本发明涉及鱼类精子保存液领域，具体涉及一种解决拟鲿规模化繁殖的拟鲿精子保存液及其制备方法。
背景技术：
：拟鲿人工繁殖时，需要杀鱼取精，这种人工繁殖工艺不适宜规模化繁殖，因为规模化繁殖一次要给几百尾雌鱼授精，若临时去杀雄鱼来不及，若提前杀雄鱼因为精子活力如果没有保存液仅仅只有15-25秒的活力，显然是不行的。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一种在4℃的冰箱中可以冷藏10天精子还有较强的活力拟鲿精子保存液及其制备方法。本发明的技术方案是这样实现的：一种拟鲿精子保存液，其特征在于，包括以下重量份数的组分：氯化钠5-8份、氯化钾0.1-0.5份、氯化钙0.1-0.5份、氯化镁0.05-0.1份、碳酸氢钠0.01-0.03份、葡萄糖0.5-0.8份、青霉素150-200份。一种拟鲿精子保存液，包括以下重量份数的组分：氯化钠6份、氯化钾0.3份、氯化钙0.3份、氯化镁0.08份、碳酸氢钠0.02份、葡萄糖0.6份、青霉素180份。一种拟鲿精子保存液的制备方法，包括以下步骤：步骤一）、称取上述重量份数的氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠、葡萄糖、青霉素；步骤二）、将上述组分加入塑料瓶或玻璃瓶中并用蒸馏水配置成溶液；步骤三）、上述制得的溶液制成后4小时内不用则存放于冰箱冷藏保存；步骤四）、精子保存液效果测试。取步骤四）制得的精子保存液，用流式细胞仪上机进行精子染色质检测，在fsc/ssc图上圈出精子细胞，设门至fl1(fitc)/fl3(ecd)散点图上进行分析；dna完整性好的精子发绿色荧光；dna完整性差的精子发红色荧光；通过公式计算dna断裂指数at来评价精子dna质量，αt=red/(red+green)。本发明的积极效果是：4℃冷藏箱中可以保存10天，精子98%以上保持旺盛活力，仍可作为授精的精子，受精率95%以上。与购买的韩氏精子保存液相比，韩氏液同样条件仅可保存4天，并且受精率60-70%。具体实施方式实施例1：一种拟鲿精子保存液，包括以下重量份数的组分：氯化钠5份、氯化钾0.1份、氯化钙0.1份、氯化镁0.05份、碳酸氢钠0.01份、葡萄糖0.5份、青霉素150份。一种拟鲿精子保存液的制备方法，包括以下步骤：步骤一）、称取上述重量份数的氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠、葡萄糖、青霉素；步骤二）、将上述组分加入塑料瓶或玻璃瓶中并用蒸馏水配置成溶液；步骤三）、上述制得的溶液制成后4小时内不用则存放于冰箱冷藏保存；步骤四）、精子保存液效果测试。取步骤四）制得的精子保存液，用流式细胞仪上机进行精子染色质检测，在fsc/ssc图上圈出精子细胞，设门至fl1(fitc)/fl3(ecd)散点图上进行分析；dna完整性好的精子发绿色荧光；dna完整性差的精子发红色荧光；通过公式计算dna断裂指数at来评价精子dna质量，αt=red/(red+green)。实施例2：一种拟鲿精子保存液，包括以下重量份数的组分：氯化钠6份、氯化钾0.3份、氯化钙0.3份、氯化镁0.08份、碳酸氢钠0.02份、葡萄糖0.6份、青霉素180份。拟鲿精子保存液的制备方法同实施例1。实施例3：一种拟鲿精子保存液，包括以下重量份数的组分：氯化钠8份、氯化钾0.5份、氯化钙0.5份、氯化镁0.1份、碳酸氢钠0.03份、葡萄糖0.8份、青霉素200份。拟鲿精子保存液的制备方法同实施例1。本发明的拟鲿精子保存液制备过程如下：一、材料和方法本发明自行研制的拟鲿精子保存液命名为hnscz，商品购买的现有的精子保存液命名为hanks。试剂：吖啶橙（ao）染液、盐酸、hanks精子保存液（商品购买）、hnscz精子保存液（本发明的保存液）。样本：取精子研磨，分别取hnscz和hanks精子保存液各8mi，显微镜观察后稀释精液，根据实验设计时间段，提前按4h、96h、144h稀释好后分别用试管标号放置于4℃冰箱冷藏保存待用。分别取hnscz和hanks保存的4h、96h、144h精子各30μl；+酸吸液80μl（反应30s）；+ao染色液100μl（反应3min）；上机（cytoflex流式细胞仪）检测。实际人工授精验证分别取不同保存时间的精子与人工催产后挤出的乌苏里拟鲿卵授精，把授精卵分别按标号放入孵化框，在孵化槽中孵化5h统计受精率。二、实验分析1、断裂指数分析用流式细胞仪进行镜子染色质检测，在fsc/ssc图上圈出精子细胞，设门至fl1(fitc)/fl3(ecd)散点图上进行分析。dna完整性好的精子主要发绿色荧光(p2门)；dna完整性差的精子主要发红色荧光(p4门)。通过公式计算dna断裂指数at来评价精子dna质量，αt=red/(red+green)。从实验测试结果得出：hnscz:at1=6.37÷(39.03+6.37)=0.14at2=11.28÷(40.65+11.28)=0.21at3=9.48÷(23.23+9.48)=0.29hanks:at1=9.44÷(32.10+9.44)=0.23at2=8.29÷(17.18+8.29)=0.32at3=18.85÷(38.54+18.85)=0.32从以上断裂指数结果来看，本申请的hnscz精子保存液保存的精子比购买的hanks精子保存液保存的精子的断裂指数小：hnsczat1<hanksat1；hnsczat2<hanksat2；hnsczat3<hanksat3。说明本申请的精子保存液hnscz优于商业购买的hanks精子保存液。2、实验验证分析表1两种精子保存液实用效果对照精子保存时间（h）496144hnscz受精率（%）98.287.681.4hanks受精率（%）83.013.311.5实际人工授精验证结果，hnscz保存的精子144h受精率81.4%，保持较高水平，与流式细胞仪测试的dna断裂指数hnsczat3=0.29较低水平结果相吻合；同样hanks保存的精子144小时受精率11.5%，已达到很低水平，不能作为实际人工繁殖使用，与流式细胞仪测试的dna断裂指数hanksat3=0.32较高水平的结果一致。3、镜检观察显微镜观察，hnscz保存液保存的精子6d精子活力还旺盛，7d活力开始减弱，9d死亡；hanks保存液保存的精子1d、2d活力较强，4d活力减弱，5d死亡。三、结论1、scsa判定精子质量好坏快速准确，并能量化分析，是人工保存精子使用前检测精子活力强弱的重要手段；2、乌苏里拟鲿精子保存液hnscz经scsa分析和实际应用检验，在4℃冰箱中可以人工保存一周时间并保持精子活力旺盛，是实现规模化繁殖的保证；3、对于乌苏里拟鲿人工保存的精子来说，根据参考资料和测试实验结果分析认为，dna断裂指数at≤0.15则精子活力旺盛，保存的精子可以作为人工授精的精子来源；dna断裂指数at≥0.3则精子趋于衰竭，不再作为人工授精的精液来源。当前第1页12