用于转移细胞质或细胞核性状或组分的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号62/480,983(2017年4月3日提交)和62/491,913(2017年4月28日提交)的权益，将这两篇申请均通过引用以其整体并入本文。

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本发明总体上涉及农业、植物生物技术和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于通过细胞融合在植物细胞之间转移细胞质、细胞器(例如质体编码的)或细胞核性状的组合物和方法。

背景技术：

产生具有新的遗传性状组合的植物的能力可用于提高农作物产量和抵抗疾病和害虫压力。除了将植物杂交或育种在一起外，还可以转基因地或通过各种诱变技术引入新的性状组合。然而，许多植物物种和品种难以从外植体或植物材料转化、培养和/或再生。将不顺从转化或培养技术的新的性状引入植物中的一种方法可能是通过分子技术从其他种质转移那些性状。尽管已经通过原生质体融合转移质体和细胞核性状，但是对于许多经济上重要的植物物种来说，从原生质体再生植物仍然是困难的。本领域需要用于在不同植物细胞、组织和品种之间转移遗传和细胞质元件和性状以产生所需性状组合的新的且改进的方法。

技术实现要素：

在一个方面，本发明提供了遗传物质转移的方法，其包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生在所述混合之后其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括d)基于可选择或可筛选的标记物筛选或选择所述至少一种组合细胞或其后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在所述方法的某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含在所述第二植物细胞培养物的细胞中不存在的目标转基因、天然等位基因、编辑或突变。

在一些实施方案中，所述至少一种组合细胞或其后代细胞包含存在于所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞中的目标转基因、天然等位基因、编辑或突变。在某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。

所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种可以包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞，和/或其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。在一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物各自包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞。所述第一和第二植物细胞培养物也可以各自包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。在某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞，并且所述第二植物细胞培养物包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。

在其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种可以包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞和/或其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞的方法的一些实施方案中，所述方法可以包括：d)在步骤(c)或步骤(d)的过程中和/或之后，基于所述质体基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述混合细胞培养物的至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述方法还包括：d)在步骤(c)或步骤(d)的过程中和/或之后，基于所述细胞核基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述混合细胞培养物的至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在某些实施方案中，所述方法还包括在基于可选择或可筛选的标记的存在进行筛选之前，从所述混合细胞培养物和/或所述至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞再生植物。所述方法也可以包括在基于可选择或可筛选的标记的存在进行筛选之后，从所述混合细胞培养物和/或所述至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞再生植物的步骤。

在一些实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花细胞。在其他实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。

在某些实施方案中，所述质体基因组编码的标记基因是可选择的标记基因。在特定实施方案中，所述质体基因组编码的可选择的标记基因选自由以下组成的组：aada、rrns、rrnl、nptii、apha-6、psba、bar、hppd、asa2和ahas。在一些实施方案中，所述质体基因组编码的标记基因是可筛选的标记基因。在特定实施方案中，所述质体基因组编码的可筛选的标记基因是gfp或gus。

在某些实施方案中，所述细胞核基因组编码的标记基因是可选择的标记基因。在特定实施方案中，所述细胞核基因组编码的可选择的标记基因选自由以下组成的组：nptii、epsps、bar、hpt、dmo和gat。在某些实施方案中，所述细胞核基因组编码的标记基因是可筛选的标记基因。在特定实施方案中，所述细胞核基因组编码的可筛选的标记基因选自由以下组成的组：uida(gus)和gfp。

在一些实施方案中，所述第一植物细胞培养物的第一细胞是供体细胞，并且所述第二植物细胞培养物的第二细胞是受体细胞。在某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物的细胞具有相同的倍性水平。在一些实施方案中，所述组合细胞和所述第一和/或第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞具有相同的倍性水平。

在其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种可以包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞和/或其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞的方法的一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种的细胞包含质体基因组编码的标记基因，并且其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种的细胞包含细胞核基因组编码的标记基因。

在其中所述第一和第二植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物的方法的某些实施方案中，在步骤(c)的过程中和/或之后，针对由细胞核基因组编码的基因所编码的标记基因的存在筛选或选择所述混合细胞培养物的细胞或其后代细胞。

在所述方法的一些实施方案中，所述混合细胞培养物、所述第一植物细胞培养物和/或所述第二植物细胞培养物的细胞或其后代细胞对于质体编码的基因是同质体组的(homoplastomic)。在所述方法的某些实施方案中，所述混合细胞培养物、所述第一植物细胞培养物和/或所述第二植物细胞培养物的细胞或其后代细胞对于质体编码的基因是异质体组的(heteroplastomic)。

在另一个方面，本发明提供了通过遗传物质转移的方法产生的组合植物细胞，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生在所述混合之后其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞。在某些实施方案中，所述组合植物细胞是双子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述组合植物细胞是单子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述组合植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。

本发明还提供了从通过这种方法产生的组合植物细胞或其后代细胞再生的植物。还考虑了所述植物的种子、后代植物或后代种子。

在某些实施方案中，所述植物是双子叶植物。在特定实施方案中，所述双子叶植物选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花植物。在其他实施方案中，所述再生植物是单子叶植物。在特定实施方案中，所述单子叶植物选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱植物。

本发明的另一个方面提供了通过遗传物质转移的方法产生的受损混合细胞培养物，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生在所述混合之后其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞。在某些实施方案中，所述遗传转移包含质体或细胞器基因转移。所述遗传转移也可以包含或可选地包含细胞核基因转移。

本发明的另一个方面提供了遗传物质转移的方法，其包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)损伤所述第一和第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞；和c)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物以产生其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括：d)基于可选择或可筛选的标记物筛选或选择所述至少一种组合细胞或其后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。在此类方法的某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞，和/或其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。在一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物各自包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞。在某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物各自包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。在某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物也可以包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞，并且其中所述第二植物细胞培养物可以包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞。

所述方法也可以还包括：d)在步骤(c)和/或步骤(d)的过程中和/或之后，基于所述质体基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述混合细胞培养物的至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。所述方法也可以还包括：d)在步骤(c)和/或步骤(d)的过程中和/或之后，基于所述细胞核基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述混合细胞培养物的至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。

所述方法还可以包括步骤e)：从所述混合细胞培养物和/或所述至少一种组合细胞或其至少一种后代细胞再生植物。

在某些实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在其他实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。

在此类方法的某些实施方案中，所述质体基因组编码的标记基因是可选择或可筛选的标记基因。此外，在所述方法的一些实施方案中，所述细胞核基因组编码的标记基因是可选择或可筛选的标记基因。

在遗传物质转移的方法的一些实施方案中，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)损伤所述第一和第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞；和c)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物以产生其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞，所述第一植物细胞培养物的第一细胞是供体细胞，并且所述第二植物细胞培养物的第二细胞是受体细胞。在某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物的细胞具有相同的倍性水平。在一些实施方案中，所述组合细胞和所述第一和/或第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞具有相同的倍性水平。

在其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有质体基因组编码的标记基因的细胞和/或其中所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种包含具有细胞核基因组编码的标记基因的细胞的此类方法的某些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种的细胞包含质体基因组编码的标记基因，并且所述第一和第二植物细胞培养物中的至少一种的细胞包含细胞核基因组编码的标记基因。

也可以在步骤(c)或(d)的过程中和/或之后，针对由细胞核基因组编码的基因所编码的标记基因的存在筛选或选择通过还包括以下步骤d)的方法产生的所述混合细胞培养物的细胞或其后代细胞：基于可选择或可筛选的标记物筛选或选择所述至少一种组合细胞或其后代细胞、或者从所述至少一种组合细胞或其后代细胞发育或再生的植物。

在另一个方面，本发明提供了通过遗传物质转移的方法产生的组合植物细胞，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物；b)损伤所述第一和第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞；和c)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物以产生其中已经发生了遗传物质的转移的至少一种组合细胞。在某些实施方案中，所述组合植物细胞是双子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述组合植物细胞是单子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述单子叶植物选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。

还考虑了从通过这种方法产生的组合植物细胞或其后代细胞再生的植物，以及这种植物的种子、后代植物或后代种子。

本发明还提供了通过此类方法产生的受损混合细胞培养物。所述遗传转移可以包含质体或细胞器基因转移。所述遗传转移也可以包含或可选地包含细胞核基因转移。

在另一个方面，本发明提供了用于编辑植物细胞的方法，其包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括：d)筛选或选择所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞、或者具有所述编辑或突变的从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。

在此类方法中，基于通过所述编辑或突变产生的并且存在于所述发育或再生的植物或其后代植物、植物部分或种子中的性状或表型，筛选或选择从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在特定实施方案中，基于分子测定筛选或选择所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞、或者从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在所述方法的一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。所述方法也可以包括在这种筛选或选择之前或之后，从所述混合细胞培养物和/或所述至少一种编辑的产物细胞或其至少一种后代细胞再生植物。

在此类考虑的方法中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞可以是双子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花细胞。在其他实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。

在某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物的第一细胞是供体细胞，并且所述第二植物细胞培养物的第二细胞是受体细胞。

在一些实施方案中，与编码位点特异性核酸酶的序列可操作地连接的第一启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在某些实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的内切核酸酶、tale内切核酸酶(talen)、重组酶或转座酶。在特定实施方案中，所述位点特异性核酸酶是rna指导的核酸酶。

在本公开的一个方面，用于编辑植物细胞的方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞，所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞还包含含有与启动子可操作地连接的编码指导rna分子的第一可转录dna序列的第一重组dna构建体。在另一个方面，用于编辑植物细胞的方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；b)损伤所述第一和第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞；和c)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞。在此类方法的某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞还可以包含含有与启动子可操作地连接的编码供体模板分子的第二可转录dna序列的第二重组dna构建体。在特定实施方案中，所述供体模板分子包含含有与植物可表达的启动子可操作地连接的编码序列或可转录dna序列的转基因。在某些实施方案中，与所述第一可转录dna序列可操作地连接的启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在特定实施方案中，与所述第二可转录dna序列可操作地连接的启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。

此外，所述第二植物细胞培养物的一种或多种细胞可以包含含有与启动子可操作地连接的编码指导rna分子的第一可转录dna序列的重组dna构建体。在一些实施方案中，所述第二植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与启动子可操作地连接的编码供体模板分子的第二可转录dna序列的重组dna构建体。在某些实施方案中，所述供体模板分子包含含有与植物可表达的启动子可操作地连接的编码序列或可转录dna序列的转基因。

本公开的另一个方面提供了通过如下方法产生的编辑的产物细胞，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞，从而产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞。在另一个方面，提供了通过如下方法产生的编辑的产物细胞，所述方法包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；b)损伤所述第一和第二植物细胞培养物中的一种或两种的细胞；和c)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞。在某些实施方案中，所述编辑的产物细胞是双子叶植物细胞。在其他实施方案中，所述编辑的产物细胞是单子叶植物细胞。还考虑了从通过这种方法产生的编辑的产物细胞或其后代植物细胞再生或发育的植物。在某些实施方案中，所述再生植物是双子叶植物或单子叶植物。还提供了这种植物的种子、后代植物或后代种子，以及通过此类方法产生的受损混合细胞培养物。

在另一个方面，本发明提供了用于向植物细胞提供供体dna序列的方法，其包括：a)获得第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因和供体dna序列；b)使所述第一和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物；和c)损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的供体dna序列的插入序列或突变的至少一种产物细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括：d)筛选或选择包含所述供体dna序列的插入序列或突变的至少一种产物细胞或其后代细胞、或者具有所述供体dna序列的插入序列或突变的从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述供体dna序列是模板化编辑的模板。在其他实施方案中，所述供体dna序列包含转基因。

在一个方面，基于通过来自所述供体dna序列的插入序列或突变产生的并且存在于所述发育或再生的植物或其后代植物、植物部分或种子中的性状或表型，筛选或选择从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在特定实施方案中，基于分子测定筛选或选择包含所述供体dna序列的至少一种产物细胞或其后代细胞、或者从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物。在所述方法的一些实施方案中，所述第一和第二植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。所述方法也可以包括在这种筛选或选择之前或之后，从所述混合细胞培养物和/或包含所述供体dna序列的至少一种产物细胞或其至少一种后代细胞再生植物。

在此类考虑的方法中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞可以是双子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、卡诺拉和棉花细胞。在其他实施方案中，所述第一和/或第二植物细胞培养物的细胞可以是单子叶植物细胞。在特定实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。

在某些实施方案中，所述第一植物细胞培养物的第一细胞是供体细胞，并且所述第二植物细胞培养物的第二细胞是受体细胞。

在一些实施方案中，与编码位点特异性核酸酶的序列可操作地连接的第一启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在某些实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的内切核酸酶、tale内切核酸酶(talen)、重组酶或转座酶。在特定实施方案中，所述位点特异性核酸酶是rna指导的核酸酶。

附图说明

图1.亲本系对抗生素的敏感性。

图2.在亲本系的叶子和愈伤组织中的gfp和gus的表达。

图3.在选择的细胞系#iv中的gfp和gus的表达以及在选择的细胞系#iii中的gus的表达。

图4.来自#iv细胞系的再生烟草植物与30125和42061亲本系相比的完整植株和花形态的比较。

图5.相对于野生型对照(下图)，来自#iv细胞系的代表性gfp表达数据(上图)。

图6.相对于野生型和#42061亲本对照，细胞系#m的流式细胞术数据(倍性分析)。

图7.相对于供体和受体亲本和野生型对照，由选择的细胞系产生的植物中转基因的pcr检测。

图8.细胞系#k和野生型(wt)植物的正反交的后代分析。

图9.细胞系#iii和野生型(wt)植物的正反交的后代分析。

图10.自交后细胞系#k植物的后代分析。

图11.亲本植物(42061和138202)对壮观霉素和巴龙霉素的敏感性。

图12.在亲本系#138202的原生质体中的gfp的表达。

图13.相对于对照，在壮观霉素和巴龙霉素两者上进行选择后产生的细胞系+8(42061+138202)中的gfp和gus的表达。

图14.在细胞融合或转移后产生的+8和#9植物的染色体核型分析。

图15.相对于亲本对照植物，来自选择的+8和#9细胞系的再生植物的形态。

图16.通过相对于野生型植物选择对杂交♀#9x♂野生型普通烟草变种samsun(n.tabacumvar.samsun)的后代分析。

图17a.gfp报告基因构建体具有lox位点以获得在cre重组酶的存在下可检测的表型；

图17b.gfp阳性玉米愈伤组织细胞表明cre重组酶的转移。

序列表

seqidno:1gus正向引物

seqidno:2gus反向引物

seqidno:3gfp正向引物

seqidno:4gfp反向引物

seqidno:5npt2正向引物

seqidno:6npt2反向引物

seqidno:7aada正向引物

seqidno:8aada反向引物

具体实施方式

本公开提供了用于在植物细胞和组织之间转移质体编码和细胞核编码的遗传性状和/或细胞、细胞质或细胞核组分或表达产物以产生具有所需基因型和/或性状组合的细胞或植物的新方法和组合物。质体基因组(“质体组”)的转化在许多植物物种中是困难的或受限制的。因此，拥有用于将遗传物质(例如，如在质体中发现的)从一种植物转移或移动至另一种植物的高效且有效的技术是有益的，所述遗传物质也可以通过多种分子生物技术进行转化或工程化。此外，将细胞核编码的遗传物质或其他细胞组分从一种植物移动至另一种植物也将是有用的，并且还提供了实现这些目标的新方法。

本公开描述了在体外(例如以愈伤组织或细胞悬浮培养物的形式)生长的两种或更多种不同类型(如来自两种或更多种不同的亲本植物)的植物细胞的混合群体中细胞与细胞并置或接触和细胞组分的全部或部分转移、交换或融合的方法，其可以伴随和辅以培养中的那些细胞或组织的损伤。经由来自另一种细胞的一种或多种细胞质或细胞核组分的转移、交换或包含，这种细胞转移、交换或融合可以导致来自两种不同植物细胞的性状的组合或导致新的性状或基因型的产生。不受理论束缚，损伤植物细胞(例如通过用剃须刀片、刀或其他锋利的工具切碎、超声处理、涡旋、摇动、混合、电穿孔或其他方式)被认为是在植物细胞壁中产生开口或孔隙，其可以允许在相邻细胞之间的质膜接触、交换或转移。接触或紧密接近的细胞的质膜可以允许遗传物质或其他细胞组分在亲本细胞之间转移。不受理论束缚，质膜可以形成连续的原生质膜，从而允许在亲本细胞之间进行完全或部分“细胞融合”或者细胞组分和/或遗传物质(质体和/或细胞核遗传物质)的转移或交换，从而产生包含来自两种亲本细胞的细胞和/或遗传组分或物质的组合的产物细胞。根据一些实施方案，也可以使用促进细胞膜融合的试剂，如使用不同的渗压剂(例如，聚乙二醇(peg)、糖、糖醇等)、高钙(或其他阳离子)浓度的存在、更高的ph和/或已知在其他方法中促进细胞膜融合的其他化合物和条件。然后可以使含有通过在所述混合物的不同细胞之间转移、交换或融合产生的组合或产物细胞的这种混合细胞群体生长和再生，通常同时针对存在于一种或另一种亲本植物细胞的基因组中的标记基因(转基因或非转基因的)或者依据新性状的产生或标记物表达进行筛选或选择。然后可以基于来自两种或更多种亲本细胞的新的性状搭配或组合(如遗传性状和/或标记物的组合)或依据新性状的产生或标记物表达来鉴定、分离或选择从这些组合细胞生长或再生的植物。

已经描述了通过原生质体融合转移叶绿体(sidorov等人,planta152:341–345,1981；sigeno等人,plantcellrep28:1633,2009)。但是，对于包括玉米、大豆、小麦等在内的大多数经济作物，没有开发原生质体分离、融合和植物再生的方法。还报道了通过植物嫁接进行的植物之间的质体移动(thyssen等人pnas107:2439-2443,2012；stegemann等人,pnas109:2434-2438,2012)。在这些研究中，使用具有不同细胞核和质体可选择标记物的不同烟草属(nicotiana)物种的接穗和砧木。成功嫁接后，将茎的嫁接区域切片并置于具有针对叶绿体和细胞核标记物二者的选择剂的选择培养基上。可以使具有一种原始亲本的质体和另一种亲本的细胞核遗传性状的植物再生。

然而，thyssen等人和stegemann等人描述的实验限于植物组织的嫁接。使用类似的嫁接植物的方法进行细胞核基因组的水平转移(fuentes等人,nature511:232-235,2014)。相比之下，本文描述了细胞转移或组合方法，其涉及来自体外(例如以愈伤组织或悬浮液的形式)生长的两种或更多种亲本类型的混合细胞群体，以促进遗传和/或细胞组分或性状的细胞间组合、转移或交换。不同物种、品种或基因型的细胞紧密接触或接近的这种混合细胞群体可以经历原生质膜融合或其他主动或被动机制以掺入或转移来自另一种细胞的细胞质、细胞器(如质体)和甚至细胞核的一个或多个部分、或者它们的遗传物质、表达产物或其他组分，这还可以通过损伤在混合物中的细胞或细胞团或细胞簇来促进。细胞之间的这种转移或交换可以有效地引起或允许遗传物质和/或其他细胞组分从一种基因型或遗传背景(例如质体或细胞核遗传背景)的供体细胞转移至另一种基因型或遗传背景的受体细胞。与例如thyssen等人描述的可通过胞间连丝发生的嫁接实验相比，本发明方法涉及在不具有胞间连丝的细胞之间(如在两种或更多种愈伤组织细胞或细胞悬浮培养物之间)的转移、融合或交换。实际上，如本文所述的细胞器并且尤其是细胞核在细胞之间的转移可能不会通过胞间连丝发生，因为即使细胞之间形成和存在胞间连丝，细胞核也太大而不能穿过胞间连丝。因此，与现有方法不同，本文所述的细胞转移或组合方法不需要原生质体化、胞间连丝的形成，也不需要成功嫁接分化的植物组织。

如以下实施例中所述，将来自具有细胞核标记物nptii和gus的烟草变种samsun和具有质体标记物aada和gfp的烟草变种petithavana的无组织的生长组织(愈伤组织)混合在一起，使其损伤并放置在具有针对aada和nptii基因的选择剂的选择培养基上以进行再生。产生了具有aada/gfp阳性质体和nptii/gus细胞核背景的植物，这表明两种不同亲本细胞之间发生了细胞转移。分子分析证实了此类植物中存在所有四种基因。形态和倍性水平分析证实产生了类似于变种samsun且具有来自变种petithavana的转化的质体的二倍体植物。通过该方法产生的植物与野生型烟草植物之间的正反交证实，后代植物具有对链霉素/壮观霉素的抗性和gfp的表达的母体遗传，并且具有细胞核编码的nptii与gus表达的组合。

本公开提供了用于产生受损混合细胞培养物或群体的方法、以及包含这种受损混合培养物或群体的组合物，所述受损混合培养物或群体包含一种或多种组合或产物细胞，其可以包含来自两种亲本细胞或细胞类型的细胞组分和/或遗传物质。混合细胞群体可以包含两种或更多种不同的亲本基因型，其可以各自具有一种或多种独特或不同的转基因、标记物、重组事件、插入、缺失、突变、编辑等。这些方法可以允许在不同基因型或遗传背景的细胞之间有效转移遗传物质或基因表达产物。在某些实施方案中，植物细胞是双子叶植物细胞，如来自烟草、番茄、大豆、棉花、卡诺拉、苜蓿、甜菜、拟南芥(arabidopsis)或其他水果和蔬菜。在其他实施方案中，植物细胞可以来自单子叶植物，如来自玉米、小麦、水稻、高粱、大麦或其他谷类植物和蔬菜。细胞可以来自体外生长的细胞培养物(如细胞悬浮液或愈伤组织培养物)，其可以是可再生的愈伤组织培养物。也有可能的是，供体亲本或来自供体亲本的细胞、愈伤组织或细胞悬浮液可以是不可再生的，但来自受体亲本的细胞、愈伤组织或细胞悬浮液可以是可再生的，使得通过本发明方法产生的细胞可以再生为植物。

如本文所用，“一种或多种亲本细胞(parentalcell(s))”或“一种或多种亲本细胞(parentcell(s))”是指具有一组一种或多种细胞核、线粒体和质体基因型的细胞(如细胞悬浮液或愈伤组织细胞)，但是因为每个细胞中存在多个质体和线粒体，同一细胞中可能存在多种质体和/或线粒体基因型。“亲本细胞”可以是供体细胞或受体细胞。“亲本植物”是指从中产生或衍生亲本细胞的植物。

如本文所用，“混合群体”是指具有不同基因型或遗传背景的两种或更多种不同亲本细胞的混合物或组合，所述不同基因型或遗传背景是例如在所述两种或更多种不同的亲本细胞之间不同的一种或多种其细胞核、质体和/或细胞器基因组中的至少一种转基因、标记物、突变、等位基因、插入、缺失、编辑或其他遗传或序列元件。用于诱变植物和植物细胞的一种或多种细胞核、质体和细胞器基因组的方法，以及用于通过重组将靶向插入、突变或变化引入植物的质体基因组中并选择那些突变、插入等的方法是本领域已知的。类似地，用于将转基因引入植物或植物细胞的细胞核或质体基因组中的方法也是本领域已知的。

如本文所用，“供体细胞”是在如本文所提供的细胞转移或组合方法或实验中向另一种亲本细胞(即，受体细胞)提供遗传元件或性状的亲本细胞。实际上，“受体细胞”是在如本文所提供的方法或实验中接受来自供体细胞的遗传元件或性状或细胞组分的亲本细胞。通常，在进行细胞转移或组合方法或实验之前，受体细胞不会具有从供体细胞转移的遗传元件或性状，或者不会具有与从供体细胞转移的遗传元件和/或性状相同的遗传元件或性状。“供体植物”是从中产生或衍生供体细胞的植物，而“受体植物”是从中产生或衍生受体细胞的植物。“遗传元件”可以包括植物细胞的基因组中的可在植物中产生性状或表型的任何种类的序列或序列变异或差异。

如本文所用，“组合细胞”、“组合产物细胞”或“产物细胞”是通过本公开的方法或实验产生的细胞，其具有来自如所述的两种或更多种亲本细胞的一种或多种遗传元件和/或一种或多种性状的组合、和/或细胞组分或表达产物的组合(例如，来自一种亲本细胞的至少一种遗传元件、细胞组分和/或性状，和来自不同亲本细胞的至少一种遗传元件、细胞组分和/或性状)。在一些实施方案中，“产物细胞”是指通过本公开的方法或实验产生的细胞，其具有通过由供体细胞表达的位点特异性核酸酶或由受体细胞表达的位点特异性核酸酶联合由供体细胞表达的指导rna一起引入的编辑或靶向(定点)插入。“编辑”是指相对于未进行这种“编辑”的原本相同的植物细胞或植物(如亲本或受体植物细胞或植物)的相应基因组序列，所得或产物植物细胞的细胞核基因组序列中，和从这种产物植物细胞发育或再生的植物或其后代植物中，以及来自前述任何一种的植物部分或种子中的变化(例如，插入、缺失、取代、倒位等)。这种编辑可以在存在于受体细胞中的植物基因组的基因间区域或植物基因组的基因区域内，如在天然基因或转基因处或附近(例如，在增强子、启动子、剪接位点、编码序列、外显子、内含子、5’或3'非翻译区(utr)、终止子等之中)，以影响这种基因或转基因的表达和/或活性。就受体植物和供体植物具有不同的性状或表型而言，从产物或组合细胞发育或再生的植物及其后代通常将因为转移到受体细胞中的供体细胞的遗传和/或细胞贡献相对较小并且组合产物细胞保留受体细胞的大部分或全部的细胞核、线粒体和/或质体基因组和/或细胞组分而具有与受体植物更相似或相同的包括形态和繁殖性状在内的性状和表型，但从供体细胞转移的一种或多种遗传元件、一种或多种细胞组分和/或一种或多种性状除外。

可以通过本领域已知的方法完成损伤。例如，已经发现用剃须刀片、刀或其他锋利的工具切碎或切割细胞、以及通过超声处理损伤是有效的。也可以通过涡旋、摇动、混合、电穿孔或其他机械手段来实现损伤。损伤优选在两种(或更多种)亲本细胞混合之后发生，但也可以在混合亲本细胞之前发生。不受理论束缚，植物细胞的损伤可以在植物细胞壁中产生洞或孔隙，和/或刺激两种亲本细胞类型的相互作用，这可以允许来自两个相邻受损细胞的质膜在其他区域接触或并置。在损伤或修复的过程中，植物细胞可以吸收混合物中另一种细胞的内容物。不受理论束缚，两种细胞的质膜可以相互作用或融合，或者一种细胞的质膜可以允许另一种细胞的细胞组分的转移，从而产生包含来自两种原始亲本细胞的细胞质、一种或多种细胞器、细胞核和/或遗传物质的至少一部分的产物或组合细胞。

一旦产生了受损的混合细胞培养物，便可以在混合细胞培养物和/或从其再生的植物或植物部分生长和再生的过程中和/或之后针对所需遗传性状或标记物的存在、或所需的遗传性状和/或标记物的组合的存在进行选择或筛选，以选择或筛选具有来自两种亲本细胞类型的至少一部分遗传物质的细胞、植物或植物部分。在某些实施方案中，在产生混合细胞培养物之后施加选择，其可以在混合细胞培养物产生之后立即发生和/或稍晚(例如，甚至在制备受损细胞群体时)发生。选择可以例如通过在一种或多种培养基内掺入有效量的选择剂来进行。

在某些实施方案中，可能需要利用转基因性状进行选择或筛选。例如，此类性状可以包括抗生素或除草剂耐受性，如对卡那霉素、链霉素、壮观霉素、潮霉素、草甘膦、草铵膦、麦草畏等的抗性。这些性状可以是质体编码的或细胞核编码的。可用于选择或筛选的其他性状可以包括导致产生视觉上可检测的表型或产物(如gus、gfp或类胡萝卜素(如八氢番茄红素)等)的那些性状。

如本文所用，“基因组转移”，“遗传转移”或“基因转移”是指从供体植物细胞向受体植物细胞中引入一种或多种细胞核基因组和/或质体基因组编码的遗传性状和/或基因，如一种或多种细胞核和/或质体基因组的全部或部分，以形成组合产物细胞。细胞核和/或质体基因组转移可以包括引入细胞核和/或质体dna、细胞核和/或质体染色体或多于一种细胞核和/或质体dna的一部分，包括引入至少一种完整的细胞器和/或至少一种完整的细胞器、线粒体、质体和/或细胞核基因组。质体基因组转移可以包括引入部分或全部叶绿体基因组，并且可以产生异质体组或同质体组细胞。在一些情况下，产物细胞可以保留一种亲本细胞(受体细胞)的大部分或全部细胞组分和基因组，并且接受来自另一种亲本细胞(供体细胞)的一种或多种细胞质和/或遗传组分，如供体亲本细胞的一种或多种细胞器和/或基因组，但是融合产物细胞除了从亲本供体细胞获得一种或多种细胞、细胞质和/或遗传组分外，也可能失去来自亲本受体细胞的一种或多种细胞、细胞质和/或遗传组分。

如本文所用，“损伤”是指对细胞的任何处理，其允许或促进培养物中不同细胞之间的原生质膜和/或细胞质接触。例如，可以通过摇动、涡旋、超声处理、切割和/或切碎细胞来发生损伤。因此，当细胞壁例如通过用剃须刀片切碎或通过超声处理而受损或受到扰动时，可以在植物细胞壁中形成开口或孔隙，这可以允许或促进这两种细胞之间的细胞物质的交换。

损伤体外生长的混合细胞群体可以产生“组合”产物细胞，其包含来自混合物中的两种或更多种亲本细胞、细胞系或细胞类型的一种或多种基因组、遗传和/或细胞组分的组合。不受理论束缚，可以各自为受损细胞的细胞(例如，相邻细胞的质膜(或原生质膜))之间的接触或相互作用可以提供遗传和/或细胞质物质从例如一种基因型或遗传背景的细胞到另一种基因型或遗传背景的细胞的有效移动。可以通过施加选择压力或针对标记物或表型进行筛选或选择，促进来自一种或两种(或更多种)亲本系或细胞的细胞器和/或遗传物质在所得产物或组合细胞中的存在。

术语“转基因”是指外源引入的dna分子或构建体，其作为人为干预(如通过植物转化方法)的结果掺入生物的基因组中。如本文所用，术语“转基因的”是指物质包含转基因或重组表达盒或构建体。例如，“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因或重组表达盒或构建体的植物，并且“转基因性状”是指通过掺入植物基因组中的转基因或重组表达盒或构建体的存在所引起、传递或赋予的特征或表型。作为此类基因组改变的结果，转基因植物与相关的野生型植物明显不同。根据许多实施方案，转基因可以包含与启动子(如植物可表达的启动子)可操作地连接的编码序列或可转录dna序列。植物可表达的启动子可以在一种或多种植物细胞中(如根据本公开的亲本、供体、受体和/或产物或组合细胞中)表达。植物可表达的启动子可以是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。根据许多实施方案，转基因的可转录dna序列或编码序列可以编码目标rna或蛋白质，如结构蛋白、酶、rna抑制元件或用于位点特异性核酸酶的指导rna。根据一些实施方案，转基因的编码序列可以包含细胞核或质体基因组中可能存在的标记基因的编码序列。标记基因可以是如本文进一步描述的可选择的标记基因或可筛选的标记基因。根据一些实施方案，转基因的编码序列可以编码位点特异性核酸酶。

如本文所用并且根据其通常理解的含义，“对照”意指为比较目的而设计的实验对照，其除了所测试或研究的一种或多种差异或修饰以外通常类似于实验或测试对象。例如，对照植物可以是与具有一种或多种目标修饰(例如，转基因、突变、编辑等)的实验或测试植物相同或相似类型的植物，其不包含实验植物中存在的一种或多种修饰。

转基因植物

本发明的一个方面包括包含以新的搭配形式(即以不同于任何先前存在的亲本植物系或植物细胞系中所发现的组合的组合形式)的重组dna分子的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。包含重组dna分子、转基因、构建体、盒等的这些细胞、组织、植物和种子可以表现出对选择剂(如一种或多种除草剂或抗生素)的耐受性，或者提供可筛选的标记物或另一种目标表型或性状(如目标农艺性状)。根据一些实施方案，用于本公开的细胞转移方法或实验的植物细胞可以是转基因植物细胞，其可以进一步衍生自转基因植物。

用于与当前细胞转移方法一起使用的转化植物细胞的合适方法包括可将dna引入细胞中的任何方法(例如，其中将重组dna构建体稳定地整合到植物染色体中)。植物转化方法是本领域已知的。用于将重组dna构建体引入植物中的方法可以包括细菌介导的(或土壤杆菌属(agrobacterium)介导的)转化或用于转化的粒子轰击技术，这两种技术都是本领域技术人员所公知的。可用于将重组dna构建体引入植物中的另一种方法是通过定点整合的方法将重组dna构建体插入植物基因组中预先确定的位点处。定点整合可以通过本领域已知的任何方法完成，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale内切核酸酶或rna指导的内切核酸酶(例如，crispr/cas9系统)与模板dna的组合以在所需的靶位点进行基因组插入。因此，定点整合可以用于在基因组中的所需位置处引入转基因。用于培养外植体和植物部分的方法以及在培养中选择和再生植物的方法也是本领域已知的。

可以通过用于植物细胞、组织或外植体的任何已知培养方法从转化的植物细胞、组织或植物部分发育或再生转基因植物。可以通过使含有单一转基因等位基因的转基因植物与其自身(例如r0植物)自花授粉(自交)以产生r1种子来获得关于转基因纯合(也就是说，转基因的两个等位基因拷贝)的转基因植物。可以使用允许区分杂合子、纯合子和野生型的任何已知的接合性测定(如通过使用snp测定、dna测序、热扩增或pcr和/或dna印迹法)来测试转基因后代(如从r1种子生长的植物)的接合性。

如本文所提供的含有新的性状组合的植物和后代可以与本领域公知的任何育种方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可以是遗传连锁的或独立分离的，而包含三种或更多种转基因性状的植物系可以包含连锁性状和独立分离的性状两者。通常用于不同性状和农作物的育种或杂交植物的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以通过回交转化实现转基因性状、等位基因或遗传基因座向植物基因型的基因渗入。转基因性状已经基因渗入其中的植物基因型可以称为回交转化的基因型、细胞系、近交或杂种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可以称为未转化的基因型、细胞系、近交或杂种。

本公开的多个方面可以作为通过有性繁殖杂交植物的替代方案用于育种或基因渗入工作，以允许在组合产物细胞中将遗传性状和/或细胞组分进行组合，所述组合产物细胞可以发育或再生为具有所需的性状组合或引入的植物。可以基于一种或多种标记物、性状或表型的存在来鉴定或选择此类植物。为了证实植物、其植物部分或种子或后代(如从如本文所提供的组合产物细胞再生的植物或其植物部分、种子或后代)中一种或多种转基因、一种或多种突变或其他一种或多种性状的存在，可以进行和使用多种测定。此类测定可以包括例如分子生物学测定，如dna印迹法和rna印迹法、pcr和dna测序；生物化学测定，如例如通过免疫学手段(elisa和蛋白质印迹法)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶子或根测定；以及还有通过分析完整植株的表型或性状。

基因编辑和重组

根据本发明方法在混合细胞培养物中的细胞之间转移细胞质物质和组分的能力提供了将存在于一种植物细胞的细胞质或胞质溶胶中的rna、蛋白质和/或其他分子或因子转移至另一种植物细胞的可能性。来自供体细胞的这些分子可以转移至受体细胞的细胞质，而不改变或插入受体细胞的基因组dna中。因此，可以根据本发明方法将rna和/或蛋白质从供体细胞转移至受体细胞，并对受体细胞产生活性、影响或改变。转移的rna、蛋白质或其他分子可能仅短暂存在，因为编码rna或蛋白质的基因可能没有转移至受体细胞，并且受体细胞可能不制造或产生其他分子。因此，rna、蛋白质或其他分子可能仅在受体细胞中存在有限的时间，这取决于转移后其在受体细胞中的起始浓度及其在受体细胞中的稳定性或半衰期。

如下文实施例3中所证明的，产生了混合玉米细胞群体，其包含一组表达cre重组酶的细胞和另一组包含具有位于间插序列的侧翼的lox位点的gfp报告基因构建体的细胞，所述gfp报告基因构建体将在通过作用于lox位点的cre酶切除间插序列时表达gfp。在该实验中，在损伤细胞后产生了阳性gfp克隆，这表明由于cre重组酶从供体细胞转移至受体细胞而在细胞中产生了重组事件。该结果可以通过表达cre的转基因从供体细胞转移至受体细胞来解释，所述表达cre的转基因然后可以在受体细胞中短暂地表达或稳定地整合到受体细胞基因组中。可选地或另外地，由供体细胞中的转基因表达的cre重组酶可以已经转移至受体细胞，在其中所述cre重组酶作用于受体细胞中的lox位点，而表达cre的转基因不转移至受体细胞。

在不将编码rna和/或蛋白质的一种或多种转基因转化、整合或掺入受体细胞基因组中的情况下将所述rna和/或蛋白质递送至受体细胞的能力使得可以通过从供体细胞递送rna和/或蛋白质对非转基因受体细胞基因组进行改变(即，不用转基因转化受体细胞的基因组)。与cre重组酶类似，其他的酶可以在供体细胞中表达并递送至受体细胞以对受体细胞dna进行改变。根据一些实施方案，位点特异性核酸酶(如锌指核酸酶、大范围核酸酶、rna指导的核酸酶、tale核酸酶、重组酶、转座酶或其任何组合)可以在供体细胞中表达并经由本公开的方法转移至受体细胞，所述方法可以涉及损伤包含供体和受体细胞的混合物的细胞。在一些实施方案中，rna指导的核酸酶是crispr相关核酸酶(crispr相关核酸酶的非限制性实例包括例如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、casx、casy、其同源物或其修饰形式)。在一些实施方案中，供体细胞表达rna指导的核酸酶和指导rna两者，它们被递送至受体细胞以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，供体细胞表达rna指导的核酸酶，其被递送至表达指导rna的受体细胞，所述指导rna与所述rna指导的核酸酶复合以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，供体细胞表达指导rna，其被递送至表达rna指导的核酸酶的受体细胞，所述rna指导的核酸酶与所述指导rna复合以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，供体细胞还可以包含供体dna序列。在一些实施方案中，供体dna序列是模板化编辑的模板。在其他实施方案中，供体dna序列包含转基因。通过将位点特异性核酸酶从供体细胞转移至受体细胞而产生的编辑的产物细胞可以再生为在其基因组中具有所述编辑的植物，并且还可以从再生植物衍生后代植物、植物部分和种子。在许多实施方案中，除了由基因组编辑或突变引起的任何一种或多种性状和/或一种或多种表型以外，从编辑的产物细胞再生的植物可以在遗传上和表型上类似于从中衍生受体细胞的植物。

根据这些实施方案中的许多实施方案，提供了用于编辑植物细胞的方法，其包括：使第一植物细胞培养物和第二植物细胞培养物混合以获得混合细胞培养物，其中所述第一植物细胞培养物的一种或多种细胞包含含有与第一启动子可操作地连接的编码位点特异性核酸酶的序列的重组dna转基因；和损伤所述混合细胞培养物的细胞以产生具有通过所述位点特异性核酸酶在其基因组中引入的编辑或突变的至少一种编辑的产物细胞。此类方法也可以包括筛选或选择所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞、或者具有所述编辑或突变的从所述至少一种编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物，所述筛选或选择可以基于分子测定或通过编辑或突变产生的并且存在于从编辑的产物细胞或其后代细胞发育或再生的植物中或存在于其后代植物、植物部分或种子中的性状或表型。在这些方法中，第一和第二植物细胞培养物可以是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。这些方法还可以包括从所述混合细胞培养物和/或所述至少一种编辑的产物细胞或其至少一种后代细胞再生植物。这些方法中使用的植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

根据一些实施方案，这些方法中第一植物细胞培养物的一种或多种细胞还可以包含含有与启动子可操作地连接的编码指导rna分子的第一可转录dna序列的第一重组dna构建体。根据一些实施方案，这些方法中第一植物细胞培养物的一种或多种细胞还可以包含含有与启动子可操作地连接的编码供体模板分子的第二可转录dna序列的第二重组dna构建体。根据一些实施方案，这些方法中第二植物细胞培养物的一种或多种细胞还可以包含含有与启动子可操作地连接的编码指导rna分子的第一可转录dna序列的第一重组dna构建体。根据一些实施方案，这些方法中第二植物细胞培养物的一种或多种细胞还可以包含含有与启动子可操作地连接的编码供体模板分子的第二可转录dna序列的第二重组dna构建体。

还提供了通过这些方法产生的编辑的植物细胞及其后代细胞，其可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，并且它们可以各自进一步发育或再生为编辑的植物。还提供了发育或再生植物的种子或植物部分或其后代植物。另外，还提供了通过这些方法产生的植物细胞的混合细胞培养物，其可以是受损混合细胞培养物。

本文提供的位点特异性核酸酶可以选自由以下组成的组：锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的内切核酸酶、tale内切核酸酶(talen)、重组酶、转座酶或其任何组合。参见例如khandagale,k.等人,“genomeeditingfortargetedimprovementinplants,”plantbiotechnolrep10:327-343(2016)；和gaj,t.等人,“zfn,talenandcrispr/cas-basedmethodsforgenomeengineering,”trendsbiotechnol.31(7):397-405(2013)，将所述参考文献的内容和公开内容通过引用并入本文。重组酶可以是与dna识别基序连接的丝氨酸重组酶、与dna识别基序连接的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可以是与dna结合结构域连接的dna转座酶或重组酶。与dna识别基序连接的酪氨酸重组酶可以选自由以下组成的组：cre重组酶、flp重组酶和tnp1重组酶。根据一些实施方案，cre重组酶或gin重组酶可以与锌指dna结合域拴系。在另一个实施方案中，本文提供的与dna识别基序连接的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：phic31整合酶、r4整合酶和tp-901整合酶。在另一个实施方案中，本文提供的与dna结合结构域连接的dna转座酶选自由以下组成的组：tale-piggybac和tale-mutator。

根据本公开的实施方案，rna指导的内切核酸酶可以选自由以下组成的组：cas9或cpf1。根据本公开的其他实施方案，rna指导的内切核酸酶可以选自由以下组成的组：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、casx、casy及其同源物和修饰形式、argonaute(argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(thermusthermophilus)argonaute(ttago)、强烈火球菌(pyrococcusfuriosus)argonaute(pfago)、格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)argonaute(ngago)及其同源物或修饰形式)。根据一些实施方案，rna指导的内切核酸酶可以是cas9或cpf1酶。对于rna指导的内切核酸酶，还可以提供指导rna(grna)分子以经由碱基配对或杂交将内切核酸酶引导至植物基因组中的靶位点，以在靶位点处或附近引起dsb或切口。grna可以作为grna分子或作为重组dna分子、构建体或载体转化或引入植物细胞或组织中，所述重组dna分子、构建体或载体包含与启动子或植物可表达的启动子可操作地连接的编码指导rna的可转录dna序列。启动子可以是组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。如本领域所理解的，“指导rna”可以包含例如crisprrna(crrna)、单链指导rna(sgrna)或可以将内切核酸酶指导或引导至基因组中特定靶位点的任何其他rna分子。“单链指导rna”(或“sgrna”)是包含通过接头序列共价连接tracrrna的crrna的rna分子，其可以表达为单一rna转录物或分子。指导rna包含与植物基因组内的靶位点(如在基因处或附近)相同或互补的指导或靶向序列。前间隔相邻基序(protospacer-adjacentmotif，pam)可以存在于基因组中，紧接在与指导rna的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5’端且在其上游-即，紧接在基因组靶位点(相对于指导rna的靶向序列)的有义(+)链的下游(3’)，如本领域中已知。参见例如wu,x.等人,“targetspecificityofthecrispr-cas9system,”quantbiol.2(2):59-70(2014)，将其内容和公开内容通过引用并入本文。与靶位点(相对于指导rna的靶向序列)相邻的有义(+)链上的基因组pam序列可以包含5’-ngg-3’。然而，指导rna的相应序列(即，紧接在指导rna的靶向序列的下游(3’))通常可以不与基因组pam序列互补。指导rna通常可以是不编码蛋白质的非编码rna分子。指导rna的指导序列的长度可以是至少10个核苷酸，如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸或17-25个核苷酸，或长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。指导序列可以与基因组靶位点处的dna序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补。

除了指导序列之外，指导rna还可以包含一个或多个其他结构或支架序列，其可以与rna指导的内切核酸酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可以与其他rna分子(例如，tracrrna)相互作用。使用rna指导的内切核酸酶设计用于在植物基因组内的靶位点处进行基因组编辑和定点整合的靶向构建体和指导rna的方法和技术是本领域已知的。

几种位点特异性核酸酶(如重组酶、锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶和talen)不是rna指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定其引起dsb或切口的靶位点，或者它们与dna结合蛋白结构域或基序融合、拴系或连接。位点特异性核酸酶(或融合/连接/拴系的dna结合结构域)的蛋白质结构可以将位点特异性核酸酶靶向至靶位点。根据这些实施方案中的许多实施方案，可以根据已知方法设计、工程化和构建非rna指导的位点特异性核酸酶(如重组酶、锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶和talen)以靶向和结合植物的内源基因的基因组基因座处或附近的靶位点，以在这个基因组基因座处产生dsb或切口，从而经由通过细胞修复机制(其可以通过供体模板分子指导)修复dsb或切口(这可以导致产生dsb或切口的位点处序列的突变或插入)来敲除或敲低基因的表达。

在一个方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可以包括使用重组酶。在一些实施方案中，与dna识别结构域或基序连接等的酪氨酸重组酶可以选自由以下组成的组：cre重组酶、flp重组酶和tnp1重组酶。在一个方面，本文提供的cre重组酶或gin重组酶可以与锌指dna结合结构域拴系。flp-frt定点重组系统可以来自面包酵母酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的2μ质粒。在该系统中，flp重组酶(翻转酶)可以重组翻转酶识别靶(frt)位点之间的序列。frt位点包含34个核苷酸。flp可以与frt位点的“臂”(一个臂处于反向)结合并且在间插核酸序列的任一端切割frt位点。切割后，flp可以重组两个frt位点之间的核酸序列。cre-lox是衍生自噬菌体p1的定点重组系统，其类似于flp-frt重组系统。cre-lox可以用于使核酸序列倒位、使核酸序列缺失或使核酸序列易位。在该系统中，cre重组酶可以重组一对lox核酸序列。lox位点包含34个核苷酸，其中前13个核苷酸和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组过程中，cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合并在lox位点处切割。将切割的核酸接合在一起(相互易位)并完成重组。在另一个方面，本文提供的lox位点是loxp、lox2272、loxn、lox511、lox5171、lox71、lox66、m2、m3、m7或m11位点。

zfn是由与可以衍生自限制性内切核酸酶(例如，foki)的切割结构域(或切割半结构域)融合的工程化锌指dna结合结构域组成的合成蛋白质。dna结合结构域可以是经典的(c2h2)或非经典的(例如，c3h或c4)。根据靶位点，dna结合结构域可以包含一个或多个锌指(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锌指)。dna结合结构域中的多个锌指可以通过一个或多个接头序列分隔开。zfn可以设计成通过修饰锌指dna结合结构域来切割几乎任何一段双链dna。zfn从由与工程化为结合靶位点dna序列的包含锌指阵列的dna结合结构域融合的非特异性dna切割结构域(例如，衍生自foki核酸酶)组成的单体形成二聚体。zfn的dna结合结构域通常可以由3-4个(或更多个)锌指组成。可以对有助于与靶位点的位点特异性结合的相对于锌指α-螺旋的起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸进行改变和定制以适应特定的靶序列。其他氨基酸可以形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的zfn。用于设计zfn以靶向和结合特定靶序列的方法和规则是本领域已知的。参见例如美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062，将所述专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。foki核酸酶结构域可能需要二聚化以切割dna，因此需要两种zfn与其c末端区域来结合切割位点的相对dna链(相隔5-7bp)。如果双zf结合位点是回文的，则zfn单体可以切割靶位点。如本文所用，zfn是广义的并且包括可以在没有另一种zfn的帮助下切割双链dna的单体zfn。术语zfn还可以用于指工程化为共同作用以在相同位点处切割dna的一对zfn中的一个或两个成员。

不受任何科学理论的限制，由于锌指结构域的dna结合特异性可以使用多种方法中的一种再工程化，因此理论上可以将定制的zfn构建成靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的基因处或附近)。用于工程化锌指结构域的公开可用的方法包括上下文依赖组装(context-dependentassembly，coda)、寡聚体库工程(oligomerizedpoolengineering，open)和模块化组装(modularassembly)。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种zfn。在另一个方面，本文提供的zfn能够产生靶向dsb或切口。

通常在微生物中鉴定出的大范围核酸酶(如归巢内切核酸酶的laglidadg家族)是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶dna的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式通常具有延长的dna识别序列(例如，14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可以包含选自由以下组成的组的支架或碱基酶：i-crei、i-ceui、i-msoi、i-scei、i-anii和i-dmoi。大范围核酸酶的工程化可能比zfn和talen更具挑战性，因为大范围核酸酶的dna识别和切割功能交织在单个结构域中。已经使用专门的诱变和高通量筛选方法来产生新的大范围核酸酶变体，其识别独特序列并具有改善的核酸酶活性。因此，大范围核酸酶可以被选择或工程化为与植物中的基因组靶序列(如基因的基因组基因座处或附近)结合。在另一个方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向dsb。

talen是通过将转录激活因子样效应物(tale)dna结合结构域与核酸酶结构域(例如，foki)融合而产生的人工限制酶。当talen对的每个成员与靶位点侧翼的dna位点结合时，foki单体二聚化并在靶位点处引起双链dna断裂。除了野生型foki切割结构域外，已经设计出具有突变的foki切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。foki结构域起二聚体的作用，需要两个构建体，其具有针对在靶基因组中具有适当的方向和间距的位点的独特dna结合结构域。talendna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独talen结合位点之间的碱基数都是实现高水平活性的参数。

talen是通过将转录激活因子样效应物(tale)dna结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。在一些方面，核酸酶选自由以下组成的组：pvuii、muth、tevi、foki、alwi、mlyi、sbfi、sdai、stsi、cledorf、clo051和pept071。当talen对的每个成员与靶位点侧翼的dna位点结合时，foki单体二聚化并在靶位点处引起双链dna断裂。如本文所用，术语talen是广义的并且包括可以在没有另一种talen的帮助下切割双链dna的单体talen。术语talen还指共同作用以在相同位点处切割dna的一对talen的一个或两个成员。

转录激活因子样效应物(tale)可以工程化为结合几乎任何dna序列，如在植物中基因的基因组基因座处或附近。tale具有由13-28个33-34个氨基酸的重复单体组成的中心dna结合结构域。除了位置12和13处的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都是高度保守的。这两个可变氨基酸称为重复可变双残基(rvd)。rvd的氨基酸对ni、ng、hd和nn分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且rvd的调节可以识别连续的dna碱基。氨基酸序列与dna识别之间的这种简单关系已经允许通过选择含有适当rvd的重复区段的组合来工程化特定dna结合结构域。

除了野生型foki切割结构域外，已经设计出具有突变的foki切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。foki结构域起二聚体的作用，需要两个构建体，其具有针对在靶基因组中具有适当的方向和间距的位点的独特dna结合结构域。talendna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独talen结合位点之间的碱基数都是实现高水平活性的参数。pvuii、muth和tevi切割结构域是与tale一起使用的foki和foki变体的有用替代物。当与tale偶联时，pvuii作为高度特异性切割结构域起作用(参见yank等人2013.plosone.8:e82539)。muth能够在dna中引入链特异性切口(参见gabsalilow等人2013.nucleicacidsresearch.41:e83)。tevi在dna中的靶向位点处引入双链断裂(参见beurdeley等人,2013.naturecommunications.4:1762)。

tale结合结构域的氨基酸序列与dna识别之间的关系允许可设计的蛋白质。软件程序(如dnaworks)可以用于设计tale构建体。设计tale构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见doyle等人,nucleicacidsresearch(2012)40:w117-122.；cermak等人,nucleicacidsresearch(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。在另一个方面，本文提供的talen能够产生靶向dsb。

根据一些实施方案，供体模板也可以由供体细胞表达，并被递送至受体细胞，以用作在通过位点特异性核酸酶在受体细胞基因组中引入双链断裂(dsb)或切口后产生的所需编辑的模板。可选地，供体模板可以由受体细胞表达。类似地，对于rna指导的核酸酶，表达指导rna(grna)的可转录dna序列或转基因也可以在供体细胞中存在和表达，并且被递送至受体细胞，以用作rna指导的核酸酶的指导rna以引导rna指导的核酸酶在受体细胞基因组中的所需基因座或靶位点处形成双链断裂(dsb)或切口。可选地，指导rna(grna)可以由受体细胞表达。根据其他实施方案，(i)位点特异性核酸酶、指导rna和供体模板可以全部由供体细胞表达并被转移至受体细胞；或者(ii)位点特异性核酸酶和/或指导rna可以由供体细胞表达并被转移至受体细胞，并且供体模板可以任选地在受体细胞中表达；或者(iii)位点特异性核酸酶和/或供体模板可以由供体细胞表达并被转移至受体细胞，并且指导rna可以任选地在受体细胞中表达；或者(iv)指导rna和/或供体模板可以由供体细胞表达并被转移至受体细胞，并且位点特异性核酸酶可以在受体细胞中表达，在(i)、(ii)、(iii)或(iv)的每种情况下，以在受体细胞基因组中的所需基因座或靶位点处形成双链断裂(dsb)或切口，以在受体细胞的基因组中的所需位置处产生模板化或非模板化编辑或突变。

可以潜在地选择植物基因组内的任何位点或基因座用于进行转基因、构建体或可转录dna序列的基因组编辑(或基因编辑)或定点整合。对于基因组编辑和定点整合，可以首先使用位点特异性核酸酶(例如像锌指核酸酶(zfn)、工程化或天然大范围核酸酶、tale内切核酸酶或rna指导的内切核酸酶(例如，cas9或cpf1))在选择的基因组基因座处形成双链断裂(dsb)或切口。可以使用本领域已知的用于定点整合的任何方法。在具有插入序列的供体模板分子的存在下，dsb或切口可以通过供体模板与植物基因组的一个或多个同源臂之间的同源重组来修复，或者通过非同源末端连接(nhej)来修复，从而导致将插入序列定点整合到植物基因组中以在dsb或切口的位点处产生靶向插入事件。因此，如果转基因、可转录dna序列、构建体或序列位于供体模板的插入序列中，则可以实现所述转基因、可转录dna序列、构建体或序列的位点特异性插入或整合。

dsb或切口的引入也可以用于在植物的基因组中引入靶向突变。根据该方法，可以经由dsb或切口的不完全修复在靶位点处引入突变(如缺失、插入、倒位和/或取代)，以产生基因的敲除或敲低。即使不使用供体模板分子，也可以通过靶向基因座的不完全修复产生此类突变。基因的“敲除”可以通过在基因的内源基因座处或附近诱导dsb或切口来实现，所述dsb或切口导致蛋白质的不表达或非功能性蛋白质的表达；而基因的“敲低”能以类似的方式通过在基因的内源基因座处或附近诱导dsb或切口来实现，所述dsb或切口在不以消除所编码蛋白质的功能的方式影响基因的编码序列的位点处不完全修复。例如，内源基因座内的dsb或切口的位点可以在基因的上游或5’区域(例如，启动子和/或增强子序列)以影响或降低其表达水平。类似地，可以用供体模板分子产生基因的此类靶向敲除或敲低突变，以经由修复dsb或切口在靶位点处或附近引导特定或所需的突变。供体模板分子可以包含具有或不具有插入序列并且含有相对于dsb或切口的位点处或附近的靶向基因组序列的一种或多种突变(如一种或多种缺失、插入、倒位和/或取代)的同源序列。例如，可以通过使至少一部分基因缺失或倒位或者通过将读框移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现基因的靶向敲除突变。还可以通过在两个靶位点产生dsb或切口并引起侧翼为靶位点的间插靶区域的缺失来引入基因的一部分的缺失。

如本文所用，可以是重组多核苷酸、dna或rna供体模板的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为具有用于经由植物细胞基因组中的切口或双链dna断裂的修复而定点、靶向插入或重组至植物细胞的基因组中的核酸模板或插入序列的核酸分子。例如，“供体模板”可以用于转基因或抑制构建体的定点整合，或者作为模板将突变(如插入、缺失、取代等)引入植物基因组内的靶位点中。本文提供的靶向基因组编辑技术可以包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种供体分子或模板。“供体模板”可以是单链或双链dna或rna分子或质粒。供体模板的“插入序列”是设计用于靶向插入植物细胞基因组中的序列，其可以具有任何合适的长度。例如，供体模板的插入序列的长度可以是在2与50,000个之间、在2与10,000个之间、在2与5000个之间、在2与1000个之间、在2与500个之间、在2与250个之间、在2与100个之间、在2与50个之间、在2与30个之间、在15与50个之间、在15与100个之间、在15与500个之间、在15与1000个之间、在15与5000个之间、在18与30个之间、在18与26个之间、在20与26个之间、在20与50个之间、在20与100个之间、在20与250个之间、在20与500个之间、在20与1000个之间、在20与5000个之间、在20与10,000个之间、在50与250个之间、在50与500个之间、在50与1000个之间、在50与5000个之间、在50与10,000个之间、在100与250个之间、在100与500个之间、在100与1000个之间、在100与5000个之间、在100与10,000个之间、在250与500个之间、在250与1000个之间、在250与5000个之间或在250与10,000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可以具有至少一个同源序列或同源臂(如两个同源臂)，以引导突变或插入序列经由同源重组整合到植物基因组内的靶位点中，其中同源序列或一个或多个同源臂与植物基因组内的靶位点处或附近的序列相同或互补，或者具有同一性百分比或互补性百分比。当供体模板包含一个或多个同源臂和插入序列时，所述一个或多个同源臂将侧接或包围供体模板的插入序列。

供体模板的插入序列可以包含一种或多种基因或序列，其各自编码转录的非编码rna或mrna序列和/或翻译的蛋白质序列。供体模板的转录序列或基因可以编码蛋白质或非编码rna分子。供体模板的插入序列可以包含不含有功能性基因或整个基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可以仅仅包含调节序列(如启动子序列)或仅包含基因或编码序列的一部分)，或者可以不包含任何可识别的基因表达元件或任何活跃地转录的基因序列。此外，供体模板可以是线性的或环状的，并且可以是单链或双链的。供体模板可以作为由转基因表达的rna分子递送至细胞。供体模板也可以作为裸核酸(例如，经由粒子轰击)、作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白质、泊洛沙姆、用蛋白质包封的t链等)的复合物、或包含在细菌或病毒递送运载体(分别是例如像根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)或双生病毒)中而被递送至细胞。本文提供的供体模板的插入序列可以包含可转录成rna分子的可转录dna序列，其可以是非编码的，并且可以与或不与启动子和/或其他调节序列可操作地连接。

根据一些实施方案，供体模板可以不包含插入序列，而是包含一种或多种同源序列，其包括相对于植物基因组内的靶位点处(如植物基因组内的基因处或附近)的基因组序列的一种或多种突变(如插入、缺失、取代等)。可选地，供体模板可以包含插入序列，其不包含编码或可转录dna序列，其中插入序列用于将一种或多种突变引入植物基因组内的靶位点中(如在植物基因组内的基因处或附近)。

本文提供的供体模板可以包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种基因或可转录dna序列。可选地，供体模板可以不包含基因。在不受限制的情况下，供体模板的基因或可转录dna序列可以包括例如杀虫剂抗性基因、除草剂耐受基因、氮素利用效率基因、水利用效率基因、产量提高基因、营养质量基因、dna结合基因、可选择的标记基因、rnai或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、crispr/cas9系统的单指导rna、基于双生病毒的表达盒或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可以包含蛋白质编码序列或编码非编码rna分子的可转录dna序列，所述非编码rna分子可以靶向内源基因以加以抑制。供体模板可以包含启动子，如组成型启动子、组织特异性或组织优选性启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。供体模板可以包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5’-utr、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3’-utr和/或多腺苷酸化信号。前导序列、增强子和/或启动子可以与编码非编码rna、指导rna、mrna和/或蛋白质的基因或可转录dna序列可操作地连接。

根据本发明实施方案，可以将重组供体模板多核苷酸分子的一部分(即，插入序列)插入或整合在植物基因组内的所需位点或基因座处。供体模板的插入序列可以包含转基因或构建体，如编码靶向内源基因以加以抑制的非编码rna分子的转基因或可转录dna序列。供体模板还可以在插入序列侧翼具有一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复来促进靶向插入事件。每个同源臂可以与植物细胞基因组内的靶dna序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补。因此，植物细胞可以包含重组dna分子，其编码用于将转基因或构建体(如编码靶向内源基因以加以抑制的非编码rna分子的转基因或可转录dna序列)定点或靶向整合到植物基因组中的供体模板。

如本文所用，用于基因组编辑或定点整合的“靶位点”是指植物基因组内多核苷酸序列的如下位置，其被位点特异性核酸酶结合并切割，从而将双链断裂(或单链切口)引入多核苷酸序列和/或其互补dna链的核酸骨架中。靶位点可以包含至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少29或至少30个连续核苷酸。rna指导的核酸酶的“靶位点”可以包含靶位点处双链核酸(dna)分子或染色体的任一互补链的序列。位点特异性核酸酶可以与靶位点结合，如经由非编码指导rna(例如但不限于如下文进一步描述的crisprrna(crrna)或单指导rna(sgrna))结合。本文提供的非编码指导rna可以与靶位点互补(例如，与靶位点处双链核酸分子或染色体的任一链互补)。应当理解，非编码指导rna与靶位点结合或杂交可能不需要完全同一性或互补性。例如，可以容忍靶位点与非编码rna之间的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个(或更多个)错配。“靶位点”还指植物基因组内多核苷酸序列的如下位置，其被可能不通过非编码rna分子指导的另一种位点特异性核酸酶(如大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或转录激活因子样效应物核酸酶(talen))结合并切割，以将双链断裂(或单链切口)引入多核苷酸序列和/或其互补dna链中。

如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧翼为两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。在不受限制的情况下，在一些实施方案中，靶区域可以经历突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，“侧翼为”当用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时，是指多核苷酸序列或分子中靶区域周围的两个或更多个靶位点，其中在靶区域的每一侧具有一个靶位点。

实施例

包括以下实施例以证明本公开的某些实施方案。本领域技术人员应该理解，以下这些实施例代表可以在本发明方法和实施方案的实践中使用的技术和方法。然而，本领域技术人员根据本公开应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以对本文公开的特定实施方案进行许多修改、改变和替换以获得类似的结果。

实施例1：通过细胞融合在烟草中将质体从供体系转移至受体系。

a.用于质体转移的供体系和受体系的建立

质体供体系普通烟草变种petithavana(nicotianatabacumvar.petithavana)(细胞系#30125)如所描述(参见sidorov等人,plantjournal,19:209-216,1999)用质体基因组中含有aada基因(赋予壮观霉素/链霉素抗性)和gfp标记基因的重组dna构建体建立。

质体受体系普通烟草变种samsun(细胞系#42061)是通过经由土壤杆菌属介导的转化用细胞核基因组中含有nptii基因(赋予卡那霉素或巴龙霉素抗性)和gus标记基因的重组dna构建体转化其细胞核基因组建立的。

使质体转化体细胞系#30125(aada/gfp)和细胞核转化体细胞系#42061(nptii/gus)的种子在具有相应抗生素选择的培养基上发芽并检查抗性基因即aada或nptii(图1)和可筛选的标记基因即gfp或gus(图2)的表达。

如图1所示，细胞系#30125的发芽种子对壮观霉素(标记为sp)或壮观霉素加链霉素(标记为sp/str)具有抗性，而对巴龙霉素(标记为par)敏感。细胞系#42061的发芽种子对巴龙霉素具有抗性，而对sp或sp/str敏感。由这些细胞系产生的愈伤组织细胞也对相应的抗生素具有抗性。还证实，选择的植物和愈伤组织如图7所示还分别包含gus或gfp(参见下文)。

b.质体转移的培养条件

将两种细胞系的种子用5％市售漂白剂灭菌，并使其在不含植物生长调节剂的ms(murashige和skoog，1962)培养基上发芽。在具有1mg/lba(6-苄氨基嘌呤)和1mg/lnaa(1-萘乙酸)的ms培养基上诱导供体系和受体系两者的愈伤组织，并且具有1mg/lba和0.1mg/lnaa的ms培养基随后用于植物的再生。

发现愈伤组织对测试的抗生素的敏感性低于发芽种子或植物。例如，来自细胞系#30125的愈伤组织在400mg/lpar和更高浓度下被抑制。因此，在具有400-500mg/lpar+400-500mg/lsp的培养基上使用愈伤组织细胞进行选择。

c.受损混合愈伤组织培养物和细胞融合物的产生

将从供体系和受体系两者诱导的愈伤组织混合在一起，并用剃须刀片将其切成细小碎片。该程序产生受损混合细胞培养物。将一丛紧密的愈伤组织混合物置于具有par和sp两者(400mg/lpar+400mg/lsp)的选择培养基上。在该实验中，选择对par和sp都具有抗性的四个绿色细胞系。名称为#iii、#iv、#k和#m的四种选择的细胞系对gfp和gus染色也均呈阳性。例如，#iii和#iv细胞系中gus的表达以及#iv细胞系中gfp的表达示于图3中。对par和sp两者的抗性以及gfp和gus标记物的存在表明选择的细胞是融合的产物细胞，其具有来自两种亲本细胞(供体和受体)的性状的组合。如下文进一步详述的，从这四种选择的细胞系再生表型上正常的植物。再生植物是可育的并且具有存在于细胞系中的性状的组合，其包括sp/par抗性和gus/gfp表达。在从种子生长的后代植物中也保留并观察到这些性状。

在一个实验中，还分离了对高浓度的巴龙霉素和壮观霉素具有抗性的叶绿素缺陷细胞系(细胞系#a)。在几次传代培养后鉴定出来自细胞系#a的绿色愈伤组织的形成，并且稍后再生了正常植物。然而，该细胞系不具有gfp表达并且是壮观霉素抗性的而对链霉素敏感(数据未示出)。

d.对来自细胞组合或转移的选择的植物的分析

从所有选择的细胞系再生并在生长室中生长至成熟的植物具有与受体系#42061类似的正常形态(从细胞系#iv再生的植物参见图4)。共聚焦显微术用于证实分离自从选择的细胞系再生的植物的叶肉原生质体的质体中的gfp表达。细胞系#iv的分离的原生质体中的代表性gfp表达示于图5中，其表明质体编码的遗传性状是从供体细胞转移的。用于分析四种产生的细胞系的倍性水平的分离的原生质体的流式细胞术表明，样品之间dna的量不存在差异。与亲本和野生型对照相比的来自针对细胞系#m细胞的流式细胞术实验的代表性数据示于图6中。

e.对细胞融合后产生事件中的叶绿体的分子分析

根据已知方法(参见wang等人,nar21:4153-4154,1993)在1.5-mleppendorf管中从再生自选择的#iii、#iv、#k和#m细胞系的单独植物以及单独供体、受体和野生型植物收集新鲜的叶子材料并使用微型研杵研磨。简而言之，向每mg组织中添加10μl0.5nnaoh，并使用微型研杵研磨样品直至没有大块组织残留。将2μl的每种样品快速转移至含有100μl的ph8.0的100mmtris的新管中，并充分混合。使样品在pcr机上在99℃下变性5分钟并在冰上储存。将1μl样品直接用于25μlpcr反应。在该实验中使用以下pcr程序：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环。热启动高保真dna聚合酶(neb目录号m0493s)用于所有pcr。

以下基因特异性引物用于gus、gfp、aada和nptii基因检测：

guspcr引物：扩增1067bpgus片段

5’aagactgtaaccacgcgtctg3’(gus正向)(seqidno:1)

5’attccatacctgttcaccgac3’(gus反向)(seqidno:2)

gfp引物：扩增741bp片段

5’atgtcaccacaaacagaggcc3’(gfp正向)(seqidno:3)

5’tcattatttgtagagctcatccatgc3’(gfp反向)(seqidno:4)

npt2引物：扩增790bp片段

5’gcatgattgaacaagatggattgcac3’(npt2正向)(seqidno:5)

5’gaactcgtcaagaaggcgatagaagg3’(npt2反向)(seqidno:6)

aada引物：扩增763bpaada片段

5’cgaagtatcgactcaactatcagag3’(aada正向)(seqidno:7)

5’gactaccttggtgatctcgcctttc3’(aada反向)(seqidno:8)

分子分析证明，与供体系和受体系以及野生型植物相比，在选择的#iii、#iv、#k和#m细胞系中存在所有四种基因，即nptii、aada、uida(gus)和gfp，如图7所示。该数据表明受体细胞接受了来自供体系的质体编码的性状。

f.对产生事件的遗传分析

对由上述选择的细胞系产生的五种植物进行遗传分析。将来自选择的#iii和#k选择的细胞系的植物与野生型烟草植物正反交，并针对对抗生素的抗性筛选后代植物(图8至图9)。还对#k选择的细胞系的自交后代进行遗传分析(图10)。这些分析证实了nptii/gus基因的孟德尔细胞核遗传和aada/gfp基因的母体遗传。因此，本发明的细胞融合方法(使用两种不同的选择标记物，即一种位于供体的质体组中而另一种位于受体细胞核基因组中)可以有效地用于将质体基因组从供体转移至受体细胞和植物。

实施例2：在烟草中通过细胞转移进行细胞核基因转移。

产生了两种转基因烟草植物系以证明在受损混合植物细胞培养物中通过细胞融合转移细胞核dna。普通烟草变种samsun系#42061是通过用包含nptii基因(赋予巴龙霉素抗性)和gus标记基因和提供对草甘膦抗性的epsps基因的重组dna构建体转化其细胞核基因组建立的。普通烟草变种petithavana系#138202是通过用含有aada基因(赋予链霉素和壮观霉素抗性)以及gfp和gus标记基因两者的重组dna构建体转化其细胞核基因组建立的。

检查用这些转基因转化的植物以证实它们相应的抗性基因的表达，如图11所示。检查细胞系#138202的植物的gfp表达，如图12所示。gfp位于细胞核和细胞质中。检查已建立的植物的相应抗性基因表达，如图11所示。检查细胞系#138202的植物的gfp表达，并且发现gfp位于细胞核和细胞质中，如图12所示。

a.用于细胞核基因转移的细胞损伤。

通过细胞组合、融合或转移进行了细胞核性状转移的研究。将来自每种亲本细胞系的约4-5g愈伤组织混合在一起，通过用剃须刀片切碎充分损伤，并将其以愈伤组织的紧密混合物的形式置于具有壮观霉素和巴龙霉素两者的选择培养基上。选择对巴龙霉素和壮观霉素均具有抗性的两种细胞系，并分离为具有来自两种亲本细胞系的遗传性状的组合的组合或融合产物细胞。

b.对来自细胞组合或转移的选择的植物的分析。

选择的细胞系#+8如图13所示呈gfp和gus阳性，而另一种选择的细胞系#9呈gus阳性但gfp阴性。再生植物的根尖用于分析染色体核型。细胞系#+8具有49条染色体，与野生型烟草属相似，这表明可能转移了细胞核植物基因组的一部分。然而，#9细胞系(gfp阴性)的dapi染色表明如图14所示的双倍量的染色体(约96条染色体)，这表明可能从#9细胞系产生了异源多倍体植物。核型分析结果表明，从#+8细胞系再生的植物可能含有有限量的来自供体(#42061)的遗传物质，而从细胞系#9再生的植物含有来自两种亲本的大部分或全部细胞核基因组。

鉴于在单个植物细胞、原生质体或植物中针对来自两种不同亲本细胞的标记物的存在进行选择和检测的能力，得出结论：使用来自一种或多种亲本植物细胞核基因组的选择和/或检测标记物的本文所述的细胞转移或组合方法可以用于在植物细胞和植物之间转移细胞核基因。图15显示再生的#+8植物的形态类似于亲本系#139202的形态。然而，来自#9的植物更类似于#42061，但不同之处在于前者具有更大且更厚的叶子和更大的重瓣花。这些再生植物的大多数雄蕊被转化为花瓣并且是非功能性的。这些植物的心皮较厚，但这些植物的花可以授粉。

在细胞系#9的后代中分析了来自两种亲本的不同抗性性状的基因遗传。由于细胞系#9的雄蕊是非功能性的，因此该细胞系用野生型普通烟草变种samsun授粉。收集来自该杂交的种子并在不同的选择培养基上进行测试。正如所预期的，所有来自杂交♀#9x♂野生型普通烟草变种samsun的发芽的种子在具有400mg/l壮观霉素、150mg/l巴龙霉素和0.2mm草甘膦的培养基上产生了绿色幼苗(图16)。这证明了在细胞系#9中存在来自该实验中使用的两种亲本的性状(壮观霉素、巴龙霉素和草甘膦抗性)，并证实产物细胞系#9确实是异源多倍体并且具有来自两种亲本的组合基因组。

实施例3：在玉米中通过细胞损伤和转移进行细胞核基因转移。

产生了在其细胞核基因组中具有重组dna构建体的转基因玉米系a，所述重组dna构建体在5'到3'方向上包含增强的camv35s启动子与在5'非翻译区中的hsp70内含子、侧翼为lox位点的nptii可选择的标记基因、接着是绿色荧光蛋白(gfp)基因(参见例如zhang等人,theor.appl.gen.107(7):1157-1168(2003))。由于35s启动子与gfp编码序列之间的间插nptii基因，gfp没有功能性表达。然而，在cre重组酶的存在下，由于侧翼的lox位点而切除了nptii基因，这通过将35s启动子和gfp编码序列接在一起而导致高水平的gfp表达，其可在大多数组织中可视化。使用本领域已知的方法从转基因玉米系a的未成熟胚产生胚性愈伤组织细胞(参见例如sidorov和duncan,methodsinmolecularbiology,第526卷,transgenicmaize.methodsandprotocols,humanapress(2009))。转基因玉米系b是用其细胞核基因组中存在的cre转基因建立的。胚性愈伤组织细胞也是如前所述从转基因系b的7日龄幼苗产生的(参见例如sidorov等人,plantcellrep.25:320-328(2006))。因此，在样品植物细胞中将表达nptii-gfp和cre的构建体组合将导致nptii基因被切除，以及可检测的gfp表达(参见图17a)。根据本发明实施方案，存在于不同细胞中的这些构建体可以通过本文所述的方法组合。

为了证明玉米细胞之间细胞核遗传物质的交换，将来自转基因玉米系a和b的约1.5g愈伤组织细胞切成细小碎片，挤成团块，并在28℃下黑暗中一起置于补充有0.5mg/l2,4-d和2.2mg/l毒莠啶的msw57培养基上(参见例如sidorov和duncan,2009，同上)。作为对照，将来自转基因玉米系a和b的相同量的愈伤组织混合但不进行损伤。使愈伤组织a和b混合物生长约2个月，每2周进行一次常规传代培养。如图17b所示，在来自经受损伤的混合培养物的板中鉴定出三种独立的gfp阳性细胞集落，这表明由于细胞组合或转移，在一些情况下来自愈伤组织a和b的细胞之间的物质交换将cre基因或表达产物带入具有nptii-gfp构建体的受体细胞中，从而引起nptii基因的切除和gfp编码序列的表达。在对照板中未发现gfp阳性集落。

尽管已经参考某些实施方案公开了本发明，但是清楚的是，在不脱离如本文所述和如所附权利要求所提供的本发明的精神和范围的情况下，可以进行修改和变化。此外，应该理解，尽管示出了本发明的实施方案，但是本公开中的所有实施例均被提供为非限制性实施例，因此不应将其视为限制如此示出的各个方面。本发明旨在具有由本公开、所附权利要求的语言及其任何等同物所限定的全部范围。因此，实施例、附图和具体实施方式应被认为是说明性的而不是限制性的。