一种金线莲组织培养快速繁殖的方法与流程

本发明涉及一种金线莲(anoectochilusroxburghii)组培快繁的方法，属于生物技术植物组织培养领域。

背景技术

金线莲，又称金线兰、金丝草，兰科开唇兰属植物，属多年生珍稀中草药植物。在民间具有广泛的药用价值，素有“药王”、“神草”等美称，主要分布在我国的福建、台湾、广西、广东等地，具有清热解毒、祛风利湿、滋阴润肺及降血压等功效，还可用于煲汤、茶饮中作为保健品食用。由于金线莲药用价值极高而且经济效益十分好，所以近年来金线莲的野生资源被疯狂采挖，资源日渐枯竭，而且金线莲种子自然萌发率和繁殖率极低，生长缓慢，所以急需利用生物技术组织培养对金线莲进行快速繁殖，保护濒危野生资源。目前，金线莲组培多以蒴果、茎段作为外植体，但在组培过程中，对于外植体的消毒效果不理想，污染率很高，而且蒴果种子发芽率很低，生长周期很长，并没有达到快速繁殖的目的。本发明以茎段为外植体，改良了消毒技术及培养基配方，做到培养过程零污染，有效快速地提高了金线莲种苗的繁殖速度和质量，可实现金线莲优质种苗的工厂化育苗，满足生产上的需要。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种金线莲组织培养快速繁殖的方法。

本发明采用如下技术方案：

一种金线莲组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜金线莲去叶的茎浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1200～1500质量倍水稀释液中6～8小时，取出，用自来水冲洗干净；置于超净工作台，切茎段，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡消毒30～40s，取出，无菌水冲洗，再置于质量浓度0.1％的氯化汞水溶液中浸泡10～12min，取出，置于无菌水中，并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为80～100rpm，温度为24～26℃，摇动10-20min，再用无菌水冲洗4-6次；

(2)将步骤(1)获得的外植体接种到诱导培养基，在24～26℃，光照强度500-1000lux，光照时间10h/d，培养，诱导出小苗；

(3)将步骤(2)获得的小苗接种到增殖培养基，在24～26℃，光照强度500-1000lux，光照时间12h/d，培养，得到长出2-3片叶子的金线莲小植株；

(4)将步骤(3)获得的小植株切分成单株，接种到生根培养基，在24～26℃，光照强度1000-2000lux，光照时间12h/d，培养，得到健壮成苗。

诱导培养基的配方为：在ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入6-苄氨基腺嘌呤，使终浓度为3mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为6g/l，ph＝5.8。

增殖培养基的配方为：在ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入6-苄氨基腺嘌呤，使终浓度为3mg/l，加入激动素，使终浓度为1mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为6g/l，ph＝5.8。

生根培养基的配方为：在1/2ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为1mg/l，加入吲哚丁酸，使终浓度为1mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为4g/l，加入活性炭，使终浓度为5g/l，加入香蕉，使终浓度为50g/l，ph＝5.8。

本发明的优点：

实验证明，本发明的方法，使组织培养过程达到零污染，解决了现有组培技术中污染问题，并极大降低了现有技术中金线莲组培过程的根腐问题；本组培培养基配方可使诱导率和生根率达100％，增殖率可达4～6倍，繁殖周期三个月左右。成苗健壮，大大缩短了培养周期，提高了金线莲的产量及质量。

附图说明

图1为实施例1的步骤(1)获得的外植体接种到诱导培养基的照片。

图2为金线莲接种到诱导培养基35天生长情况。

图3为金线莲转移到增殖培养基26天生长情况。

图4为金线莲转移至生根培养基33天生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种金线莲组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜金线莲去叶的茎浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1300质量倍水稀释液中7小时，取出，用自来水冲洗干净；置于超净工作台，切茎段，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡消毒35s，取出，无菌水冲洗，再置于质量浓度0.1％的氯化汞水溶液中浸泡11min，取出，置于无菌水中，并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为90rpm，温度为25℃，摇动15min，再用无菌水冲洗5次；

(2)将步骤(1)获得的外植体接种到诱导培养基(图1)，在25℃，光照强度800lux，光照时间10h/d，培养(35天)，诱导出小苗(图2)；

(3)将步骤(2)获得的小苗接种到增殖培养基，在25℃，光照强度800lux，光照时间12h/d，培养(26天)，得到长出2-3片叶子的金线莲小植株(图3)；

(4)将步骤(3)获得的小植株切分成单株，接种到生根培养基，在25℃，光照强度1500lux，光照时间12h/d，培养(33天)，得到健壮成苗(见图4)。

本实施例，污染率为0，褐化率为10％；同时，金线莲的诱导率和生根率达到100％，增殖率达4倍，培养周期为94天。

实施例2

一种金线莲组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜金线莲去叶的茎浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1200质量倍水稀释液中8小时，取出，用自来水冲洗干净；置于超净工作台，切茎段，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡消毒30s，取出，无菌水冲洗，再置于质量浓度0.1％的氯化汞水溶液中浸泡10min，取出，置于无菌水中，并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为80rpm，温度为24℃，摇动20min，再用无菌水冲洗4次；

(2)将步骤(1)获得的外植体接种到诱导培养基，在24℃，光照强度500lux，光照时间10h/d，培养(40天)，诱导出小苗；

(3)将步骤(2)获得的小苗接种到增殖培养基，在24℃，光照强度500lux，光照时间12h/d，培养(27天)，得到长出2-3片叶子的金线莲小植株；

(4)将步骤(3)获得的小植株切分成单株，接种到生根培养基，在24℃，光照强度1000lux，光照时间12h/d，培养(40天)，得到健壮成苗。

本实施例，污染率为0，褐化率为13％；同时金线莲的诱导率和生根率均达100％，增殖率达5倍，培养周期为107天。

实施例3

一种金线莲组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜金线莲去叶的茎浸泡在多菌灵50％可湿性粉剂的1500质量倍水稀释液中6小时，取出，用自来水冲洗干净；置于超净工作台，切茎段，用体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡消毒40s，取出，无菌水冲洗，再置于质量浓度0.1％的氯化汞水溶液中浸泡12min，取出，置于无菌水中，并放到恒温摇床内，恒温摇床的转速为100rpm，温度为26℃，摇动10min，再用无菌水冲洗6次；

(2)将步骤(1)获得的外植体接种到诱导培养基，在26℃，光照强度1000lux，光照时间10h/d，培养(30天)，诱导出小苗；

(3)将步骤(2)获得的小苗接种到增殖培养基，在26℃，光照强度1000lux，光照时间12h/d，培养(25天)，得到长出2-3片叶子的金线莲小植株；

(4)将步骤(3)获得的小植株切分成单株，接种到生根培养基，在26℃，光照强度2000lux，光照时间12h/d，培养(30天)，得到健壮成苗。

本实施例，污染率为0，褐化率降低到最低，仅为5％；同时金线莲的诱导率和生根率达100％，增殖率达6倍，培养周期仅为85天。

各实施例采用的诱导培养基的配方为：在ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入6-苄氨基腺嘌呤，使终浓度为3mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为6g/l，ph＝5.8。

各实施例采用的增殖培养基的配方为：在ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为0.5mg/l，加入6-苄氨基腺嘌呤，使终浓度为3mg/l，加入激动素，使终浓度为1mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂，使终浓度为6g/l，ph＝5.8。

各实施例采用的生根培养基的配方为：在1/2ms培养基中加入萘乙酸，使终浓度为1mg/l，加入吲哚丁酸，使终浓度为1mg/l，加入蔗糖，使终浓度为30g/l，加入琼脂使终浓度为4g/l，加入活性炭，使终浓度为5g/l，加入香蕉，使终浓度为50g/l，ph＝5.8。