂蜜添加量为4%；
s4：配制发酵剂母液：磷酸二氢钾与发酵原液的料液比为21g/l，硼酸钠与发酵原液的料液比为7.5g/l。
实施例5
制备方法同实施例1，区别在于：
s1：选育发酵用菌种
b.筛选芽孢杆菌：青蒿根际土壤和茵陈蒿根际土壤接种量均为5%；
c.驯化芽孢杆菌：蜂蜜添加量为5%，芽孢杆菌接种量为5%；
s2：配制发酵培养液
a.配制青蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min青蒿与自来水的料水比为100-500g/l，蜂蜜与自来水的料水比为10-50g/l；
b.配制茵陈蒿发酵培养液：0.9%食盐水浸泡2min，青蒿与自来水的料水比为500g/l，蜂蜜与自来水的料水比为50g/l；
s3：分步发酵
a.一次发酵：发酵用菌种接种量为5%，厌氧发酵15d；
b.二次发酵：蜂蜜添加量为5%；
s4：配制发酵剂母液：磷酸二氢钾与发酵原液的料液比为25g/l，硼酸钠与发酵原液的料液比为10g/l。
分别对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5进行100、300、500倍稀释，喷雾到正在发生菜青虫的小白菜叶面上。
施药当天调查活虫数，施药后7天调查活虫数，并计算虫口减退率及校正防效。
计算公式：
虫口减退率(100%)=[(药前虫口基数-药后活虫数)/药前虫口基数]×100%；
校正防效(100%)=[(防治区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(1-空白对照区虫口减退率)]×100%。(本试验中空白对照区虫口减退率为-15.8%)
下表为各实施例的药效试验结果：
由上表可知，施用本发明方法制备的发酵剂的100-500倍稀释液可有效防治蔬菜菜青虫，且随着稀释倍数的递增，虫口减退率和防效呈现递减现象，其虫口减退率为81.8-97.2%，防效为82.4-97.6%，且
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。