用于胞外囊泡的溶血和凝血调节以及稳定化的组合物的制作方法
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本申请要求2017年10月19日提交的美国临时申请序列号62/574,515的权益，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
本教示内容涉及一种血液样品调节组合物。更具体地说，本教示内容涉及一种用于调节血液样品中的机制的组合物，使得血液样品内的组分保持足够的完整性以用于各种诊断指标的下游测试。
背景技术：
液体活检(例如，对来自人体的血液或其它液体样品的分析)的出现彻底改变产前医学和癌症诊断学。现在可从患者血液样品中分离且分析循环dna(cfdna或无细胞dna)(例如胎儿或癌症)、无细胞rna和循环肿瘤细胞。随着分析能力提高，液体活检分析必须考虑到相关的分析前变量，使得在敏感性和特异性方面将下游结果最大化。与液体活检样品采集相关的最关键的分析前变量中的一个为细胞和核酸稳定化，尤其考虑到与这些样品到达参考实验室相关的显著滞后时间。全血样品是用于液体活检研究的最有效的患者样品，然而，其受多个滞后时间因素的限制。这些当中最重要的是白细胞和红细胞/网织红细胞的脆弱性。具体地说，血液存储导致凋亡白细胞的基因组dna和劣化白细胞和网织红细胞的细胞rna的时间依赖性释放。对于基于pcr的液体活检分析，无细胞rna和dna的非特异性增加会稀释靶转录物(例如，突变致癌基因dna、胎儿dna等)。
尽管存在多种用于全血中的核酸稳定化的商购选择方案，但这些选择方案旨在用于稳定dna或rna，但不能同时稳定两种。专用于稳定无细胞dna的采集试管包括cell-free
期望提供一种收集装置和位于其中的基于抗凝剂调配物的组合物，其防止凝血且保持红细胞平均细胞体积(meancellvolume；mcv)，以致力于将溶血降到最小。组合物将优选地使白细胞组分稳定，从而阻断血浆内的dna释放和过量积累。组合物将进一步充当红细胞保护剂，其依据存储年限来保持红细胞结构完整性且防止膜囊泡的释放。这是至关重要的，因为循环或无细胞rna封装于膜囊泡中，包含微囊泡和胞外囊泡(包含但不限于外泌体)。所需组合物将在较宽的温度范围下保持样品稳定性和完整性最少6天。cfdna和膜囊泡以及cfrna的血浆浓度将理想地基本上保持抽取时间浓度。
技术实现要素：
本教示内容提供一种组合物，其维持红细胞mcv，基本上防止白细胞裂解且基本上防止胞外膜囊泡(例如，外泌体、核外粒体(ectosome)等)的释放。本文中所提供的方法旨在使白细胞和红细胞稳定，从而基本上防止核酸和膜囊泡从生物样品中的细胞释放。本公开的组合物为尤其适合于用作通过免疫分析、聚合酶链反应、下一代测序和/或其它进行下游分析的生物样品稳定试剂和调节试剂。
组合物可以包括一种或多种能够释放醛的组分、一种或多种抗凝剂或螯合剂和一种或多种多糖。组合物的ph可为约4到约6。
组合物可包含一种或多种胺。组合物可包含柠檬酸钠组合物。组合物可包含一种或多种甲醛供体。组合物可包含乙二胺四乙酸或其盐。组合物可包含转录抑制剂。组合物可包含放射菌素d、α-鹅膏菌素(alpha-amanitin)、夫拉平度(flavopiridol)、drp(5,6-二氯-1-β-d-呋喃核糖基-1h-苯并咪唑)和雷公藤甲素(triptolide)中的一种或任何组合。组合物可包含甲醛。组合物可基本上不含任何单独添加的甲醛。组合物可基本上不含乙二胺四乙酸。组合物可基本上不含肝素钠。多糖可选自淀粉、纤维素、糖原或其任何组合。
一种或多种能够释放醛的组分可选自：重氮利定脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-均三嗪、恶唑啶、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑啶-2,4-二酮、季铵盐-15、dmdm乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。组合物可包含咪唑烷基脲。组合物可包含咪唑烷基脲且可基本上不含任何能够释放醛的其它组分。组合物可包含重氮利定脲。组合物可包含咪唑烷基脲和重氮利定脲两种。组合物可包含2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇。
组合物可包含约0.1体积％到约1体积％的一种或多种多糖。在样品采集后存在的甲醛量可为约10ppm到约10,000ppm。
如果存在，那么胺可淬灭可获得的游离醛。样品稳定性可在约4℃到约50℃的温度范围下保持最少6天。在其它实施例中，样品稳定性在约2℃到约50℃、或约2℃到约37℃的温度范围下保持最少6天。cfdna和胞外囊泡以及cfrna的血浆浓度基本上类似于抽取时间浓度。可维持红细胞mcv，可基本上防止白细胞裂解且可基本上防止胞外囊泡(例如，外泌体)的释放。白细胞可基本上稳定，使得在抽血后第4天和第6天以及可能更长的时间恢复的外泌体的数量与在抽血时存在的外泌体群体基本上类似。可保持细胞形态和表面抗原表达，使得能够通过流式细胞测量术来进行白细胞的免疫表型。
还可有助于循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell；ctc)和肿瘤碎片的稳定和分离。还有助于测试生物样品内的多种组分，尤其当可分析多于一种血液组分以识别病况或疾病的存在、疾病的严重程度或疾病治疗的成功或失败的指标时。
本文中所描述的教示内容进一步提供一种使用本文中所描述的组合物的方法，其用于稳定白细胞和红细胞以基本上防止核酸和胞外囊泡从生物样品中的细胞内释放。
本文中的教示内容进一步提供一种使用本文中所描述的组合物的方法，其包含作为生物样品稳定试剂和调节试剂以通过免疫分析、聚合酶链反应、下一代定序和/或其它进行下游分析。本文中所描述的方法还可包含用组合物处理单一血液样品且从样品分离dna、rna、胞外囊泡、循环肿瘤细胞、循环罕见细胞和蛋白质中的多于一种。
本文中的教示内容进一步提供本文中所描述的组合物的用途，其用于从血液样品分离dna和rna。本文中的教示内容进一步提供本文中所描述的组合物的用途，其用于从血液样品分离胞外囊泡。本文中的教示内容进一步提供本文中所描述的组合物的用途，其用于分离循环肿瘤细胞/肿瘤碎片。
在某些方面，本公开提供一种组合物，其包括：(i)组分，其能够释放醛；(ii)抗凝剂；以及(iii)环糊精或其官能化衍生物。在一些实施例中，能够释放醛的组分为重氮利定脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-均三嗪、恶唑啶、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑啶-2,4-二酮、季铵盐-15、dmdm乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。在一些实施例中，能够释放醛的组分为咪唑烷基脲。在其它实施例中，能够释放醛的组分为重氮利定脲。在又另外的实施例中，能够释放醛的组分包括咪唑烷基脲和重氮利定脲。在一些实施例中，抗凝剂为基于柠檬酸盐的抗凝剂，其包括柠檬酸盐和右旋糖。在其它实施例中，基于柠檬酸盐的抗凝剂为抗凝剂柠檬酸盐右旋糖-a(acd-a)、抗凝剂柠檬酸盐右旋糖-b(acd-b)或柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(cpda)。在一些实施例中，基于柠檬酸盐的抗凝剂以约0.75％到约4％的浓度存在。在又其它实施例中，抗凝剂包括柠檬酸、柠檬酸三钠和右旋糖。在一些实施例中，右旋糖以约2％到约20％的浓度存在。在其它实施例中，柠檬酸盐离子浓度为约200mm到约500mm。在一些实施例中，柠檬酸以约0.5％到约4％的浓度存在。在其它实施例中，柠檬酸三钠以约3％到约15％的浓度存在。
在一些实施例中，能够释放醛的组分以约10％到约40％的浓度存在。在其它实施例中，环糊精为α-环糊精或其官能化衍生物。在一些实施例中，α-环糊精以约0.75％到约4％的浓度存在。
在一些实施例中，组合物进一步包括甲醛。在其它实施例中，组合物不含单独添加的甲醛。
在其它实施例中，样品稳定性在约2℃到约37℃的温度范围下保持最少1天。在一些实施例中，样品稳定性在约2℃到约37℃的温度范围下保持约1天到最多8天。
在一些方面，本公开提供一种抑制细胞裂解的方法，其包括使细胞与本公开的组合物接触，其中抑制防止核酸和/或胞外囊泡从细胞释放。在一些实施例中，细胞为白细胞。在其它实施例中，细胞为红细胞。在一些实施例中，核酸为无细胞rna(cfrna)、无细胞dna(cfdna)、细胞rna或细胞dna。在一些实施例中，抑制裂解至少约24小时。在其它实施例中，抑制裂解至少2天、或至少3天或至少4天。在又其它实施例中，本公开的方法进一步包括保持细胞至少约24小时且接着从细胞分离核酸。在一些实施例中，将细胞保持在室温下。
在一些方面，本公开提供一种用于稳定细胞的根据本公开的组合物，其特征在于用途包括使细胞与组合物接触，其中接触防止核酸和/或胞外囊泡从细胞释放。在一些实施例中，细胞为白细胞。在其它实施例中，细胞为红细胞。在又另外的实施例中，核酸为无细胞rna(cfrna)、无细胞dna(cfdna)、细胞rna或细胞dna。
附图说明
图1为描绘在三种不同存储温度下利用三种不同调配物的随血液存储时间而变化的溶血的图式。
图2为描绘在使用各种抗凝剂期间外泌体释放的图式。
图3为描绘随防腐剂的百分比而变化的血浆dna浓度的图式。
图4a为描绘随防腐剂的百分比而变化的血浆rna浓度的图式。
图4b为描绘随α-环糊精的百分比而变化的血浆rna浓度的图式。
图5a为描绘随α-环糊精的百分比而变化的泛素bmrna拷贝数的图式。
图5b为描绘随α-环糊精的百分比而变化的血红蛋白amrna拷贝数的图式。
图6示出随全血液存储时间而变化的总无细胞rna(cfrna)浓度。使用市售试剂盒(qiagen，qiaamp循环核酸分离试剂盒(circulatingnucleicacidisolationkit))分离血浆且提取cfrna。使用量子位rnahs分析(invitrogen)定量所得cfrna。结果为来自3位健康供体的具有标准差的平均值。
图7示出随全血液存储时间而变化的红细胞-特异性(rbc-特异性)转录物珠蛋白a1/2的浓度成倍增加。如图6的描述中所指示分离cfrna且在下文进行逆转录(bio-radiscript)，且与市售引物/探针(thermo-fisher)一起用于液滴式数字pcr反应(bio-radqx200装置)中。结果为来自3位健康供体的具有标准差的平均值。
图8示出随全血液存储时间而变化的泛素b转录物(由所有细胞表达)的浓度成倍增加。如图6的描述中所指示分离cfrna且在下文进行逆转录(bio-radiscript)，且与市售引物/探针(thermo-fisher)一起用于液滴式数字pcr反应(bio-radqx200装置)中。结果为来自3位健康供体的具有标准差的平均值。
具体实施方式
本文中呈现的解释和说明旨在使所属领域的其它技术人员熟悉本教示内容、其原理和其实际应用。所属领域的技术人员可以本教示内容的多种形式调整且应用本教示内容，从而可以最好地适合于特定用途的要求。因此，所阐述的本教示内容的特定实施例并非旨在详尽或限制本教示内容。因此，本教示内容的范围不应参考以上描述来确定，而实际上应参考所附权利要求书连同此类权利要求书所授权的等效物的全部范围来确定。所有文章和参考文献(包含专利申请和公开案)的公开内容出于所有目的以引用的方式并入。如将从以下权利要求中获得的其它组合也是可能的，所述其它组合也特此以引用的方式并入本书面描述中。
本文中的教示内容涉及能够保持胞外囊泡的基线水平的血液样品调节和细胞稳定组合物；其包含外泌体、微囊泡和凋亡小体(以下统称为外泌体或胞外囊泡)。外泌体的基线水平是指紧接在抽血后的血液样品中的外泌体的量或浓度。胞外囊泡载有核酸，因此充当无细胞核酸的保护包膜。由于囊泡从白细胞和红细胞中释放，所以血液样品中的胞外囊泡和核酸的量随抽血后的时间推移而增加。本文中所阐述的组合物试图保留包含胞外囊泡和核酸的各个组分，且防止引起胞内物质从细胞中排出且污染抽血后存在的任何胞外物质的细胞裂解。本文中所公开的组合物可基本上使血细胞稳定，使得在抽血后第4天和第6天以及可能更长时间恢复的胞外囊泡的数量与在抽血时存在的胞外囊泡群体基本上类似。因此，位于胞外囊泡内的无细胞rna(cfrna)、无细胞dna(cfdna)、蛋白质和其他细胞物质(除胞外囊泡之外的一些无细胞物质以外)的浓度在第4天、第6天以及可能更长时间保持不变，与抽血时一样。因此，本公开的组合物有助于稳定位于胞外囊泡、基因组dna和rna和其他rna种类(例如，mrna、mirna、pirna、sirna、shrna等)内的cfrna、cfdna、蛋白质和其它细胞物质，从而允许无细胞物质和细胞物质(例如，白细胞、循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞或其它罕见循环细胞内的dna和rna)的下游分离和测试。在其它实施例中，本公开的组合物适用于直接和间接胞外囊泡分析。通过(例如但不限于)流式细胞测量分析来进行胞外囊泡分析。
大量化学组分常用于生物样品采集、生物样品处理和生物样品分析的步骤中。然而，这些已知组分中的许多对于白细胞、红细胞、罕见循环细胞、核酸、蛋白质或胞外囊泡有损害。此外，这些组分中的许多可与其它组分结合，以对白细胞、红细胞、核酸、蛋白质、胞外囊泡、循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、循环祖细胞或循环胎儿细胞造成有害影响。甚至此外，某些组分在某些浓度下为有益的，但在其它方面由于大量原因而有问题，所述原因包含mcv增加、白细胞的细胞凋亡诱导和有效性所需的体积。因此，识别化学组分的组合可极其具有挑战性，所述化学组分将有效地使上述样品组分稳定，而没有有害影响。
用作和/或充当稳定化合物的化学组分为溶液中的固体，因此其可用性受到溶解度和下游分析可接受的稀释量的限制。为了将许多化学组分用作有效的稳定剂，其存在量将需要足以使样品稳定。此外，为了生产直抽式血液试管，稳定组合物必须以极小的量存在，使得大部分试管填充有样品。因此，试管中的组合物量理想地为约0.02到约2ml。试管中的组合物量可为至少约0.5ml或甚至至少约1ml。试管中的组合物量可小于约3.0ml或甚至小于约2.0ml。
通常，为了使特定化学组分有效，其必须以足够高的浓度存在以达到功效。不幸的是，许多化学组分的高浓度可导致红细胞聚集和/或破裂(仅作为一个实例)，从而增加mcv且在其它问题中造成溶血增加。
为了平衡这些问题，有必要鉴别以下化学组分：(1)可在低浓度下有效以解释相对较少量的组合物的需求；且(2)不会以损伤白细胞、红细胞、其它罕见循环细胞(如肿瘤和胎儿细胞)、核酸、外泌体或蛋白质的方式与其它组分反应。
另外，根据本文中的教示内容的组合物可通过流式细胞测量术来促进白细胞的免疫表型，因为细胞形态和表面抗原表达借助于本文中所描述的组合物维持。利用根据本教示内容的组合物还可有助于循环肿瘤细胞和其它罕见循环细胞/物质(例如，循环内皮细胞、循环祖细胞、母体血液中的循环胎儿核酸)的稳定和分离。还有可能的是，本文中所描述的组合物可有助于生物样品内的多种组分的测试，尤其当可分析多于一种血液组分以识别病况或疾病的存在、疾病的严重程度或疾病治疗的成功或失败的指标时。作为一个非限制性实例，有可能使用机械分离来分离用本文中所公开的组合物稳定的ctc。这种方法可后接旋转或离心任何剩余的样品以收集血浆且随后从样品分离外泌体(其可包含rna)和/或无细胞dna。替代地，人们可首先分离血浆，接着从白细胞层(buffycoat)分离ctc和wbc。从剩余的细胞样品中，可以分离且分析获自剩余白细胞群体或其它罕见细胞群(包含ctc)的蛋白质、dna和rna。蛋白质组分析还可在用本文中所描述的组合物处理的样品中进行。因此，本文中所描述的组合物可有助于使用单一样品进行分析的能力，所述能力远超当今所理解的可能性。本文中的组合物基本上防止溶血、使外泌体和相关联的无细胞rna稳定、使无细胞dna稳定和使蛋白质稳定的能力使得这种多阶段分析为可能的。
溶血为常见问题，尤其在其涉及血液样品时。溶血可在以下中的一个或多个过程中发生：样品采集、样品运输、样品存储，以及样品的任何下游处理。红细胞裂解(例如，溶血)可对细胞组分分析造成大量难题且因此随着溶血减少，分析质量得到提高。许多血液采集试管包含乙二胺四乙酸(edta)。虽然已发现edta减少一些溶血，但本文中所鉴别的测试结果(参见例如图1)表明可通过谨慎选择正确的抗凝剂来实际减少溶血量。存在许多抗凝剂，包含但限制于基于edta、基于肝素、基于草酸盐和基于柠檬酸盐的那些抗凝剂。在各方面，本文中的组合物基于特定类型的基于柠檬酸盐的抗凝剂(例如，抗凝剂柠檬酸盐右旋糖-a或acd-a)，这是因为其展示减少的溶血且使红细胞膜稳定的双重能力。可用某些基于柠檬酸盐的抗凝剂(尤其acd-a和acd-b)减少或稳定红细胞平均细胞体积(mcv)。acd-a和acd-b各自包括柠檬酸、柠檬酸三钠和右旋糖。溶液a中的acd浓缩8.5毫升的血液，而溶液b中的acd浓缩6毫升的血液。用于本文中的组合物的柠檬酸盐的摩尔浓度优选地为约0.05m到约0.2m。用于本文中的组合物的柠檬酸盐的摩尔浓度可近似为0.11m。用于形成本文中所描述的组合物的剩余组合物可稀释以具有约0.0025m到约0.1m的最终摩尔浓度。
减少溶血的期望还可能需要识别不会导致(或将最小化)红细胞裂解的防腐剂。有可能的是，某些防腐剂可增加红细胞裂解的发生且因此可能不会是包含在本文中所描述的组合物中的优选防腐剂。
可选择防腐剂的浓度，使得白细胞裂解最小化。白细胞裂解为时间相关的，且大多数样品最终将经历一些白细胞裂解，防腐剂的量应足以在抽血与处理样品以分离样品组分时之间的时间段(例如，从24小时到一周和可能更长的时间)最小化(如果未消除)白细胞裂解。因此，组合物中防腐剂的浓度(在抽血之前)可为约0.25％到约2％。浓度可为约2.5％到约10％。浓度可为约4％到约7％。浓度可为约2.5％到约50％。浓度可为约2％到约100％。
任何胺(如果存在)的浓度很可能直接取决于防腐剂的浓度。本质上，胺的存在可起到化学键到防腐剂内的分子组分的作用。因此，可优选在组合物中存在足够的胺，使得所有游离的并且与胺反应的防腐剂组分充分反应，且因此使样品内不发生反应。这种分子键合活性可减少组分(其可为甲醛)的存在，从而减少反应性游离甲醛对需要分离且分析的样品组分可能具有的任何有害影响。因此，组合物中胺的浓度(在抽血之前)可为约0.01％到约0.2％。浓度可为约0.03％到约0.1％。浓度可为约0.05％到约0.09％。浓度可为约0.75％到约3.75％。
为了稳定和/或保护外泌体浓度且同时使白细胞裂解和红细胞裂解最小化，传统用于生物样品采集和测试中的许多化学物质将以损伤外泌体、增加白细胞裂解或增加红细胞裂解的方式与样品相互作用。许多传统的化学物质干扰外泌体和核酸的实际分离，而其它导致溶血增加。此外，一些化学物质的浓度在不同的水平下具有不同的作用。举例来说，已知在本文中所描述的组合物中使用的某些多糖增加溶血；然而，已发现在某些较低浓度下，其用以减少红细胞裂解。
本文中的组合物还可包含一种或多种转录抑制剂。通常，用于稳定生物样品的组合物包含核酸酶、代谢和/或蛋白酶抑制剂以阻断核酸的降解和/或其相对浓度的变化(例如，基因表达)。然而，本文中的教示至少部分针对并入转录抑制剂的使用，因为调配物的意图为保持基线rna水平。白细胞(和其它罕见循环细胞)将在抽血之后经历细胞信号传导，从而改变rna基因表达谱。在抽取后的短短2小时内，rna谱已改变。为了有意义的结果，必须保持基线rna谱(在抽取时间或接近抽取时间)以识别可操作的靶点。为此，不仅需要阻断rna降解，而且抑制新的rna转录物(包含mrna、微rna、lncrna、pirna、yrna、circrna和其它ncrna)为至关重要的。
有可能的是，为了防止红细胞裂解，根据本文中教示内容的组合物可有助于基本上防止红细胞大小的任何变化。还可能的是，这对于白细胞是正确的。本文中所公开的组合物保持红细胞和白细胞大小的能力可有助于基本上防止红细胞和白细胞裂解的能力，从而避免溶血且避免背景基因组核酸在抽血后释放到样品中。
无论来源，本文中所描述的组合物可进一步用以保存核酸。作为实例，本文中所描述的组合物可能够稳定血小板来源的rna。血小板含有大量重要的rna种类，例如mrna、mirna、circrna，且越来越多的证据表明，血小板mrna表达谱在人类疾病中发生改变。因此，本文中所公开的组合物的益处在于能够用其它来源的rna分离且分析血小板来源的mrna。
有可能的是，本文中所描述的组合物的一种或多种组分为样品稳定的多于一个方面提供功效。作为一个实例，有可能的是，本文中所描述的多糖可用以保持胞外囊泡(和因此位于其中的rna)的完整性且还可用以减少红细胞裂解。考虑某些组分(包含各种双糖)，但以有效的方式引起或未能减轻溶血。
本教示内容大体上涉及一种用于保存含有血液或其它生物材料的生物样品的方法。本文中所描述的组合物可含有一种或多种防腐剂、一种或多种抗凝剂或螯合剂、一种或多种多糖、一种或多种胺和一种或多种转录抑制剂和一种或多种核糖核酸酶抑制剂。组合物有可能包含两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或甚至所有这些组分。
防腐剂可选自：重氮利定脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-均三嗪、恶唑啶、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑啶-2,4-二酮、季铵盐-15、dmdm乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。防腐剂可包含咪唑烷基脲和重氮利定脲的混合物。防腐剂可包含咪唑烷基脲且可不含任何其它防腐剂。防腐剂可包含重氮利定脲且可不含任何其它防腐剂。防腐剂可包含恶唑啶。防腐剂可包含恶唑啶化合物的混合物。防腐剂可包含双环恶唑啶组合物。防腐剂可包含三嗪。
防腐剂可为尿酸的衍生物。防腐剂可为醛和尿酸衍生物的反应产物。可选择防腐剂，使得当与生物样品接触时，醛(其可为甲醛)的至少一部分变为反应性的。然而，存在的甲醛量(在样品采集之前或之后)必须足够低，以避免损坏生物样品中存在的任何核酸、胞外囊泡或蛋白质。甲醛的释放可导致组合物和/或合并后的组合物和样品的ph增加。为了控制组合物和/或组合物与样品组合的ph，可以受控方式释放甲醛。组合物和/或样品可以预定方式与组分接触，用于引起甲醛随时间推移的释放。可如本文所讨论封装甲醛，以使得能够释放和/或控释甲醛。还可能的是，组合物和/或合并后的组合物和样品可暴露于高温(例如，高于环境温度或室温的温度)，使得温度的升高导致甲醛的释放或增加释放(且因此增加ph)。替代地，可紧接在甲醛释放剂与组合物接触后释放甲醛。可在组合物与样品接触后释放甲醛。可选择甲醛释放剂，使得甲醛随时间推移固有地释放，而不需封装甲醛或以某种方式处理组合物来强制控释。
根据本文中的教示内容，组合物和/或样品和组合物可进一步包含组分的一种或多种副产物，所述组分包含于稳定的试管内。这些副产物中的一种或多种可包含醛。副产物中的一种或多种可包含脲。一种或多种副产物可选自：尿囊素、(4-羟甲基-2,5-二氧代-咪唑啶-4-基)-脲、(3,4-双-羟甲基-2,5-二氧代-咪唑啶-4-基)-脲和(3-羟甲基-2,5-二氧代-咪唑啶-4-基)-脲。
样品采集之前或之后存在的任何醛的量可低于40,000ppm、低于30,000ppm、低于20,000ppm或甚至低于10,000ppm。也就是说，可能存在一些甲醛以有效地交联且稳定白细胞和/或红细胞中的一种或多种。因此，甲醛可以至少2,000ppm、至少5,000ppm或甚至至少10,000ppm的量存在。有可能的是，在与样品接触之前，组合物中游离甲醛的量高达约0.5重量％、高达约1.0重量％、高达约2重量％或甚至高达约3重量％的组合物。组合物可含有少于约20百万分率(ppm)的醛。组合物可含有少于约15ppm的醛。组合物可含有少于约10ppm的醛。组合物可含有少于约5ppm的醛。组合物可含有至少约0.1ppm到约20ppm的醛。组合物可含有至少约0.5ppm到约15ppm的醛。组合物可含有至少约1ppm到约10ppm的醛。
防腐剂的ph可为至少约4、至少约5或甚至至少约6。防腐剂的ph可小于8、小于7或小于6。防腐剂的ph可为约4到约6。防腐剂的分子量可为至少约20g/mol、至少约50g/mol或甚至至少约80g/mol。防腐剂的分子量可小于约500g/mol、小于约400g/mol或小于约300g/mol。
一种或多种防腐剂可以约0.5体积％到约5.0体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约0.5体积％到约1.0体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约5体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约2.5体积％的浓度存在于组合物中。
组合物的ph可在与样品接触之前和与样品接触之后变化。组合物可包含一种或多种成分，以使组合物的ph在至少约3、至少约4、至少约5、低于约11、低于约10或甚至低于约9的范围内(在样品接触之前)。举例来说，在与样品接触之前，组合物的ph可为3到约6。组合物可包含一种或多种试剂，其负责在与样品接触后引起酸性化合物的释放。合并后的样品和组合物的ph可为至少约5、至少约6或甚至至少约7。合并后的样品和组合物的ph可低于约10、低于约9或甚至低于约8。
一种或多种胺可选自以下中的一种或多种：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和s-腺苷甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其组合。可基于其反应能力来选择一种或多种胺。作为一个非限制性实例，一种或多种胺有可能为醛反应剂。举例来说，醛反应剂可选自以下中的一种或任何组合：tris、赖氨酸、甘氨酸、脲或一种或两种的衍生物(例如，盐和/或酯)。可选择醛反应剂以与在样品采集之前或之后可存在的任何游离甲醛反应。组合物中胺的浓度(在抽血之前)可为约0.25％到约1.5％。浓度可为约0.3％到约0.8％。浓度可为约0.4％到约0.7％。
一种或多种抗凝剂或螯合剂可选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(edta)和其盐、乙二醇四乙酸(egta)和其盐、水蛭素(hirudin)、肝素、柠檬酸、柠檬酸盐、草酸、草酸盐、酸性柠檬酸盐右旋糖(acd)、柠檬酸盐、柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(citrate-theophylline-adenosine-dipuridamole；ctad)、柠檬酸盐-磷酸吡哆醛-tris、肝素-β-羟基-乙基-茶碱、聚茴香脑磺酸盐(polyanetholsulfonate)、氟化钠、肝素钠、凝血酶和ppack(d-苯丙氨酰基-l-脯氨酰基-l-精氨酸氯甲基酮)和其任何组合。因此，组合物中抗凝剂的浓度(在抽血之前)可为约2.5％到约10％。浓度可为约3％到约8％。浓度可为约4％到约7％。
一种或多种多糖可选自淀粉、纤维素、糖原或其组合。一种或多种多糖可起红细胞保护剂的作用。一种或多种多糖可有助于稳定红细胞膜，使得减缓、最小化、基本上防止细胞裂解或其某一组合。组合物中多糖的浓度(在抽血之前)可为约0.001％到约5.0％。浓度可为约0.02％到约3.0％。浓度可为约0.5％到约2.0％。
可选择一种或多种转录抑制剂以提高样品内的一种或多种组分的稳定性。一种或多种转录抑制剂可选自放射菌素d、α-鹅膏菌素、雷公藤甲素、5,6-二氯-1-β-d-核糖呋喃苯并咪唑(drb)、夫拉平度或其任何组合。浓度可为约0.5μm到约500μm。
样品血液采集试管可包含一种或多种酶抑制剂。一种或多种酶抑制剂可选自由以下组成的组：焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ata)、甘油醛、氟化钠、乙二胺四乙酸(edta)、甲酰胺、钒酰基-核苷络合物、硅藻土(macaloid)、肝素、羟胺-氧-铜离子、膨润土、硫酸铵、二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐、二价阳离子，例如mg+2、mn+2、zn+2、fe+2、ca+2、cu+2和其任何组合。
样品血液采集试管可包含一种或多种代谢抑制剂。一种或多种代谢抑制剂可选自由以下组成的组：甘油醛、磷酸二羟基丙酮、3-磷酸甘油醛、1,3-双磷酸甘油酸酯、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)、丙酮酸和甘油酸二羟基乙酸酯、氟化钠、k2c2o4和其任何组合。
样品血液采集试管可包含一种或多种蛋白酶抑制剂。一种或多种蛋白酶抑制剂可选自由以下组成的组：抗蛋白酶、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymostatin)、弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)、苯甲基磺酰氟(pmsf)、apmsf、tlck、tpck、亮肽素、大豆胰蛋白酶抑制剂、哚吲乙酸(iaa)、e-64、胃酶抑素(pepstatin)、vdlpffvdl、edta、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽(phosphoramodon)、阿吗他定(amastatin)、乌苯美司(bestatin)、抑二肽素a、抑二肽素b、α-2-巨球蛋白、利马豆胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、蛋清卵抑素(eggwhiteovostatin)、蛋清胱抑素、多西环素、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、姜黄素、高半胱氨酸、6-氨基己酸、多西环素、盐酸米诺环素(minacyclinehcl)、烟碱酰胺、壳聚糖、赖氨酸、甘油醛、植酸、b-谷固醇、c-amp、聚赖氨酸低mw、鹰嘴豆素a(biochanina)、柳氮磺胺吡啶、地美环素、氯四环素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、环己酰胺、利福平(rifampicin)、豆奶、苏拉明(suramin)、n-丁酸、青霉胺(penicillamine)、n-乙酰基半胱氨酸、苯甲脒、aebsf和其任何组合。保护剂可包含选自由以下组成的组的磷酸酶抑制剂：花萼海绵诱癌素a(calyculina)、节球藻素(nodularin)、nipp-1、微囊藻素lr(microcystinlr)、互变霉素(tautomycin)、冈田井酸(okadaicacid)、斑蝥素(cantharidin)、微囊藻素lr、冈田井酸、福司曲星(fostriecin)、互变霉素、斑蝥素、草藻灭(endothall)、节球藻素、环孢菌素a(cyclosporina)、fk506/免疫亲和素络合物、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)、bpv(phen)、去磷酸他定(dephostatin)、mpv(pic)dmhv、原钒酸钠和其任何组合。
样品血液采集试管可包含一种或多种核酸酶抑制剂。一种或多种核酸酶抑制剂可选自由以下组成的组：焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ata)、甲酰胺、钒酰基-核苷络合物、硅藻土、乙二胺四乙酸(edta)、蛋白酶k、肝素、羟胺-氧-铜离子、膨润土、硫酸铵、二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐、或二价阳离子，例如mg+2、mn+2、zn+2、fe+2、ca+2、cu+2和其任何组合。
样品血液采集试管可包含一种或多种磷酸酶抑制剂。一种或多种磷酸酶抑制剂可选自由以下组成的组：花萼海绵诱癌素a、节球藻素、nipp-1、微囊藻素lr、互变霉素、冈田井酸、斑蝥素、咪唑、微囊藻素lr、冈田井酸、福司曲星、互变霉素、斑蝥素、草藻灭、节球藻素、环孢菌素a、fk506/免疫亲和素络合物、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、bpv(phen)、去磷酸他定、mpv(pic)dmhv、原钒酸钠和其任何组合。
样品血液采集试管可包含双环恶唑烷、dmdm乙内酰脲、羟甲基甘氨酸钠、六亚甲基四胺氯代丙烯基氯(hexamethylenetetraminechloroallylchloride)、杀生物剂、水溶性锌盐或其任何组合。样品血液采集试管可包含聚丙烯酸或ph在约一到约七的范围内的合适酸。样品血液采集试管可包含胺、氨基酸、烷基胺、多元胺、伯胺、仲胺、铵盐或其任何组合。样品血液采集试管可包含一种或多种伯胺。样品血液采集试管可包含一种或多种酰胺(例如，丁酰胺)。样品血液采集试管可包含一种或多种细胞凋亡抑制剂。样品采集试管可包含一种或多种半胱天冬酶(caspase)抑制剂。
样品血液采集试管可包含一种或多种聚合物成分。聚合物可包含但不限于以下：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)和环糊精。
本文中所描述的组合物还可包含其它组分，包含以下中的一个或多个：多西环素、聚乙二醇、柳氮磺胺吡啶、聚乙烯吡咯烷酮、姜黄素、葡糖酸镁、高半胱氨酸、甲基纤维素(methylcellulose；mc)、6-氨基己酸、乙基纤维素、抑肽酶、羟基乙基纤维素、多西环素、羟丙基纤维素、盐酸米诺环素、糊精、烟碱酰胺、聚葡萄糖、壳聚糖、聚氧化乙烯、赖氨酸、聚乙基恶唑啉、甘油醛、聚蔗糖、植酸、α-环糊精、b-谷固醇、β-环糊精、c-amp、γ-环糊精、聚赖氨酸、明胶、鹰嘴豆素a、糖(例如，蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖)、柳氮磺胺吡啶、羟丙基甲基纤维素、地美环素、羟乙基甲基纤维素、氯四环素、土霉素、环己酰胺、利福平、豆奶、基于大豆的蛋白酶抑制剂、苏拉明、n-丁酸、青霉胺、n-乙酰基半胱氨酸、苯甲脒、aebsf、α-2巨球蛋白或其组合。设想前述化合物中的一种或多种可取代本公开的组合物中的环糊精。
样品采集试管可包含一种或多种表面活性剂。一种或多种表面活性剂为二甲亚砜(dmso)、乙二醇、聚乙二醇、丙三醇、溶纤剂(乙二醇二甲醚)(苯氧基乙醇)、tritonx100、tritonx705(非离子清洁剂)、1-甲基-2-吡咯烷酮、tween20、tween40(非离子)、brij35(清洁剂)、聚氧化乙烯醚(polyox)、胆酸钠、环氧乙烷聚合物、莫能菌素(monensin)、单活菌素(monactin)、五氯苯酚、2,4二硝基苯酚、皂苷、十二烷基硫酸钠(sds)或其组合。前述表面活性剂的作用在本文中认为是浓度依赖性的。例如但不限于，设想在一些实施例中，较低浓度的前述表面活性剂适用于通过使细胞与本公开的组合物接触来抑制细胞裂解，其中抑制防止核酸和/或胞外囊泡从细胞中释放。
样品采集试管可包含蛋白质，例如：生物素、白蛋白(蛋、牛)、明胶和类似的此类化合物。样品采集试管可包含rna酶抑制剂，例如：源自人类胎盘的rna酶抑制剂和类似的此类化合物。样品采集试管可包含核酸稳定剂，例如：盐酸胍、聚阳离子(例如聚乙烯亚胺)和类似的此类化合物。样品采集试管可包含氨基酸/多肽，例如：谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和类似的此类化合物。样品采集试管可包含固定剂，例如：醛(甲醛和戊二醛)、醇(乙醇、甲醇)和类似的此类化合物。样品采集试管可包含抗凝剂，例如：乙二胺四乙酸(edta)和类似的此类化合物。样品采集试管可包含酸性柠檬酸盐右旋糖(acd)、肝素和类似的此类化合物。样品采集试管可包含蛋白酶抑制剂，例如：edta、苯基甲基磺酰氟(pmsf)、2-氨乙基苯磺酰氟(aebsf)和类似的此类化合物。样品采集试管可包含抗氧化剂/还原剂，例如：trolox、a-生育酚、b-巯基乙醇和类似的此类化合物。样品采集试管可包含核酸染料，例如：二甲脒基2-苯基吲哚(dapi)、碘化丙锭、二乙酸荧光素和类似的此类化合物。样品采集试管可包含碳水化合物，例如：糖(蔗糖)、纤维素和类似的此类化合物。应了解，以上化合物的特定清单可含有一定程度的重叠，其认识到某些特定化合物有时具有重叠功能。所属领域的技术人员应理解且了解本公开的这个方面。
醛反应剂可以相对于防腐剂约1:20到约1:1的比率(按重量计)存在。醛反应剂可以相对于抗凝剂约1:25到约5:1的比率(按重量计)存在。防腐剂可以相对于抗凝剂约1:10到约15:1的比率(按重量计)存在。
组合物中各组分中的一种或多种可呈凝胶形式、液体形式、固体形式或其某种组合。组合物各组分中的一种或多种可颗粒化且/或可在样品采集容器和/或样品测试容器的壁上形成膜。各组分中的一种或多种可冷冻干燥且接着喷涂在样品采集容器的一个或多个部分上。组合物内各组分中的一种或多种可封装在封装物内。可选择封装物以在与样品接触时分解或另外暴露封装材料，从而将封装物内的材料输送到样品。组合物可包含无活性组分，例如缓冲剂或水。
一种或多种防腐剂可以约0.5体积％到约5.0体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约0.5体积％到约1.0体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约0.5体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约0.75体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约1体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约2.5体积％的浓度存在于组合物中。一种或多种防腐剂可以约5体积％的浓度存在于组合物中。
组合物可基本上不含清洁剂和离散剂和导致rbc、wbc、血小板和其它罕见循环细胞裂解的任何物质或多种物质。组合物可基本上不含导致细胞活化且随后释放膜囊泡的任何一种或多种物质，包含钙离子载体和化学治疗药物。组合物可基本上不含导致rbc溶血和rbcmcv增加的任何一种或多种物质，包含抗疟疾药物、亚硝酸盐和重金属。组合物可基本上不含导致下游pcr抑制的任何一种或多种物质，包含抗凝剂肝素、钙离子、血红素和血红蛋白。组合物可基本上不含导致凝血的任何一种或多种物质，包含凝血酶、钙离子、硅石和硅藻土。组合物可进一步基本上不含tris缓冲剂、牛血清蛋白、聚山梨醇酯20、叠氮化钠、氯化钠、血清分离剂、凝结活化剂和庆大霉素(gentamicin)中的一种或多种。
生物样品可稳定至少三天的时间。生物样品可稳定至少五天的时间。生物样品可稳定至少七天的时间。优选地，包含血液材料的生物样品的血红蛋白降解稳定至少5天的时间。
本文中所描述的组合物可用于一种方法，所述方法可包含以下步骤：处理生物样品，同时使其保持悬浮于组合物中以递送到待进行血液材料分析的远端部位。方法可包含运输(例如，运送)生物样品，同时使其保持悬浮于组合物中以递送到待进行血液材料分析的部位。方法可包含在处理和/或运输期间将样品暴露于温度波动。举例来说，这种暴露可在约4℃到约37℃或约2℃到约37℃的温度下进行。方法可包含在处理和/或运输期间将样品暴露于高达37℃的温度中。远端部位可为待进行血液材料的任何下游分析的部位。部位可为待进行血液材料的免疫分析或核酸分析的部位。
组合物和/或样品可位于样品容器中。样品容器可含有组合物或与样品合并的组合物，其量为至少0.5ml、至少1ml、至少3ml、至少5ml、至少10ml或甚至至少20ml。样品容器可含有组合物或与样品合并的组合物，其量小于150ml、小于100ml、小于50ml或甚至小于20ml。本文中所描述的组合物可存在于直接抽血式试管中。本文中所描述的组合物可位于用于收集生物样品的任何装置中。本文中所描述的组合物可在添加样品之前位于样品接收容器中，或可在采集后添加到样品中。
样品容器可为试管。样品容器可为圆柱形的。样品容器可为玻璃或可为聚合物的。样品容器可具有屏障涂层，其可为化学增强的等离子体气相沉积涂层，例如在2017年2月13日提交的美国临时申请案第62/454,451号和第62/454,460号和pct专利公开案第wo2017/031354号中所教导，这些申请的全部内容出于所有目的特此以引用的方式并入本文中。
样品容器可为试剂盒的部分。试剂盒可包含用于样品容器的盖子或盖帽，使得即使在样品运送到样品容器中的测试设备的情况下，样品仍保持在样品容器内。
抽血后的样品容器可含有血液样品和甲醛的组合。样品容器可含有血液样品、抗凝剂和甲醛的组合。样品容器可含有血液样品、甲醛、抗凝剂和多糖的组合。样品容器可含有血液样品、甲醛、抗凝剂、多糖和转录抑制剂的组合。样品容器可含有血液样品、甲醛、抗凝剂、多糖、转录抑制剂和氨基酸的组合。
方法可包含分析生物样品的一个或多个疾病状态的指标。生物样品可以是异常的生物样品。举例来说，异常结果可包含改变的dna、改变的rna和/或改变的蛋白质和/或包含ctc、循环内皮细胞、循环祖细胞和循环胎儿细胞的罕见循环细胞。循环细胞还可理解为包含循环细胞组分，所述组分包含核酸。
方法可包含分析包含血液材料的稳定生物样品。分析可包含一种或多种测试方法。方法可包含对血液材料和/或血液材料内的一种或多种组分(例如，血细胞、罕见细胞、核酸、循环肿瘤细胞/片段、循环内皮细胞、循环祖细胞、母体血液中的胎儿细胞、胞外囊泡)进行免疫分析。免疫分析可选自由以下组成的组：酶联免疫吸附分析(elisa)、酶免疫分析(eia)、放射免疫分析(ria)、计数免疫分析(cia)、荧光免疫分析(fia)、化学发光(clia)和流式细胞测量术。方法可包含血液材料的核酸分析。核酸分析可选自由以下组成的组：遗传定序、聚合酶链反应和下一代定序。
本教示内容的样品采集试管可抵抗所收集的生物医学样品的内容物粘附到样品采集试管的壁上。举例来说，血液采集试管的内表面可抵抗对所抽取血液样品的血细胞的粘附性。血液采集试管可抵抗所抽取血液样品的核酸(例如，dna)粘附到试管壁上。
本教示内容的样品采集试管可包含具有封闭底座的试管，共同延伸的细长侧壁从底座延伸且在开口端终止，且限定具有内壁的空腔室；空腔室配置成用于收集血液样品，至少试管的细长侧壁由包含热塑性聚合材料的材料制成，所述热塑性聚合材料具有防潮材料和低吸湿率、能够观察试管内的样品的光学透光度和耐化学性；和任选地在试管的大部分侧壁上的透明的含硅涂层；和弹性塞子。在采集血液样品之前，试管的空腔室相对于环境压力处于抽空状态，且空腔室部分填充有选自固体、液体或凝胶的初始状态的组合物，组合物包含任选的抗凝剂和防腐剂组合物，其适用于稳定血液样品的血细胞，用以能够分离在血液样品和/或血液样品的流式细胞测量术测试中循环的核酸或罕见细胞。组合物能够在约2℃到约30℃的温度范围内保持其初始状态至少一个月的时间。组合物可包含一种或多种能够分离血液样品的细胞或无细胞组分的材料或试管可用于接收所述一种或多种材料。这类材料可包含蛋白酶或氨基酸，其可包含但不限于蛋白酶k。
血液样品采集试管可为一次性使用的试管。血液样品采集试管可为无热原的或不含内毒素的。血液样品采集试管可用以采集用于分析目的的血液样品。
血液样品采集试管为用于稳定和保存的抽空的直抽式血液采集试管。血液样品采集试管可用于稳定和保存核酸。举例来说，本教示内容的血液采集试管可用于非侵入性产前测试(nipt)，其分析母体血液中循环的无细胞胎儿dna。产前检查可包含胎儿性别测定、对一种或多种染色体病况(例如，三染色体性)的基因筛选和产前dna亲子鉴定。试管可为适用于孕妇的母体血液样品的非侵入性测试的试剂盒的部分。血液样品采集试管可用于稳定和保存循环肿瘤细胞和/或肿瘤dna。血液样品采集试管可用于流式细胞测量术测试和分析。试管可为用于检测循环肿瘤细胞的试剂盒的部分。试管可为用于检测指示rna和/或dna中的核酸活性的癌症的试剂盒的部分。试管可为用于测定疾病状态的治疗功效的试剂盒的部分。试管可为用于测试生物标记存在或心脏病存在的试剂盒的部分。试管可为用于测试移植适合性的试剂盒的部分。
抽空的血液采集试管通常具有有效期。过期试管可具有降低的真空度，导致抽血缩短且导致血液与组合物的比率不合适。因此，重要的是血液采集试管能够保持真空持续一段延长的时间。本教示内容的血液采集试管可提供抽空的血液采集试管，其保持真空持续一段延长的时间(例如，至少24个月)。此外，血液采集试管的抽取容限应为准确的(例如，规定采集体积的+/-10％ml)。同样重要的是，尽管在试管运输期间环境有波动，但包含其闭合机构的试管结构促进试管内保持必要的压力。这类波动可包含温度变化、气压变化、湿度变化和其它环境因素。更具体地说，尽管在较高的海拔下可能会出现湿度降低和气压降低，但试管必须保持紧固地闭合。作为一实例，当环境气压为400mmhg到800mmhg之间时，试管必须保持密封且保持所需的内部压力。
血液采集试管可适用于与塞子一起使用。塞子可包含弹性体材料。塞子可包含丁基橡胶衍生物。塞子可包含卤化丁基。塞子可包含溴丁基橡胶。塞子可包含医药溴丁基橡胶。塞子可与塞子润滑剂一起使用。可涂覆塞子。可部分涂覆塞子。举例来说，涂层可包含硅酮。试管的塞子可包含在其与试管的内壁接触的外表面的至少一部分上的硅酮油涂层。
本教示内容设想一种血液采集试管组件，其包含本教示内容的血液采集试管和塞子。预期盖的外壁和试管的内壁的密封或界面使得湿气穿透率显著降低。预期塞子的外壁和试管的内壁的密封或界面使得氧气穿透率显著降低。有效的密封应都提供湿气屏障和气体屏障。本教示内容提供一种血液采集试管组件，其中塞子阻止从试管的开口拔出。本教示内容提供一种血液采集组件，其既提供有效的湿气穿透屏障，从而防止湿气从填充有组合物的试管内逸出，且提供有效的氧气穿透屏障，从而防止氧气渗透到试管中。
当试管经受高达约至少约50％的相对湿度时，本文中所描述的组合物能够在约2℃到约30℃的温度范围内保持其初始状态至少一个月的时间。当试管经受高达约75％的相对湿度时，组合物能够在约2℃到约30℃的温度范围内保持其初始状态至少一个月的时间。
样品采集试管的尺寸可为约13mm×75mm。试管的外径可为约13mm×75mm的长度(d×l)尺寸，如在临近开口端的共同延伸的细长侧壁处所测量。样品采集试管的尺寸可为约16mm×100mm。试管的外径可为约16mm×100mm的长度(d×l)尺寸，如在临近开口端的共同延伸的细长侧壁处所测量。血液样品采集试管可适用于约2ml到约10ml的血液采集。举例来说，小的血液采集试管可适用于约2ml的血液样品采集。举例来说，较大血液采集试管可适用于约10ml的血液样品采集。
血液采集试管可包含约50μl到约70μl的组合物填充容限体积。血液采集试管可包含约54μl到约66μl的组合物填充容限体积。血液采集试管可包含约60μl的组合物填充容限体积。试管可包含约160μl到约220μl的组合物填充容限体积。试管可包含约180μl的组合物填充容限体积。试管可包含约200μl的组合物填充容限体积。试管可包含约200μl到约1,000μl的组合物填充容限体积。试管可包含约750μl的组合物填充容限体积。试管可包含按重量计约0.0600g到约0.0800g的组合物填充物。试管可包含按重量计约0.0700g的组合物填充物。试管可包含按重量计0.0650g的正或负10％的组合物填充物。试管可包含按重量计0.0700g的正或负10％的组合物填充物。试管可包含按重量计0.0750g的正或负10％的组合物填充物。试管可包含按重量计约0.200g到约0.300g的组合物填充物。试管可包含按重量计约0.250g的组合物填充物。试管可包含按重量计0.225g的正或负10％的组合物填充物。试管可包含按重量计0.250g的正或负10％的组合物填充物。试管可包含按重量计0.275g的正或负10％的组合物填充物。
血液采集试管可包含约3ml到约5ml的抽取容限。血液采集试管可包含约4ml的抽取容限。血液采集试管可包含约7ml到约13ml的抽取容限。血液采集试管可包含约10ml的抽取容限。血液采集试管可包含约200μl的组合物填充体积。血液采集试管可包含约750μl的组合物填充体积。血液采集试管可包含约200μl到约750μl的组合物填充体积。血液采集试管可包含约500μl的组合物填充体积。血液采集试管可包含约500μl到约750μl的组合物填充体积。血液采集试管可包含约1ml的组合物填充体积。血液采集试管可包含约500μl到约1ml的组合物填充体积。血液采集试管可包含约200μl到约1ml的组合物填充体积。血液采集试管可包含约2ml的组合物填充体积。血液采集试管可包含约1ml到约2ml的组合物填充体积。举例来说，10ml血液采集试管可包含约1ml到约2ml的组合物填充体积。举例来说，4ml血液采集试管可包含约1ml到约2ml的组合物填充体积。
本文中所描述的含有组合物的试管的聚合材料的特征可在于具有以下中的一个或多个：防潮材料和低吸湿率、纯度、透明度、耐化学性、耐热性和强度。聚合材料可具有以下属性中的一个或多个：低密度、高透明度、低双折射率、极低的吸水率、极佳的水蒸汽阻挡特性、可变的热变形特性、高刚度、强度和硬度、非常良好的血液相容性、极佳的生物相容性、非常良好的抗酸和抗碱性、非常良好的电绝缘特性和非常良好的可加工性/流动性。
聚合材料可包含环烯烃。聚合材料可包含环烯烃共聚物(cyclicolefincopolymer；coc)。聚合材料可包含均聚物或共聚物，其包含聚乙烯、聚丙烯或两种。聚合材料可包含环状部分。聚合材料可包含聚酯。聚合材料可包含聚酯对苯二甲酸酯或聚乙烯对苯二甲酸酯。聚合材料可包含聚碳酸酯。聚合材料可包含聚(甲基丙烯酸甲酯)。
聚合材料可具有极佳的水蒸汽阻挡特性。聚合材料可具有低的湿蒸汽穿透率(moisturevaportransmissionrate；mvtr)或水蒸气穿透率(watervaportransmissionrate；wvtr)。湿蒸汽穿透率可根据常规的测试方法(例如din53122)确定。如通过din53122所测量，聚合材料在23℃和85％相对湿度下的湿蒸汽穿透率可为约0.023g·mm/m2·d到约0.045g·mm/m2·d。聚合材料在23℃和85％相对湿度下的湿蒸汽穿透率可为约0.023g·mm/m2·d。聚合材料在23℃和85％相对湿度下的湿蒸汽穿透率可小于约0.023g·mm/m2·d。
样品采集试管可包含涂层。样品采集试管可未被涂覆。样品采集试管可为在试管的内壁上具有涂层的血液采集试管。涂层可包含一层或多层。涂层通常可为透明的。涂层可包含含硅材料。
涂层可提供一种或多种功能。血液采集试管的涂层可使得其改变血液采集试管的内表面的一个或多个特征。举例来说，涂层可改变试管的内壁的表面能。涂层可有助于防止核酸粘附到试管壁上。
包含一层或多层的涂层可通过任何合适的机制沉积在试管的内壁上。举例来说，可通过等离子体、喷雾和/或溅镀沉积方法来将涂层沉积到聚合衬底上。其可通过气相沉积方法来施加。其可通过化学沉积方法来施加。其可通过物理沉积方法来施加。
本教示内容提供一种血液采集试管，其不允许组合物随时间推移流失水分。水分流失可导致稳定的组合物变得浓缩，其可潜在地损坏包含红细胞裂解的所有细胞的完整性且产生过量的溶血。
本教示内容的血液采集试管可包含组合物。试管可包含具有一种或多种成分的组合物。组合物的一种或多种成分的比率可为约5:1到约15:1(例如，10:1)。组合物可为固体。组合物可基本上为固体。组合物可为液体。组合物可为凝胶。组合物可为膜。组合物可包含水性物质。组合物可包含组合物中的一种或多种试剂。合适的溶剂可包含水、生理盐水、二甲亚砜、乙醇和其任何混合物。
血液采集试管可包含约4ml到约10ml的抽血体积。血液采集试管可包含约.05ml到约1ml的组合物体积。血液采集试管可包含约.20ml到约.90ml的组合物体积。血液采集试管可包含约.20ml到约.30ml的组合物，用于约8ml到约10ml的抽血体积。血液采集试管可包含约.60ml到约.90ml的组合物，用于约4ml到约6ml的抽血体积。
血液样品采集试管可用于稳定和保存以下中的一种或多种：蛋白质(例如，朊病毒)、酶、抗体和可含有或可不含有核酸的生物材料，包含带有或不带有转译后修饰的那些核酸。举例来说，试管可采集样品用于通过以下中的一种或多种方法进行分析：表面流式细胞测量术、胞内细胞测量术、基于elisa的分析和质谱分析。血液样品采集试管可用于稳定和保存胞外囊泡、外泌体、核外粒体和/或微囊泡。血液样品采集试管可用于稳定和保存病毒。这可包含病毒失活和病毒负荷定量。病毒可包含以下中的任一种：dna/rna、链状/双链和包膜/非包膜。血液样品采集试管可用于稳定和保存微生物，例如细菌、霉菌和酵母。血液样品采集试管可用于稳定和保存胞外寄生虫和/或胞内寄生虫。血液样品采集试管可用于稳定和保存外泌体、循环肿瘤细胞、其它罕见循环细胞和肿瘤dna。
组合物可适用于存储血液样品至少约3天的时间。组合物可适用于存储血液样品至少约7天的时间。组合物可适用于存储血液样品至少约14天的时间。组合物可适用于存储血液样品至少约30天的时间。组合物可适用于存储血液样品至少约60天的时间。组合物可适用于存储血液样品至少约90天的时间。
本公开的组合物的各组分之间的协同作用
本公开的组合物的各种组分之间的关系和其对血液中各种细胞的影响为复杂的。为了稳定cfrna，稳定wbc和rbc都是必要的，因为其各自含有会污染无细胞级分的rna。例如但不限于，如果组合物中存在过少的能够释放醛的组分(例如，idu)，那么对稳定wbc没有影响，但如果存在过多的能够释放醛的组分(例如，idu)，则rbc开始出现不稳定。α-环糊精有助于稳定wbc，但可损害rbc。
因此，本文中公开了本公开的组合物的各种组分相对于例如细胞中的核酸的稳定化产生协同效应。因此，在本公开的方面实施例的任一个中，聚合物和能够释放醛的组分相对于例如细胞中的核酸的稳定化提供协同效应。因此，在一些实施例中，α-环糊精和idu协同作用以稳定例如细胞中的核酸。在其它实施例中，α-环糊精和du起协同作用以稳定例如细胞中的核酸。在一些实施例中，peg和idu协同作用以稳定例如细胞中的核酸。在又其它实施例中，peg和du协同作用以稳定例如细胞中的核酸。
本公开的组合物有助于稳定位于胞外囊泡、基因组dna和rna和其它rna种类(例如，mrna、mirna、pirna、sirna、shrna等)内的cfrna、cfdna、蛋白质和其它细胞物质，从而允许无细胞物质和细胞物质(例如，白细胞、循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞或其他罕见循环细胞内的dna和rna)的下游分离和测试。在其它实施例中，本公开的组合物适用于直接和间接胞外囊泡分析。
在一些实施例中，细胞为血细胞。在其它实施例中，血细胞为白细胞(wbc)或红细胞(rbc)。在一些实施例中，能够释放醛的组分为重氮利定脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-均三嗪、恶唑啶、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑啶-2,4-二酮、季铵盐-15、dmdm乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。在本公开的实施例中的任一个中，能够释放醛的组分为咪唑烷基脲(idu)。
在一些实施例中，聚合物为聚乙二醇(peg)(以所属领域中理解的各种分子量)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、葡糖酸镁、甲基纤维素(mc)、乙基纤维素(ec)、羟基乙基纤维素(hec)、羟丙基纤维素(hpc)、糊精(以所属领域中理解的各种分子量)、聚葡萄糖(以所属领域中理解的各种分子量)、聚氧化乙烯、聚乙基恶唑啉、聚蔗糖(以所属领域中理解的各种分子量)、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、明胶、糖(例如但不限于蔗糖、甘露糖醇、乳糖或海藻糖)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素。在本公开的实施例中的任一个中，聚合物为α-环糊精。
预期本公开的组合物的各组分的浓度/量如下。预期能够释放醛的组分(例如，idu或du)以约10％到约40％的浓度存在于组合物中。预期环糊精或其官能化衍生物(例如，α-环糊精或其官能化衍生物)以约0.75％到约4％的浓度存在于组合物中。环糊精的官能化衍生物在所属领域中已知(参见例如hanessian等人，《有机化学杂志(j.org.chem.)》60(15):4786-4797(1995)和zhou等人，《聚合物化学(polymerchemistry)》1:1552-1559(2010)，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。
关于抗凝剂，预期基于柠檬酸盐的抗凝剂(例如，acd-a、acd-b或cpda)以约0.75％到约4％的浓度存在。预期不是基于柠檬酸盐的抗凝剂(例如，edta)以约0.05％到约2％的浓度存在于组合物中。
如本文中所使用，根据添加生物样品(例如，血液)之前组合物中组分的浓度或量来描述给定组分的浓度或量。因此，在已添加生物样品之后，如本文中所描述的各组分的浓度或量预期减少约20倍。借助于实例，在添加生物样品之前，存在于容器(例如，血液试管)内的组合物中的idu的量可为按体积计约10％到约40％。然而，在添加生物样品之后，容器中idu的浓度预期为按体积计约0.5％到约2％。因此，如果在添加生物样品之前容器中的组合物的容积为0.2ml，则容器中的idu的量为约20μl到约80μl；在添加生物样品之后，容器中的idu的量为约1μl到约4μl。
在本公开的方面或实施例中的任一个中，具有相同或类似特性的组分可彼此取代。举例来说，在本公开的方面或实施例中的任一个中，du(或能够释放醛的任何组分)可取代idu；在本公开的方面或实施例中的任一个中，替代性糖(例如，蔗糖、甘露糖醇、乳糖或海藻糖)可取代右旋糖。
实例
本文中所提供的图式显示测试数据，其有助于识别用于最小化白细胞裂解、最小化红细胞裂解和保持无细胞dna、胞外囊泡(和位于其中的rna)和蛋白质的稳定性的组合物组分。
图1为描绘使用各种抗凝剂的红细胞mcv变化的图式。红细胞平均细胞体积的增加表明红细胞裂解的增加(或预期增加)。图式示出三个不同供体在三种不同的存储温度下的结果。因此，优选的是显示保持平均细胞体积使其与样品采集时的平均细胞体积类似的能力的抗凝剂。
图2为描绘在使用各种抗凝剂期间外泌体释放的图式。与基因组dna的释放类似，胞外囊泡的释放可在rna的有效分离中产生挑战。因此，优选的是保持外泌体释放使得其与样品采集时类似的抗凝剂。
图3为描绘随防腐剂的百分比而变化的血浆dna浓度的图式。dna浓度的增加表明基因组dna的量增加，且因此代表白细胞裂解增加。因此，所需量的防腐剂保持dna浓度，同时避免可损坏dna、胞外囊泡或蛋白质的过度保存和交联。
图4a为描绘随防腐剂的百分比而变化的血浆rna浓度的图式。rna浓度的增加表明所释放的外泌体的量增加。因此，所需量的防腐剂保持rna浓度，同时避免可损坏dna、胞外囊泡或蛋白质的过度保存和交联。
图4b为描绘随α-环糊精的百分比而变化的血浆rna浓度的图式。rna浓度的增加表明所释放的外泌体的量增加。因此，所需量的多糖保持rna浓度，同时避免溶血。
图5a为描绘随α-环糊精的百分比而变化的泛素bmrna拷贝数的图式。rna浓度的增加表明所释放的外泌体的量增加。因此，所需量的多糖保持rna浓度，同时避免溶血。
图5b为描绘随α-环糊精的百分比而变化的血红蛋白amrna拷贝数的图式。rna浓度的增加表明所释放的外泌体的量增加。因此，所需量的多糖保持rna浓度，同时避免溶血。
本公开的组合物的各组分的协同效应
包括本公开的组合物的容器(例如，血液采集试管)的有效假设为包含信使rna、微rna、非编码rna等的无细胞rna(cfrna)通过封装在胞外囊泡(ev)内而在血浆中为稳定的。因此，由于本公开的方面涉及稳定cfrna的抽取时间浓度，所以目标是保持ev的初始浓度。图6、7和8中描绘的实验表明在抽血后，rnaxbct稳定了ev和相关cfrna的抽取时间浓度至多7天。在实验中，rnaxbct的功能性组分为防腐剂咪唑烷基脲(idu)和α-环糊精。设计实验以测试前述组分中的每一种是否单独起作用(累加效应)或组合是否提供出人意料的更明显的结果(协同效应)。如下文所讨论且如图6到图8中所示，组合显示出人意料的协同效应。
在基础抗凝剂acd-a的背景下，单独添加(以rnaxbct中所使用的相同浓度)或一起添加防腐剂(即，idu和α-环糊精)中的每一种。将样品收集到每个含调配物的试管中且立即(第0天)或在室温下存储七天之后(第7天)分离血浆。根据制造商的建议(qiagen)，使用市售的具有柱上dnase1消化物的qiaamp循环核酸分离试剂盒从血浆样品中纯化无细胞rna。接着，按照制造商的建议，将纯化的cfrna用于总cfrna的荧光分析(qubithsrnaassay，thermo-fisher)中，或使用市售的用于转录物特异性rna表达的引物/探针集来用于液滴式数字pcr(ddpcr，bio-radqx200工作流)中。
如图6中所示，在非稳定的acd-a样品(n＝3个独立供体)中，通过荧光分析所测量的总cfrna在7天时程内增加将近60倍。单独添加idu不会阻止cfrna增加，然而仅添加α-环糊精确实限制cfrna水平的增加。然而，idu和α-环糊精的组合显著减弱了总cfrna水平的增加(观测到仅2到4倍的增加)。
为了确定idu或α-环糊精防腐剂对不同的细胞群体的潜在偏好，利用ddpcr以确定cfrna水平中的转录物特异性变化。血红蛋白α1和α2(hba1/2)通过红细胞表达且这些转录物的总水平与总cfrna的水平相同(图7)。在珠蛋白转录物为血浆中发现的主要转录物的条件下，这是可预期的。接着确定泛素b(由所有细胞表达的基因)的水平。在这方面，观察到idu本身的作用；然而，idu和α-环糊精的组合对于泛素b浓度的几乎完全稳定是必要的(图8)。
总的来说，这些数据证实能够释放醛的组分(例如，idu)与α-环糊精之间的在稳定cfrna的抽取时间浓度方面的出人意料的协同效应。
如本文中所使用，除非另外说明，否则教示内容设想将属(列表)的任何成员从属中排除；且/或可将马库什分组(markushgrouping)的任何成员从分组中排除。
除非另外说明，否则本文中所列举的任何数值都包含以一个单位为增量提供的从下限值到上限值的所有值，其中在任何下限值与任何上限值之间存在至少2个单位的间隔。作为实例，如果规定组分的量、特性或方法变量的值(例如温度、压力、时间等)为例如1到90、优选地20到80、更优选地30到70，那么预期中间范围值(例如15到85、22到68、43到51、30到32等)在本说明书的教示内容内。同样，各个中间值还在本教示内容内。对于小于一的值，按需要将一个单位视为0.0001、0.001、0.01或0.1。这些仅是特定意图的实例，且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合视为以类似方式在本申请中明确地陈述。如可看出，以两种或更多种成分的重量/体积百分比表达的量的比较性教示内容还涵盖两种或更多种成分彼此的相对重量比例，即使未明确地陈述。举例来说，如果教示内容叙述2％a和5％b，则教示内容还涵盖2:5的a:b重量比。除非另外说明，否则所有范围包含两个端点和端点之间的所有数值。与范围结合使用的“约”或“大致”适用于范围的两个端值。因此，“约20到30”意欲涵盖“约20到约30”，至少包含指定的端点。
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用于描述组合的术语“基本上由…组成”应包含所识别的元件、成分、组件或步骤，以及不会实质上影响组合的基本和新颖特征的此类其它元件、成分、组件或步骤。用于描述本文中的元件、成分、组件或步骤的组合的术语“包括”或“包含”还涵盖基本上由元件、成分、组件或步骤组成(即任何其它元件、成分、组件或步骤的存在不会实质上影响来源于教示内容的特性和/或益处)；或甚至由元件、成分、组件或步骤组成的实施例。
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