一种三维微载体原位冷冻保存细胞的方法与流程

本发明涉及一种三维微载体原位冷冻保存细胞的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术：

随着生物医学，材料学，机械学，工程学等交叉学科的快速发展，越来越多的人关注于细胞在体外培养的微环境与体内生存微环境的差异。传统的两维细胞培养(基于商业化的培养皿或多孔板)技术发展已有百余年的历史，在生命科学基础研究、医学研究等领域具有广泛应用。然而随着显微成像技术的快速发展，研究者逐渐发现细胞在两维的培养环境下的生存状态，细胞形态与其在体内真实环境的培养条件下相距甚远。因此这种简化的两维微环境不能很好的模拟和重现体内的三维微环境。而依赖于传统两维环境下培养的干细胞，在干细胞移植治疗过程中，由于体内外生存环境的巨变，导致了干细胞存活率和功能的降低，修复与再生功能的减退，从而制约了干细胞治疗在临床应用的效果。研究表明，相比于细胞的两维培养，体外三维微环境的模拟有利于细胞的增值和分化，保持细胞干性，使体外培养的细胞与体内环境状态下的细胞更加相近。因此三维细胞培养技术在近年来备受关注，并得到了大幅度的发展。

构建细胞体外的三维培养模型，所用的生物材料由于需要在体内与组织直接接触，因此必须具备一定的特殊要求：如材料基质的来源(天然或合成材料)、材料基质的物化性能(化学相容性、机械性能、降解性、结构特性等)、材料基质的生物活性(粘附位点、诱导信号等)，三维培养技术所需的设备、使用条件、适用范围，细胞的吸附方式、粘附方式、培养方式、检测方式等等。理想的三维细胞培养系统能够实现在细胞种植、培养、增殖、传代过程中以及后续的成像与定性上比传统的两维培养方式更加接近于体内状态，并在操作手段上同传统两维细胞培养方式同样简便易行。

现有技术中，在细胞培养之后，需将细胞与微载体分离后再冷冻保存，会打断三维培养的过程，影响细胞的后续培养。常用的竞品微载体在冷冻保存后会破裂，复苏后，细胞从微载体上脱落，无法实现原位冻存。因此开发一种在制备三维培养的细胞制品或组织工程产品时，全程保持细胞处于三维状态的方法很有必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种三维微载体原位冷冻保存细胞的方法，本方法能实现细胞培养在三维微载体上原位冷冻保存，无需将细胞与微载体分离再冷冻保存，而可以直接将细胞原位保存在三维微载体上，实现了细胞冻存不再打断三维培养的过程，方便用户对培养后的三维细胞产品的储存、运输和复苏培养，也便于对细胞的长期保存。

本发明提供的一种三维微载体原位冷冻保存细胞的方法，包括如下步骤：1)将细胞的三维微载体悬液进行离心，弃上清，得到含有细胞的载体；

2)将步骤1)中得到的所述含有细胞的载体，与冻存液混合，然后加入冻存管中；

3)将步骤2)中加有所述含有细胞的载体的冻存管进行降温，然后转移至液氮中；即可实现三维微载体原位冷冻保存细胞。

上述的方法步骤1)中，所述离心的转速为50～1610×g，具体可为400×g，时间为1～10min，具体可为2min。

上述的方法步骤2)中所述冻存液的体积与所述含有细胞的载体的质量比为1ml：0.1～50mg，具体可为1ml：10mg或1ml：0.1～20mg。

上述的方法中，所述冻存液包括10％dmso、10～90％fbs和0～80％基础培养基，10％dmso和0～80％基础培养基，10～90％fbs和0～80％基础培养基或其他的市面上的细胞冷冻保存液如cf0101cellregen无血清细胞冻存液。

上述的方法中，所述冻存管放入冰箱降温至-20～-196℃，具体可为-20～-80℃；

所述降温采用程序化降温或非程序化降温；所述程序化降温的降温速率为-1～-15℃/分钟；

所述降温的时间可为1～24h，具体可为24h、10～24h或15～24h。

上述的方法中，所述降温的操作为将步骤2)中的冻存管放入细胞降温盒中，并于1～10min内放入冰箱中，进行降温。

上述的方法中，加入所述冻存管中所述37℃预温的pbs或基础培养基稀释的比例可为1：5～30。

上述的方法中，步骤3)之后还包括细胞复苏的步骤：将步骤3)处理后的冻存管置于水浴中，所述冻存管中冰块融化时移除水浴；然后加入37℃预温的pbs或基础培养基稀释，然后离心，即可复苏细胞。

本发明中，复苏后的细胞，仍结合在微载体上，不从微载体脱落，微载体保持完整形态，因此可再重悬至新鲜培养基中继续培养或使用。

上述的方法中，所述水浴的温度可为35～40℃；

所述水浴的时间可为1～5min。

上述的方法步骤3)之后细胞复苏时，所述离心的转速可为50～1610×g，具体可为400×g，时间为1～10min，具体可为2min。

本发明方法适用于培养在三维微载体上的细胞的长期保存，复苏后的细胞活力高且细胞特性不变，可实现长期保存的目的。

本发明具有以下优点：

本方法能实现细胞培养在三维微载体上原位冷冻保存，无需将细胞与微载体分离再冷冻保存，而可以直接将细胞原位保存在三维微载体上。该方法实现了细胞冻存不再打断三维培养的过程，由于微载体在冷冻(-20至-196℃，直到液氮保存)和复苏(即从液氮或者-80℃升温溶化)过程中无破碎或变形，而细胞仍贴附与三维微载体上，从而在制备三维培养的细胞制品或组织工程产品时，全程保持细胞处于三维状态。方便用户对扩增后的三维细胞产品的储存、运输和复苏培养。本方法适用于培养在三维微载体上的细胞的长期保存，复苏后的细胞活力高且细胞特性不变，可实现长期保存的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中载体原位冷冻保存细胞不同冻存时间后复苏的结果图，其中图1a为本发明采用3dflotrix微载体的实验结果图，图1b为竞品的微载体(gecytodex)的实验结果图。

图2为本发明实施例1中微载体上的细胞在冻存前和冻存后再复苏的活细胞比例的结果图。

图3为本发明实施例1中冷冻复苏后3dflotrix微载体和竞品微载体(gecytodex)上的细胞数量柱状图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细胞为hek293t细胞，购于中国协和医科大学基础医学细胞中心，产品目录号为cbp60439；

三维微载体为3dflotrix微载体，购于北京华龛生物科技有限公司，货号cnf-f01t-50。

下述实施例中，细胞的三维微载体悬液按照如下步骤制备：1、微载体准备：称取微载体粉末200mg进行紫外灭菌后倒入无菌的内置叶轮细胞培养瓶中；准备三组；

2、细胞准备：事先准备好脂肪间充质干细胞悬液，5×10⁶个细胞重悬于60ml完全培养基中待用；准备三组；

3、接种细胞：将上述细胞悬液混入内置叶轮细胞培养瓶中，与200mg微载体混匀；

4、细胞吸附：将内置叶轮细胞培养瓶置于低速搅拌器上并放入37℃，5％二氧化碳培养箱中进行80rpm搅拌，使细胞通过旋转的方式粘附于微载体上。

实施例1、

1、将含有hek293t细胞的三维微载体悬液进行离心，400×g，2min，弃上清。

2、加入冻存液(90％fbs+10％dmso)后分装至冻存管中(1ml冷冻液中含有10mg含有细胞的载体，每管0.5-1ml)。

3、冻存管装入细胞程序降温盒中，应于5分钟内放入-80℃冰箱中，24h后转移到液氮中。

4、吸附于微载体上的细胞的复苏：复苏时，先准备37℃预温的基础培养基，再迅速用37℃水浴冻存管，期间不断轻摇，待剩余1粒米大小的冰块时(约1-2分钟水浴)，迅速移出水浴。然后按1：5稀释比例，立即用基础培养基稀释融化的含细胞的三维微载体悬液，接着400×g离心2分钟，再重悬后使用。

5、细胞检测的方法：

(1)活细胞原位calcein-am/pi染色法：

1)试剂盒：live&deadviability/cytotoxicityassaykitforanimalcells货号:kgaf001

2)分别取50-100μl的冻存前或冻存后复苏的含有细胞的三维微载体悬液加入到96孔板内；

3)尽量去除上清，加入pbs洗一次，2min后尽量去除pbs，每孔加入按照试剂盒使用说明书配置好的染液100μl进行染色，室温避光染色20-30min后，在荧光显微镜下进行观察；结果如图1所示。

由图1可知，活细胞将被染液染上后，通过荧光可以观察其发光，发光的细胞为活细胞。发光的球形微载体证明活细胞仍附着于微载体上。图中1a证明活细胞可以原位冻存并复苏于3dflotrix微载体上，即使冻存2周也可以成功复苏。而图1b中竞品的微载体(gecytodex，货号17-1271-01，购于北京智杰方远科技有限公司)经过冻存复苏后，可以看到细胞从微载体上脱落，通过荧光观察发现细胞并没有附着于微载体上，而是变成点状散落液体中。

(2)流式细胞仪检测细胞凋亡率的分析方法：

1)细胞收集：将20mg含有细胞的三维微载体悬液进行离心，400×g，2分钟，弃上清，加入3ml0.1％四型胶原蛋白酶溶液(1g四型胶原蛋白酶(gibco，17104019)溶于1lpbs里)，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min后离心，400×g，5分钟，弃上清。

2)细胞洗涤：用4℃预冷pbs重悬细胞一次，400×g离心5分钟，洗涤细胞。

3)细胞染色：使用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒(新海基因检测有限公司阀公司，s0185)进行细胞染色，即加入300μl的bindingbuffer，后加入5μl的annexinv-fitc混匀后，避光，室温孵育15分钟；然后加入5μl的pi染色5分钟；补加200μl的bindingbuffer。

4)细胞流式分析：使用bdfacsariaii流式细胞分选仪对染色后的细胞进行流式分析，通过仪器得出细胞分群分析报告。

5)细胞流式分析报告解读：

a)annexin-v阴性-pi阴性代表正常细胞，即四格细胞分群图中的左下群，其细胞比例即为活细胞的比例；

b)annexin-v阳性-pi阴性代表凋亡早期的细胞，即四格细胞分群图中的右下群，其细胞比例即为凋亡早期细胞的比例；

c)annexin-v阳性-pi阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞，即四格细胞分群图中的右上群，其细胞比例即为晚期细胞的凋亡比例.

图2中显示，3dflotrix微载体上的细胞在冻存前的活细胞比例为90.4％；而冻存后再复苏的活细胞比列为89.6％，降幅仅在1％以内，因此本发明采用3dflotrix微载体上的细胞可以与微载体进行原位保存并复苏后保持其活性。

(3)原位细胞计数法：

1)微载体收集：将20mg含有细胞的三维微载体悬液经过70μm的细胞筛网收集后用pbs清洗一次，目的是将没有附着在微载体上的细胞清洗掉。然后将含有细胞的微载体悬液进行离心，400×g，2分钟，弃上清。

2)细胞计数：加入3ml的0.1％的结晶紫溶液(结晶紫0.1g，柠檬酸2.1g，20μl吐温-80，去离子水100ml)，37℃下2-5h后，通过细胞计数板进行计数。

3)结果分析：图3中结果可知，冷冻复苏后，3dflotrix微载体上的细胞数量保持与冷冻前较为一致，而竞品微载体(gecytodex，货号17-1271-01，购于北京智杰方远科技有限公司)由于微载体破裂，细胞散落，微载体上的细胞数量大大减少；因此本发明采用3dflotrix微载体进行细胞培养后，冷冻保存再复苏可以实现原位的三维细胞冷冻，将细胞培养及保存的全链条过程维持在三维的环境。