对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及对西花蓟马进行rna干扰的方法及装置。
背景技术：
rna干扰(rnainterference,rnai)是由外源导入到细胞当中的双链rna引发的特定基因转录后的沉默现象(andrewfire.1998),是近年来分子生物学领域的一项重大发现。最早由guo等(1995)利用反义rna技术研究秀丽新小杆线虫(caenorhabditiselegans)的par1基因功能时，发现了基因沉默现象，在此之后fire等(1998)详细阐述了造成这种现象的原因是在制备正义/反义rna时混入了少量的双链rna(dsrna)引起的，并将此现象称为rna干扰。昆虫的rnai干扰方法，目前报道的有注射、浸泡、饲喂、转基因和病毒介导等，这些干扰方法各有优缺点，根据不同种昆虫选择合适的dsrna导入方法是成功实现昆虫rnai的关键。例如dzitoyeva(2001)将体外合成的微量的长dsrna显微注射到昆虫果蝇体腔内成功导致lacz基因和nrf基因mrna含量降低，但是步骤较为繁琐，而且注射压力以及由于注射造成的伤口不可避免地影响到昆虫正常的生理活动，而且采取此种方法会导致受试昆虫死亡率升高。eaton等(2002)发现将果蝇胚胎浸泡在dsrna溶液中，可以有效抑制基因的表达，但是只适用于那些容易从溶液中吸收dsrna的特殊昆虫细胞组织和特定发育阶段的昆虫。使用转基因技术对昆虫进行rnai首先被应用于果蝇上(kennerdellandcarthew,2000)，其后又被广泛应用于埃及伊蚊和家蚕的基因功能研究中(travantyetal,.2004；sandrellietal,.2007)，但是这种方法会得到转基因昆虫，而且转基因方法试验周期较长，过程较繁琐饲喂dsrna是一种自然输入方式，对昆虫造成的侵害较小，不影响其他基因的表达。目前已在半翅目、鞘翅目和鳞翅目多种昆虫中取得成功(baumetal,.2007；maoetal,.2007)。西花蓟马frankliniellaoccidentalis(pergande)属缨翅目thysanoptera，蓟马科thripidae。关于西花蓟马的功能基因的研究仍然处于起步阶段，rotenberg等(2015)采用注射的方法将体外合成的v-atpase-bdsrna注射到西花蓟马雌虫体内，显著降低了其相关蛋白的含量，但是西花蓟马虫体小，对其损伤很大，效率很低，而且注射方法的操作性较差。为了研究西花蓟马相关基因功能，有必要探索如何对其进行可行高效的基因沉默。技术实现要素：本发明建立了一种高效可行的西花蓟马rna干扰方法。采用以下技术方案：一种对西花蓟马进行rna干扰的方法，其特征在于包括如下步骤：以花粉为人工饲料，将根据靶标干扰基因的序列设计和合成的dsrna混入花粉溶液中作为饲喂液饲养西花蓟马试虫；在具有以下结构特点的rnai管中进行所述饲养：所述rnai管包含顶部开口的管体，与顶部开口配合的可开合管盖，所述管体上设置200-230目的网眼结构的若干透气孔，所述管盖上设置有直径为0.3-0.7cm的加样孔；饲养步骤如下：(1)取西花蓟马成虫置于所述rnai管中，然后用拉薄的封口膜覆盖所述顶部开口，盖上管盖；(2)从所述加样孔将所述饲喂液加到所述拉薄的封口膜上，然后采用封口膜封闭所述加样孔；(3)对所述rnai管下部进行遮光饲养，近顶部开口部位保持透光；西花蓟马由于趋光性爬向顶部开口处，通过其锉吸式口器，刺过封口膜吸取所述饲喂液。所述rnai管为5ml离心管，在距底部1cm处平整切掉底部，用具有200-230目网眼的纱网封底作为所述若干透气孔，在管盖上钻孔形成所述加样孔制成。所述饲喂液中dsrna的终浓度为400-500ng/μl，花粉浓度为重量体积百分比8-15％。所述饲喂液的加样量为200ul，持续饲养时间为12-36小时。饲养温度为25℃。所述dsrna是基于西花蓟马65852基因设计的dsrna1，dsrna2或dsrna3，所述dsrna1的特异性片段序列为seqidno.1，所述dsrna2的特异性片段序列为seqidno.2，所述dsrna3的特异性片段序列为seqidno.3。所述rnai管包含顶部开口的管体，与顶部开口配合的可开合管盖，所述管体上设置网眼结构的若干透气孔，所述管盖上设置有加样孔。所述网眼结构为200-230目。所述加样孔直径为0.3-0.7cm。所述rnai管为5ml离心管，在距底部1cm处平整切掉底部，用具有200-230目网眼的纱网封底作为所述若干透气孔，在管盖上钻孔形成所述加样孔而制成。本发明的贡献在于，建立了基于饲喂方式的西花蓟马rna干扰方法。现有技术中，西花蓟马的人工饲养饲料通常采用芸豆豆荚、甜椒等植物材料作为西花蓟马人工饲养的饲料和寄主(如cn102640729b中[0003]段记载)，或者采用人工培养的嫩苗作为人工饲养的饲料和寄主。现有人工饲养方式和人工饲料不适合饲喂方式进行西花蓟马rna干扰。虽然饲喂方式进行rna干扰在其它昆虫中成功实现，但是由于未找到适合于进行rna干扰的西花蓟马人工饲料，以及人工饲喂方式，因此，本领域技术在通过rna干扰/基因沉默的方式研究西花蓟马功能基因方面鲜有进展。本发明地采用花粉作为西花蓟马的人工饲料，设计了特殊结构的rna干扰装置，满足西花蓟马的生物习性和营养需求，不影响其存活率，并利用其生物习性和身体特点，饲喂特定浓度比例的混合花粉和dsrna的饲喂液，实验数据显示，选取的3条dsrna干扰效率依次达到64％，76％和80％,说明本发明的方法有效解决了较小虫体进行注射法进行rna干扰死亡率高的问题，同时合成的dsrna能够有效对西花蓟马进行rna干扰，为今后进一步克服西花蓟马的虫害的工作打下了基础。附图说明图1对西花蓟马进行rna干扰的装置示意图图2西花蓟马取食饲喂液后不同时间段内65852基因相对表达量1-管体，2-网眼结构，3-管盖，4-封口膜，5-加样孔。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不意味着限制，仅作为示例说明。实验生物材料及试剂：西花蓟马：多杀菌素抗性品系(spin-r),申请人单位有保存和饲养，声明自申请日起20年可向公众发放用于验证实验。.油菜花花粉：购自中国农业科学院南门蜂蜜店；primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit，购自takara公司；promegadsrna合成试剂盒，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；fastfireqpcrpremix(sybrgreen)，购自天根生化科技(北京)有限公司。一、西花蓟马65852基因的生物信息学分析首先在西花蓟马转录组注释文件中发现在ivf03(敏感)和nil-r(近等基因系抗性)种群中表达量差异较大的基因id5302，然后将该序列在unigene库中进行本地blast找到cds序列，该cds序列名为comp65852_c0，该cds序列为seqidno.4，利用该序列设计特异性引物进行克隆测序。二、合成dsrna的过程1、引物设计通过果蝇基因中的sirna结合位点网站http://www.flyrnai.org/cgi-bin/rnai_find_primers.pl设计西花蓟马65852基因(西花蓟马65852基因的测序结果见seqidno.5)的dsrna引物，具体合成步骤如下：(1)将比对后的测序结果复制到在orffinder中预测orf区域，并将该orf区域输入到http://www.flyrnai.org/cgi-bin/rnai_find_primers.pl网站中，选择产物长度在300-600bp之间，点击finderprimersforthesesequences筛选出pairpenalty较低的三对引物。(2)分别在三对引物的上下游引物的5’端添加t7启动子序列-taatacgactataggg-，分别将三对引物命名为ds1、ds2、ds3，如下表所示。表1实验所用dsrna1，dsrna2和dsrna3的引物2、cdna合成，所用试剂盒为primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit(takara公司)，具体合成过程如下：(1)在microtube中配制由以下组分组成的混合液，见表2；表2混合液组分表试剂用量oligodtprimer(50um)1μldntpmixture(10nm)1μl西花蓟马rna1μgrnasefreeddh2oupto10μl(2)将上述混合液在65℃反应5min，然后置于4℃；(3)在上述microtube管中配置由以下组分组成的反转录反应液，总量为20μl，见表3；表3反转录反应液组分表(4)将上述反转录反应液缓慢混匀；(5)在42℃温育1h，然后在70℃温育15min；(6)反应完成后，-20℃保存以备后续实验使用。3、pcr扩增体系与程序以西花蓟马cdna为模板，在如下反应体系和反应程序下分别扩增表1中三对引物，即ds1、ds2、ds3，反应体系见表4，反应程序见表5。表4pcr扩增反应体系表5pcr扩增反应程序反应完成后，回收与目的条带大小一致的片段，进行测序验证序列，准确无误后应用promegadsrna合成试剂盒t7ribomaxexpressrnaisystem进行dsrna合成。4、dsrna合成dsrna合成步骤为：(1)使用干净的rna专用pcr管，加入ribomaxtmexpresst72xbuffer10.0μl；lineardnatemplate1.0μg(依据dna浓度换算需要加入的体积)；enzymemix，t7express2.0μl；nuclease-freewater补充到20.0μl；37℃温育30分钟(温育时间可以延长2-6个小时，有利于增加产量)，70℃10分钟，然后室温放置20分钟，缓慢冷却形成dsrna。(2)dna和单链rna消除：加入1/200的rnase(用rnasenuclease-freewater稀释两百倍)和1.0μlrq1rnase-freednase，37℃温育30分钟，以除去反应体系中的模板dna和单链rna。(3)dsrna纯化：每管加入0.1倍体积的3msodiumacetate(ph5.2)和1倍体积的异丙醇，缓慢混匀后冰上放置5分钟，可以观察到管内出现絮状物沉淀，然后4℃15000rpm离心15分钟，然后加入0.5ml70％的乙醇进行漂洗，8000rpm离心5分钟，然后室温晾干大约15分钟，加入适量的ddh2o，存储在-20℃(-80℃长期保存)。通过上述方法合成dsrna1(sequenceidno.1)，dsrna2(sequenceidno.2)和dsrna3(sequenceidno.2)。三、对西花蓟马进行rna干扰的装置由图1所示，对西花蓟马进行rna干扰的rnai管，包含透明的管体1，纱网，与管体管口尺寸匹配的管盖3和拉薄的parafilm封口膜4；管体是5ml离心管截去底部1cm所得，酒精灯微烤切口边缘使其呈现微熔状态后迅速与200～230目纱网充分粘附用以保持其良好透气效果；管盖3是离心管的盖，管盖3设置有加样孔5，用于用注射器通过加样孔5加入饲料，加样孔5直径为0.3～0.7cm；拉薄的parafilm封口膜4封住管状机构的另一侧开口，将盖3盖在封有封口膜的开口外。加完饲料后加样孔5由封口膜封住。四、对西花蓟马进行rna干扰的方法郅军锐等(2006)的研究结果发现寄主植物花粉可以普遍增加西花蓟马的繁殖力，在本实验最初的研究中发现花粉溶液可以维持西花蓟马的生理活动，所以在本实验中将花粉溶液和dsrna混合制成饲喂液。将西花蓟马分成五组，每组25头，其中三组分别饲喂混有dsrna1，dsrna2，dsrna3的饲料，其余两组分别饲喂饲料和egfp(400-500ng/ul)作为对照组。(1)饲料的准备称取一定量的油菜花花粉溶于ddh2o中配制成质量份数为10％的花粉溶液作为饲料，然后用花粉溶液将体外合成的dsrna稀释到500ng/ul配成饲喂液；(2)西花蓟马的饲喂将25头西花蓟马装入事先清洗消毒干燥的rnai管，取200μl饲喂液通过加样孔中加到封口膜上，不刺穿封口膜，完毕后再用parafilm封口膜将加样孔封闭，一方面可以避免饲喂液损失，另一方面可以避免饲喂液被杂菌污染，最后将装有虫体和饲喂液的离心管置于管架上，离心管下部用黑色塑料袋遮住，仅留顶部透光，最后把整个装置放在25℃培养箱中，并分别在饲喂后12h、18h、24h、48h、72h取样检测该基因表达水平。(3)检测基因表达水平的方法将(2)中收取的实验组和对照组样本西花蓟马分别提取rna，并将模板rna定量在1ug进行反转录，然后使用试剂盒fastfireqpcrpremix(sybrgreen)进行定量分析，加样体系见表6，将表6中的试剂混匀后在quantstudio3中，按照表7的反应程序进行反应。表6检测基因表达水平的加样体系表7检测基因表达水平的反应程序反应结束后将定量结果输出到excel中进行计算。结果与分析：如图2所示，在不同时间段内饲喂egfp和花粉溶液(ck)65852基因相对表达量差异不显著。除饲喂dsrna1饲喂液外，饲喂含dsrna2和dsrna3饲喂液的西花蓟马65852基因在12h-24h时间段内其相对表达量均有不同程度的降低，但在24h时效果最好3条dsrna干扰效果稳定，干扰效率依次达到64％，76％和80％，存活率都为100％。sequencelisting<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>对西花蓟马进行rna干扰的方法及装置<130>p180512-sch<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>316<212>dna<213>artificialsequence<220><223>dsrna1的特异性片段序列<400>1taatacgactcactatagggcaggatgttttggtgtcacgcgacgaaagcactcaacggg60aaattcttgtggaacctctttgcgaccgagatggacggccggtgacagatgctgtggcag120ccgagcgtcggatgaagagagacaaatggcgtctgggcgttaacccagctcatccgggca180gtagtggaaaccgcacttgtgttagcagcacaatgcctaacctgcgtcgtgctgactggg240tgctgtttgattcggcggcaggcaaggaggcgctctccaaggtgttcaaagaagccccct300atagtgagtcgtatta316<210>2<211>322<212>dna<213>artificialsequence<220><223>dsrna2的特异性片段序列<400>2taatacgactcactatagggcctggacaggatgttttggtgtcacgcgacgaaagcactc60aacgggaaattcttgtggaacctctttgcgaccgagatggacggccggtgacagatgctg120tggcagccgagcgtcggatgaagagagacaaatggcgtctgggcgttaacccagctcatc180cgggcagtagtggaaaccgcacttgtgttagcagcacaatgcctaacctgcgtcgtgctg240actgggtgctgtttgattcggcggcaggcaaggaggcgctctccaaggtgttcaaagaag300ccccctatagtgagtcgtatta322<210>3<211>321<212>dna<213>artificialsequence<220><223>dsrna3的特异性片段序列<400>3taatacgactcactatagggggcttctttgaacaccttggagagcgcctccttgcctgcc60gccgaatcaaacagcacccagtcagcacgacgcaggttaggcattgtgctgctaacacaa120gtgcggtttccactactgcccggatgagctgggttaacgcccagacgccatttgtctctc180ttcatccgacgctcggctgccacagcatctgtcaccggccgtccatctcggtcgcaaaga240ggttccacaagaatttcccgttgagtgctttcgtcgcgtgacaccaaaacatcctgtcca300gccctatagtgagtcgtatta321<210>4<211>1487<212>dna<213>artificialsequence<220><223>comp65852_c0<400>4ctcgtgtttaagtatgacgaaagttacagattatcataaaaaaaaataccaccagataac60acatgtatcatctttgggtagtgcaaatgcgatgaaggcctacagagaaacctttagata120accaggatcattgagagcattcagtgcagcagaaaacaattttaattagagttgtattta180caattctacaaaatgctaaaaactaaagacgcacgctcttacaacaacaaaatagatttt240tcttaggcagatggaggcctttcaccaagaacaaaaacgtcaaactgaagagaccagttt300cctaggttcgagtgtatgtggtactttgcactccgagatgaaggaggggccaatttcttt360cccggcctgatgcgacccactgtcagtacggtaggatcgcaggcgatggtcgaaccaaca420actgggataggggcggcacccacagggcaggcgtcgcccaactccggcaaagtcgagcgt480gactccttggcctgcacactaccgtcccctggagcactgtcactgtggtcctcttctggg540ccgcagccgccaccgcgcagccgatatacgagatgcaacttggaccctggtacaatgttg600tagtcggatagagttctgccgtcctcgagctgctttccggcgtaaatgagacgctgttga660tctattggaacgccatcctcgtcctgaatgatgtctttaaccgtctcaatgggagacgac720cgctcacagaaaatttgaagagtttgtcccgtcagcgttttgatgaaatagccttcagcc780aagaccagctgcagctgcttagccatggcttcttcagacaccttggagagcgccttctgg840cctgccgccaaatcaaacagcacccactcagcaggacgcaagttgggcattctgctgcta900acacaagtgcggttaccaccactgcccggatgagctgggttaacgccaagacgccatttg960tctctcttcatgcgacgctcggctgccacagcatctgtcaccggccggccatctcggtcg1020caaagaggttccacaagaatttcccgttgagtgctttcgtcgcgtgacaccaaaacatcc1080tgtccaggtttgatgaggctaataagattgacccctttaatgcggtcggccgtcaggtcc1140gcccatgagtcgtcgacgcccatctccgctcgctgcagccggaaacttagcgccggtctc1200accgctgcgttttgcatcctaaagctcaggcagccggccttggtcgccacgaacctgagg1260ttcgacaaaccggtggacgggtctgtcgtggagacggcgctaaggggagcgccgtcacag1320agcacctggaggcccataagcggcactccgtccgtcgttaccagcacggccaagctttga1380ggagtatcttccatttccgcgtcggattcctcgctcgcacggcggtaacggcgggtgctt1440cacagtcggcgctgatgatgagggtagcagaacagagcgcgggctgc1487<210>5<211>1487<212>dna<213>artificialsequence<220><223>西花蓟马65852基因的测序结果<400>5ctcgtgtttaagtatgacgaaagttacagattatcatagaaaataaaataccaccagata60acacatgtatcatctttgggtagtgcaagtgcgatgaaggcctacagagaaaccctcaga120taaccaggatcattgagagcattcagtgcagcagaaaacaattttaattagagttgtatt180tacaattctacaaaatgctaaaaactaaagacgcacgctcttacaacaacaaaatagatt240tttcttaggcagatggaggcctttcaccaagaacaaaaacgtcaaactgaagagaccagt300ttcctaggttcgagtgtatgtggtactttgcactccgagatgaaggaggggccaatttct360ttcccggcctgatgcgacccactgtcagtacggtaggatcgcaggcgatggtcgaaccaa420caactgggataggggcggcacccacagggcaggcgtcgcccaactccggcaaagtcgagc480gcgactccttggcctgctcactatcgtccccttgagcactgccactgttgtcctctattg540gggcgcagccaccaccgcgcagccgacgcacaacatgcagcgtggaccctggtacaatgt600ggtagtcgaaaagcgttttgccgtcctcgagctggcgtccggagtaaatgagacgctggt660catcgattggagtgccctcctggtcctgaattatgtccttaaccgtctcaattgtagacg720accgctcacagaaaatttgaagagtttgtcccgtcagcgttttgatgaaatagccttcag780ccaagaccagctgcagctgcttagccatggcttcttcagacaccttggagagcgccttct840ggcctgccgccaaatcaaacagcacccactcagcaggacgcaagttgggcattctgctgc900taacacaagtgcggttaccaccactgcccggatgagctgggttaacgccaagacgccatt960tgtctctcttcatgcgacgctcggctgccacagcatctgtcaccggccggccatctcggt1020cgcaaagaggttccacaagaatttcccgttgagtgctttcgtcgcgtgacaccaaaacat1080cctgtccaggtttgatgaggctaataagattgacccctttaatgcggtcggccgtcaggt1140ccgcccatgagtcgtcgacgcccatctccgctcgctgcagccggaaacttagcgccggtc1200tcaccgctgcgttttgcatcctaaagctcaggcagccggccttggtcgccacgaacctga1260ggttcgacaaaccggtgg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