本发明属于生物技术领域，具体涉及一种标准化离体培养除虫菊种苗的方法。
背景技术：
除虫菊(tanacetumcinerariifolium)是菊科多年生草本植物，又名白花除虫菊。除虫菊是一种较好的生物农药的原料植物，在云南的种植面积约10万亩，占有世界产量的30％。从其花中能够提取出除虫菊酯，除虫菊酯具有诸多优点，如能迅速将蚊、蝇、蚤、虱等害虫麻痹与击倒；高温强光下容易自然分解；对人类，牲畜等无任何毒副作用；对环境也无污染；对害虫使用不易产生抗性。此外，除虫菊花朵可入药，外用皮肤可治挤癣，并且除虫菊的花朵丰富美丽，其观赏价值的开发潜力巨大，可用来布置花坛、花境，还可以用作鲜切花。
目前种植的除虫菊品种因长年自行留种，使其退化严重，混杂率增加，品质严重下降，利用标准化离体保存复壮技术可从源头把住生产第一关，实现除虫菊的标准化生产。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种标准化离体培养除虫菊种苗的方法，该方法包括以下步骤：
(1)外植体取材及灭菌：选取除虫菊优良品种尚未张开的花蕾和种子作为外植体材料，所选取的外植体材料要求健壮、无病、无虫害；将所选取的外植体材料依次按下述方法消毒灭菌：用3％w/w洗衣粉水清洗干净并放到自来水下流水冲洗10-20min，用70％v/v酒精对外植体材料消毒30s，自来水下流水冲洗10-20min，外植体材料放置在0.1％w/w升汞溶液中浸泡消毒10～15分钟，在浸泡消毒过程中不断地搅拌和振荡，将外植体材料从升汞溶液中取出，再用15％w/w的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，在浸泡过程中不断地搅拌和振荡，浸泡完成以后，将外植体材料从次氯酸钠溶液中取出，用无菌水冲洗外植体材料，冲洗次数为3-5遍，冲洗好的外植体材料接种备用；
(2)丛生芽诱导：将冲洗好的外植体材料放到超净工作台中，用接种刀切下外植体褐化的部分，花蕾外植体和种子外植体按如下方式进行丛生芽诱导：
将花蕾外植体接种到花蕾专用诱导培养基上，培养20-30天，得到除虫菊丛生苗，所述花蕾专用诱导培养基为：ms+6-ba2.0mg/l+tdz0.5mg/l+iba0.2mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6，培养条件：温度25℃±1℃，光照强度1000-2000lx，光照时间14h/d；
将种子外植体接种到种子专用诱导培养基上，先暗培养7天后再转入光照培养条件下培养15-30d，得到除虫菊丛生苗，光照培养条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000-2000lx，光照时间14h/d，所述种子专用诱导培养基为：ms+ga1.0mg/l+tdz0.1mg/l+iaa0.1mg/l+agno31.0mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6；
(3)无菌苗增殖：把步骤(2)花蕾外植体和种子外植体经诱导得到的除虫菊丛生苗转接到无菌苗增殖培养基，在温光条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000～2000lx，光照时间12h/d，培养20-25天，得到分化扩繁的除虫菊丛生苗，重复此无菌苗增殖过程以后，扩繁得到目标数量的除虫菊丛生苗；所述无菌苗增殖培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+tdz0.1mg/l+iba0.1mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6；
(4)生根培养：将步骤(4)增殖扩繁得到的除虫菊丛生苗用接种刀切成单株苗，将切成的单株苗转接到除虫菊生根培养基，在温光条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000～2000lx，光照时间12h/d，培养15～20天，得到除虫菊生根苗；所述除虫菊生根培养基为：ms+iaa0.1mg/l+iba0.1mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6；
(5)炼苗：将除虫菊生根苗从培养瓶中取出，洗去除虫菊生根苗根部的培养基，将洗掉培养基的除虫菊生根苗移至草炭：珍珠岩＝6:1的体积比混合基质中进行炼苗，待除虫菊生根苗长至20-30cm后，将除虫菊生根苗移栽到大田。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
将除虫菊种苗离体培养的方法标准化，从诱导、增殖、生根等各步骤均可进行标准化、精准操作，建立和实现了除虫菊的标准化生产，适宜工厂化生产。采用该方法得到的种苗能够保持除虫菊母本的优良性状，为除虫菊种植提供优良种源，从而增强了我国除虫菊在国际市场上的核心竞争力，提高了产品整体质量水平，促进了产业的提质增效与出口创汇。
本发明方法，扩大了除虫菊离体繁殖的外植体材料，可以随时为栽培除虫菊的客户提供种苗，不受外植体取材时间的限制，繁殖速度快，每次分化扩繁的速度可达4-5倍、成活率高，解决了除虫菊种子育苗效率低的问题，对推进除虫菊种苗生产具有重要的实践意义和应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作详细的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例
(1)外植体取材及灭菌：选取除虫菊优良品种尚未张开的花蕾和种子作为外植体材料，所选取的外植体材料要求健壮、无病、无虫害；将所选取的外植体材料依次按下述方法消毒灭菌：用3％w/w洗衣粉水清洗干净并放到自来水下流水冲洗20min，用70％v/v酒精对外植体材料消毒30s，自来水下流水冲洗10-20min，外植体材料放置在0.1％w/w升汞溶液中浸泡消毒10分钟，在浸泡消毒过程中不断地搅拌和振荡，将外植体材料从升汞溶液中取出，再用15％w/w的次氯酸钠溶液浸泡10min，在浸泡过程中不断地搅拌和振荡，浸泡完成以后，将外植体材料从次氯酸钠溶液中取出，用无菌水冲洗外植体材料，冲洗次数为3-5遍，冲洗好的外植体材料接种备用；
(2)丛生芽诱导：将冲洗好的外植体材料放到超净工作台中，用接种刀切下外植体稍褐化的部分，花蕾外植体和种子外植体按如下方式进行丛生芽诱导：
将花蕾外植体接种到花蕾专用诱导培养基上，培养20天，得到除虫菊丛生苗，所述花蕾专用诱导培养基为：ms+6-ba2.0mg/l+tdz0.5mg/l+iba0.2mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6，培养条件：温度25℃±1℃，光照强度1000-2000lx，光照时间14h/d；
将种子外植体接种到种子专用诱导培养基上，先暗培养7天后再转入光照培养条件下培养15d，得到除虫菊丛生苗，光照培养条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000-2000lx，光照时间14h/d，所述种子专用诱导培养基为：ms+ga1.0mg/l+tdz0.1mg/l+iaa0.1mg/l+agno31.0mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6；
(3)无菌苗增殖：把步骤(2)花蕾外植体和种子外植体经诱导得到的除虫菊丛生苗转接到无菌苗增殖培养基，在温光条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000～2000lx，光照时间12h/d，培养20天，得到分化扩繁的除虫菊丛生苗，重复此无菌苗增殖过程以后，扩繁得到目标数量(大批量的)的除虫菊丛生苗，每次分化扩繁的速度为4-5倍；所述无菌苗增殖培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+tdz0.1mg/l+iba0.1mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6；
(4)生根培养：将步骤(4)增殖扩繁得到的除虫菊丛生苗用接种刀切成单株苗，将切成的单株苗转接到除虫菊生根培养基，在温光条件为：温度25℃±1℃，光照强度1000～2000lx，光照时间12h/d，培养15天，得到除虫菊生根苗；每株苗的生根数量为10-15条，每条根的长度为2.0～3.0cm，植株健壮；所述除虫菊生根培养基为：ms+iaa0.1mg/l+iba0.1mg/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.6。
(5)炼苗：将除虫菊生根苗从培养瓶中取出，洗去除虫菊生根苗根部的培养基，将洗掉培养基的除虫菊生根苗移至草炭(颗粒尺寸1mm～5mm)：珍珠岩(颗粒尺寸1mm～5mm)＝6:1的体积比混合基质中进行炼苗，待除虫菊生根苗成活并长至20-30cm后，将除虫菊生根苗移栽到大田。
以上培育繁殖速度快，每次分化扩繁的速度可达4-5倍、采用尚未张开的花蕾作为外植体，经过20天以后可以诱导出苗，转至增殖培养基中以后，每15-20天可进行增殖扩繁，其成活率高达90％以上。采用种子作为外植体，经过22天以后可以诱导出苗，转至增殖培养基以后，每15-20天可进行增殖扩繁，其成活率高达90％以上。