本发明涉及杀菌剂领域，具体而言，涉及中山杉精油及其在抑制植物病原菌中的应用。
背景技术：
中山杉(taxodiumhybrid‘zhongshanshan’)属于杉科(taxodiaceae)落羽杉属(taxodium)，是由落羽杉(tdistichum(linn)rich)、池杉(tascendensbrong)及墨西哥落羽杉(tmucronatumtenore)三个树种间通过杂交选育获得的优良无性系的总称。
中山杉为半常绿高大乔木，树冠为圆锥形至宽卵形，树叶茂密，树干通直，具有速生，耐盐碱，抗分离强，病虫害少，材质优良，绿色期长，景观效果好等优点。中山杉不仅有良好的观赏性，而且有利于涵养水源和水土保持，是一种新型绿化树种。同时，中山杉落叶还能够改善土壤环境，增加土壤肥力，其根系也能够起到改善水体的作用，因而在全国各地得到了广泛的推广和应用。
目前，对于中山杉的利用，主要还是利用树木本身植物特性，对于中山杉的深入开发和应用研究并不多见，也没有中山杉植株内有效物质的提取的研究出现。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种中山杉精油，本发明方法中，由中山杉叶片深加工提取得到中山杉精油，能够实现中山杉资源的充分利用。
本发明的第二目的在于提供所述的中山杉精油在抑制植物病原菌中的应用。
本发明的第三目的在于提供所述中山杉精油的制备方法，本发明制备方法操作简便，能够从中山杉叶片中提取得到精油等有效成分。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种中山杉精油，所述中山杉精油由中山杉叶片经水蒸气蒸馏提取得到。
同时，本发明还提供了所述的中山杉精油在抑制植物病原菌中的应用，所述植物病原菌包括：水稻弯孢病菌，烟草赤星病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌，水稻纹枯病菌，玉米纹枯病菌，麦冬炭疽病菌，油菜菌核病菌，小麦全蚀病菌，以及棉花枯萎病菌。
同样的，本发明还提供了所述的中山杉精油在在抑制植物真菌病害中的应用，所述植物真菌病害包括：水稻弯孢病，烟草赤星病，苹果腐烂病，苹果轮纹病，水稻纹枯病，玉米纹枯病，麦冬炭疽病，油菜菌核病，小麦全蚀病，以及棉花枯萎病。
一种中山杉精油的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将粉碎后中山杉叶片以水和有机溶剂为提取剂，进行加热蒸馏提取；分取有机层，浓缩得到中山杉精油。
优选的，本发明所述的制备方法中，水的体积毫升数与粉碎后中山杉叶片的质量克数比为5～20:1；更优选的，水的体积毫升数与粉碎后中山杉叶片的质量克数比为10～15:1。
优选的，本发明所述的制备方法中，所述有机溶剂包括正己烷。
优选的，本发明所述的制备方法中，有机溶剂的体积毫升数与粉碎后中山杉叶片的质量克数之比为10～30:1000；更优选的，有机溶剂的体积毫升数与粉碎后中山杉叶片的质量克数之比为15～20:1000。
优选的，本发明所述的制备方法中，提取的温度为：60～70℃；提取的时间为：6～8h。
优选的，本发明所述的制备方法中，所述浓缩包括减压浓缩，以除去正己烷层溶液中的正己烷。
进一步的，本发明还提供了包含本发明中山杉精油的杀菌剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中山杉精油对于多种植物病菌都有良好的抑制作用，能够对多种植物真菌病害起到良好的防治作用。
同时，本发明中山杉精油为天然植物提取物，能够减少对于环境的污染，可以作为植物源农药而应用。
(2)本发明中，通过采用蒸馏提取的方式，能够将中山杉叶片中的有效成分精油提取得到，实现了对于中山杉资源的有效利用，同时也为中山杉资源的进一步深加工提供了基础和借鉴。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于现有技术中在中山杉利用上所存在的不足，本发明特提供了一种对于中山杉深入开发和提取利用的方法，以实现对于中山杉资源的深化利用。
具体的，本发明中，是以水和有机溶剂为提取剂，对中山杉进行提取，具体方法包括如下步骤：
首先，摘取新鲜的中山杉叶片，然后进行粉碎处理后，置于挥发油提取装置中；
然后，按照1:5～20(g/ml，优选为1:10～15)的料液比，加入水(优选为蒸馏水)，并进行混合；
接着，加入有机溶剂(例如石油醚，正己烷等，优选为正己烷；有机溶剂与粉碎后中山杉叶片的比例为10～30:1000(ml/g)，优选为15～20:1000)，进行加热蒸馏提取，提取的温度为：60～70℃，提取的时间为6～8h；
冷却后，进行分液，将有机层减压浓缩除去溶剂，得到中山杉精油。所得中山杉精油中，所含有效成分主要包括：α-蒎烯(α-pinene)、柠檬烯(limonene)、石竹烯(caryophyllene)、蛇麻烯(cis-thujopsene)、β-古巴烯(β-copaene)、α-松油醇(α-terpineol)、顺-罗汉柏烯(humulen)、β-蒎烯(β-pinene)、亚麻三烯(santolinatriene)、α-杜松醇(α-cadinol)、γ-衣兰油烯(γ-muurolene)、α-菖蒲烯(α-calamenene)等。
本发明如上的精油提取工艺操作步骤简便，且能够实现对于精油的有效提取，为中山杉资源的深加工利用提供了基础。
由如上方法提取得到的中山杉精油具有良好的真菌抑制能力(特别是植物病原菌)，浓度水平达到2000μl/l的精油对水稻弯孢病菌，烟草赤星病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌，水稻纹枯病菌，玉米纹枯病菌，麦冬炭疽病菌，油菜菌核病菌，小麦全蚀病菌，以及棉花枯萎病菌等真菌能够表现出接近100％的抑制率。
因而，本发明中山杉精油也能够进一步用于抑制由上述真菌所导致的例如：水稻弯孢病，烟草赤星病，苹果腐烂病，苹果轮纹病，水稻纹枯病，玉米纹枯病，麦冬炭疽病，油菜菌核病，小麦全蚀病，以及棉花枯萎病等植物真菌病害。
因此，本发明实际上也提供了一种包含中山杉精油的杀菌剂，该杀菌剂可以以中山杉精油为单一的功能性成分，也可以为包含中山杉精油的复配型杀菌剂。
实施例1
中山杉植物叶片采集于安徽省凤台县农业生态产业园。
将3kg新鲜的中山杉叶片粉碎并放置于挥发油提取装置中，加入蒸馏水至料液比为1:10，并进行混合；
然后，向提取装置中加入60ml正己烷，60℃蒸馏提取6h；
冷却后，分液，收集正己烷层，通过减压浓缩除去正己烷后，获得中山杉精油，转移至棕色样品瓶中4℃储存。
实施例2
中山杉植物叶片采集于安徽省凤台县农业生态产业园。
将3kg新鲜的中山杉叶片粉碎并放置于挥发油提取装置中，加入蒸馏水至料液比为1:15，并进行混合；
然后，向提取装置中加入100ml正己烷，60℃蒸馏提取6h；
冷却后，分液，收集正己烷层，通过减压浓缩除去正己烷后，获得中山杉精油，转移至棕色样品瓶中4℃储存。
实施例3
中山杉植物叶片采集于安徽省凤台县农业生态产业园。
将3kg新鲜的中山杉叶片粉碎并放置于挥发油提取装置中，加入蒸馏水至料液比为1:10，并进行混合；
然后，向提取装置中加入60ml石油醚，60℃蒸馏提取6h；
冷却后，分液，收集有机层，通过减压浓缩除去石油醚后，获得中山杉精油，转移至棕色样品瓶中4℃储存。
实施例4
中山杉植物叶片采集于安徽省凤台县农业生态产业园。
将3kg新鲜的中山杉叶片粉碎并放置于挥发油提取装置中，加入蒸馏水至料液比为1:10，并进行混合；
然后，向提取装置中加入60ml正己烷，70℃蒸馏提取8h；
冷却后，分液，收集正己烷层，通过减压浓缩除去正己烷后，获得中山杉精油，转移至棕色样品瓶中4℃储存。
实验例1中山杉精油抑菌实验
一、实验方法
1.培养基的制备
取去皮洗净切块的马铃薯200g，加入1000ml蒸馏水，煮沸30min，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖和15g琼脂，加热待琼脂融化后，定容至1000ml，量取198mlpda至250ml锥形瓶中，用封口膜封口。于121℃湿热灭菌20min。
2.供试药剂的配制
2.1中山杉精油母液配制
称取2g实施例1产品中山杉精油为原料进行母液配制，具体配制方法如下：以丙酮定容至10ml，配制浓度为2.0×105mg/l母液，混合均匀并依次稀释配制成1.0×105mg/l，5.0×104mg/l，2.0×104mg/l，1.0×104mg/l不同浓度的精油药液，经真菌过滤器过滤后备用。
2.2茶树精油母液配制
选择茶树精油作为阳性对照，茶树精油母液具体配制方法如下：称取2g茶树精油用丙酮定容至10ml，配制2.0×105mg/l母液,并依次稀释配制成1.0×105mg/l，5.0×104mg/l，2.0×104mg/l，1.0×104mg/l不同浓度的精油药液，经真菌过滤器过滤后备用。
2.3含药培养基的配制
吸取2ml浓度为2.0×105mg/l的中山杉精油药液加入198ml尚未凝固的pda培养基中，混合均匀，配制成含中山杉精油浓度为2000mg/l的培养基，同法依次配制浓度为1000mg/l，500mg/l，200mg/l，100mg/l的含药培养基，倒入平板，待平板完全凝固后使用。
含茶树精油培养基配制按照同一方法处理，得到梯度浓度的含药培养基。
2.4空白对照
吸取2ml丙酮加入198ml尚未凝固的pda中，作为空白对照。
3.生长速率法
供试植物病原真菌菌种由安徽农业大学植物病理学实验室提供。在无菌操作台中，以打孔器将经过二次活化的供试病原真菌菌种制成菌碟(d＝5.0mm)。接种病原真菌菌碟(菌丝面朝下)。将接种后的pda培养基平板倒置，放于25℃恒温箱中培养。每处理重复3次，在24h，48h，72h，96h用十字交叉法测量菌落生长直径(直至空白对照长满整个培养皿)，用如下公式计算抑制率。
4.ec50的计算
根据生测结果绘制处理浓度与抑制率工作曲线，使用dps软件进行数据分析，获得中山杉精油对不同真菌的ec50值，并通过与茶树精油ec50进行比较，对其生物活性进行评价。
二、实验结果
抑菌实验结果如下表1所示：
表1中山杉精油抑制真菌生物活性
由如上表1的实验结果可知，中山杉精油对10种供试植物病原真菌均表现出一定抑制生长生物活性；
同时，通过ec50值的比较，中山杉精油对水稻弯孢，苹果腐烂，苹果轮纹，水稻纹枯以及棉花枯萎病菌的生物活性均优于阳性对照组(茶树精油)。
此外，中山杉精油对苹果腐烂病菌和水稻纹枯病菌的抑制能力更为突出，其ec50分别为136.51和201.99μl/l；而茶树精油对这两种真菌的ec50值仅为3166.73和418.12μl/l。
由如上的实验结果分析可知，中山杉精油具有很好的抑制真菌生物活性，作为植物源杀菌剂的开发拥有极大的潜能，尤其是针对苹果腐烂病。
同时，抑菌实验表明，当处理浓度为2000μl/l时，中山杉精油对水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌、水稻弯孢病菌、棉花枯萎病菌、小麦全蚀病菌、油菜菌核病菌以及玉米纹枯病菌等真菌的的抑制率均可达到100％，因而具有防治由上述真菌所引发植物疾病的能力，也为新型植物源杀菌剂的研发提供了物质基础。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。