本发明涉及药用植物细胞工程领域，更具体地说，本发明涉及一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分—黄芪多糖和黄芪皂苷的方法。
背景技术：
黄芪又名绵芪、北芪、元芪或黄耆，是豆科黄芪属多年生草本植物，在我国分布较广，主要生长于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江、吉林、辽宁、陕西、河北、山东、宁夏等地，此外青海、四川、新疆等地区以及朝鲜、蒙古、俄罗斯亦有分布。按照《中华人民共和国药典》收录，中药黄芪为膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根，为我国传统滋补中药材，至今已有400多年的药用历史，目前仍为中医临床治疗最常用的药物之一。黄芪早在《神农本草经》中就有记载有补益强壮之功效。传统中医学认为，黄芪具有补气固表、利尿排毒、敛疮生肌、补中益气的作用。随着科学技术的飞速发展，采用现代科学技术手段研究传统中药已成为时代特色，经过研究证实，黄芪含有多种活性成分，其中最主要的有多糖类、皂苷类、黄酮类化合物，还含有多种氨基酸、微量元素和其它化合物。这些活性成分使得黄芪具有以下药理作用：1、增强机体免疫功能，参与机体免疫调节，促进免疫因子的生成；2、降血压、降血糖，治疗心血管疾病；3、抗肿瘤、抗病毒；4、清除体内自由基，抗氧化、抗衰老；5、利尿、解毒。
随着人们保健意识的增强，具有保健功效的中药以及各种衍生的保健品日益畅销，因此黄芪的需求量也持续增加。但是由于长期大量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险，因此野生黄芪已经被列为国家三级保护植物。如今黄芪中药材的来源主要是人工种植，但是人工种植还存在很多问题，如黄芪生长较为缓慢，一般从播种到采收至少需经过3年；人工种植过程中易受季节变换和病虫害的影响；种植的黄芪存在农药和重金属残留的问题；种植的黄芪中活性成分含量较野生黄芪低等。研究表明，药用植物的活性成分主要是其次生代谢产物，通过利用药用植物细胞培养来生产次生代谢产物是克服野生资源短缺、解决人工种植诸多问题的有效途径之一，也是对药材生产的根本性改革。
目前，国内外关于药用植物细胞培养的研究报道有很多，但是实际应用于生产的只占一小部分，分析原因，主要存在以下问题：次生代谢产物的产量过低，放大培养困难，植物细胞的生长速度过慢以及在培养过程中不稳定等。许多研究表明,通过调节微环境等手段可以增加植物次生代谢产物的产量。此外，利用诱导子进行有目的次生代谢产物调控也被广泛应用于植物细胞培养中。诱导子是指能够诱导植物产生防御反应的因子的统称，植物在受到诱导子的刺激时，自身会产生一系列的防御反应,如过敏反应、与植物致病有关蛋白的表达及各类抗性化合物的合成和积累等，因此诱导子可以用于提高植物次生代谢产物的含量。生物反应器培养是实现植物细胞放大培养的一种方式，其具有工作体积大，生产成本低，单位体积生产能力高，且不受时间和地点限制，可进行周年生产等优点，能为药用植物细胞培养和次生代谢产物的生产提供优化的理化环境，因此具有广阔的市场前景。
固定化植物细胞技术是运用化学或物理方法将游离的植物细胞限定在某一特定空间内，使其能够保持活性，进行正常生长代谢的技术。与植物细胞悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点，如提高抗剪切能力、保持细胞活力、促进次级代谢产物的合成与分泌、可重复使用并能提高生产效率、易于生产后处理等。如今，国内外研究者已建立了包括银杏、长春花、红豆杉等药用植物在内的50余种植物细胞的固定化培养系统，但是还未见有关黄芪细胞固定化培养的报道。为此，本发明以生产黄芪活性成分为目标，探索了黄芪细胞的固定化方法，并将固定化的黄芪细胞用于小规模的生产，获得了成功。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分—黄芪多糖和黄芪皂苷的方法，为黄芪活性成分的大规模工业化生产提供理论与技术基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：
1）黄芪外植体的消毒：选取黄芪幼嫩的茎段作为外植体，用自来水冲洗10~20min，在无菌条件下先用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗4~5次，滤纸吸干水分，获得无菌的黄芪外植体；
2）愈伤组织的诱导与增殖：将黄芪外植体切成0.5~0.7cm长的小段接种于含诱导培养基的培养皿上，置于25±1℃、黑暗条件下培养诱导出愈伤组织，选择生长良好的愈伤组织接种于含增殖培养基的三角瓶中，在相同条件下进行继代增殖培养，每21d继代1次；
3）黄芪细胞的悬浮与分散：继代2~3次后挑选出生长旺盛、质地较为疏松的愈伤组织，接入含100ml悬浮培养基的500ml三角瓶中摇床振荡培养，培养条件为25±1℃、黑暗、转速100~120r/min，每14d继代1次，继代3~4次逐渐形成稳定的黄芪细胞悬浮培养系，采用酶解法对黄芪细胞进行分散，然后将细胞悬浮液依次用0.9mm和0.1mm的筛网进行过滤，取滤液进行固定化操作；
4）黄芪细胞的固定化：配制浓度为40g/l的无菌海藻酸钠溶液，并添加0.1%（w/v）的鼠李糖脂和2%（w/v）的fe3o4，将步骤3）的滤液与此海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器将混合液逐滴滴入浓度为20g/l的无菌cacl2溶液中，在磁力搅拌器的搅拌下形成直径约为3mm的固定化凝胶珠，静置30min后放入冰箱过夜，取出用生理盐水洗涤2~3次；
5）固定化细胞的磁场处理：将固定化凝胶珠置于无菌三角瓶中，放入磁场强度为500gs的低强磁场中处理30min；
6）固定化细胞的培养：使用气升式生物反应器进行培养，在无菌条件下，将磁化后的固定化凝胶珠以10%的接种量接入生产培养基中，装液量为50~60%，通气量为0.10~0.15vvm，温度为25±1℃，在培养的第8d接入5%的芽孢杆菌混悬液，100μmol/l的硫氢化钠，继续培养6-8d后放出培养液，用于黄芪活性成分（黄芪多糖和黄芪皂苷）的分离纯化。
所述步骤2）中诱导培养基的成分为ms基本培养基+1.0g/l水解乳蛋白+0.5mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.1mg/l氯化胆碱+30g/l蔗糖+5g/l结冷胶，ph5.6~6.0。
所述步骤2）中增殖培养基的成分为ms基本培养基+2.0g/l水解乳蛋白+0.5mg/ld-泛酸钙+0.6mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+1.0mg/lkt-30+30g/l蔗糖+5g/l结冷胶，ph5.6~6.0。
所述步骤3）中愈伤组织的接种量为40-50g/l。
所述步骤3）中悬浮培养基成分为：ms基本培养基+2.0~3.0g/l水解乳蛋白+0.3~0.5mg/ld-泛酸钙+1.4~1.8mg/l亚精胺+0.5~0.7mg/l6-ba+0.1~0.3mg/lnaa+0.8~1.2mg/lkt-30+30~40g/l蔗糖，ph5.6~6.0。
所述步骤3）中酶解法的具体操作为：配制浓度为1.0g/l的果胶酶液（酶活40u/mg），向黄芪细胞悬浮液中加入20%体积的该果胶酶液，在28℃、转速60r/min的摇床上酶解24h。
所述步骤4）中滤液与海藻酸钠溶液的体积比为1：4。
所述步骤5）中生产培养基的成分为：ms基本培养基+16~20mg/l苯丙氨酸+9~11mg/l酪氨酸+8~10mg/ll-肉桂酸+6.1~6.5mg/l大豆低聚肽+120~130μmol/l茉莉酸甲酯+0.5~0.7mg/l6-ba+0.1~0.3mg/lnaa+0.8~1.2mg/lkt-30+26~30g/l蔗糖+20~24g/l山梨醇，ph5.6~6.0。
所述步骤5）中芽孢杆菌混悬液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的lb斜面种子培养24小时后，分别按照4%和2%的接种量接入lb液体培养基中，置于摇床振荡培养，培养条件为温度35~37℃、转速160~180r/min，培养20~24h。
本发明的优点和积极效果是：
1）本发明摸索出了适用于黄芪细胞的包埋固定化方法，通过在包埋剂中添加表面活性剂鼠李糖脂来提高黄芪细胞释放次生代谢物的能力，从而提高培养液中活性成分的含量；在包埋剂中添加磁粉fe3o4，并对固定化黄芪细胞进行磁场处理，磁场处理产生的磁场效应能够促进黄芪细胞的生长代谢，还能激活黄芪细胞的防御反应，从而提高某些次生代谢产物的合成能力，使培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷的量有所提高；磁粉fe3o4经过外加磁场处理具有了磁性，成为“小磁场”，从而延续了这种磁场效应。
2）本发明在固定化黄芪细胞的培养过程中加入芽孢杆菌进行共培养，芽孢杆菌是黄芪内共生菌中的一类，长期与宿主协同进化并形成了互惠互利的共生关系，能够诱导黄芪细胞中次生代谢产物积累，并促进次生代谢产物向胞外的释放；加入的硫氢化钠是h2s气体的供体，h2s气体是重要的逆境响应信号分子，同样能够诱导黄芪细胞中次生代谢产物的积累，此外本发明的生产培养基中还添加了其它诱导子，大大提高了培养液中活性成分的含量。
3）本发明初步建立利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法。与直接利用悬浮细胞生产相比，固定化细胞既达到组织化要求又限制了生长，从而显著提高了次生代谢产物的产量，具有极大的发展前景。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
下述实施例中，使用的黄芪为人工种植的膜荚黄芪，来源于山东天合中药材种植基地；使用的耗材、试剂、菌种等都可以通过商业途径购买得到。
实施例1
按照本发明提供的利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法进行以下试验：
1）黄芪外植体的消毒：选取黄芪幼嫩的茎段作为外植体，用自来水冲洗10~20min，在无菌条件下先用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗4~5次，滤纸吸干水分，获得无菌的黄芪外植体。
2）愈伤组织的诱导与增殖：将黄芪外植体切成0.5~0.7cm长的小段接种于含诱导培养基（成分为ms基本培养基+1.0g/l水解乳蛋白+0.5mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.1mg/l氯化胆碱+30g/l蔗糖+5g/l结冷胶，ph5.8）的培养皿上，置于25℃、黑暗条件下培养诱导出愈伤组织，选择生长良好的愈伤组织接种于含增殖培养基（ms基本培养基+2.0g/l水解乳蛋白+0.5mg/ld-泛酸钙+0.6mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+1.0mg/lkt-30+30g/l蔗糖+5g/l结冷胶，ph5.8）的三角瓶中，在相同条件下进行继代增殖培养，每21d继代1次。
3）黄芪细胞的悬浮与分散：继代2~3次后挑选出生长旺盛、质地较为疏松的愈伤组织，以45g/l的接种量接入含100ml悬浮培养基（成分为ms基本培养基+2.5g/l水解乳蛋白+0.4mg/ld-泛酸钙+1.6mg/l亚精胺+0.6mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+1.0mg/lkt-30+35g/l蔗糖，ph5.8）的500ml三角瓶中摇床振荡培养，培养条件为25℃、黑暗、转速110r/min，每14d继代1次，继代3~4次逐渐形成稳定的黄芪细胞悬浮培养系；配制浓度为1.0g/l的果胶酶液（酶活40u/mg），向黄芪细胞悬浮液中加入20%体积的该果胶酶液，在28℃、转速60r/min的摇床上酶解24h使黄芪细胞分散，然后将细胞悬浮液依次用0.9mm和0.1mm的筛网进行过滤，取滤液进行固定化操作。
4）黄芪细胞的固定化：配制浓度为40g/l的无菌海藻酸钠溶液，并添加0.1%（w/v）的鼠李糖脂和2%（w/v）的fe3o4，将步骤3）的滤液与此海藻酸钠溶液以1：4的体积比混合均匀，用注射器将混合液逐滴滴入浓度为20g/l的无菌cacl2溶液中，在磁力搅拌器的搅拌下形成直径约为3mm的固定化凝胶珠，静置30min后放入冰箱过夜，取出用生理盐水洗涤2~3次。
5）固定化细胞的磁场处理：将固定化凝胶珠置于无菌三角瓶中，放入磁场强度为500gs的低强磁场中处理30min。
6）固定化细胞的培养：使用20l气升式生物反应器进行培养，在无菌条件下，将磁化后的固定化凝胶珠以10%的接种量接入生产培养基中，装液量为55%，通气量为0.12vvm，温度为25℃，在培养的第8d接入5%的芽孢杆菌混悬液（制备方法为：将枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的lb斜面种子培养24小时后，分别按照4%和2%的接种量接入lb液体培养基中，置于摇床振荡培养，培养条件为温度35℃、转速160r/min，培养22h），100μmol/l的硫氢化钠，继续培养7d后放出培养液，用于黄芪活性成分的分离纯化；其中生产培养基的成分为：ms基本培养基+18mg/l苯丙氨酸+10mg/l酪氨酸+9mg/ll-肉桂酸+6.3mg/l大豆低聚肽+125μmol/l茉莉酸甲酯+0.6mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+1.0mg/lkt-30+28g/l蔗糖+22g/l山梨醇，ph5.8。
实施例2鼠李糖脂对培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量的影响
按照实施例1提供的方法进行试验，步骤4）中鼠李糖脂的添加量分别为0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，培养结束后对放出的培养液进行黄芪多糖和黄芪皂苷的含量测定，结果见下表1。
从表1可以看出，在0~0.1%范围内，随着鼠李糖脂添加量的增加，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量也逐渐增加，当鼠李糖脂添加量为0.1%时，黄芪多糖含量为68.5mg/l，黄芪皂苷含量为42.3mg/l，为最大值，但随着鼠李糖脂添加量的继续增加，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量反而逐渐降低。鼠李糖脂是一种无毒害的表面活性剂，添加鼠李糖脂能够增强黄芪细胞膜的通透性，从而提高黄芪细胞释放次生代谢物的能力，但是鼠李糖脂添加过多可能会破坏细胞膜的完整性，导致部分细胞死亡，因此本试验中0.1%为最适鼠李糖脂添加量。
实施例3fe3o4和磁场处理对培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量的影响
按照实施例1提供的方法进行试验，步骤4）中不添加fe3o4并取消步骤5），培养结束后对放出的培养液进行黄芪多糖和黄芪皂苷的含量测定，结果见下表2。
从表2可以看出，实施例1中黄芪多糖含量比实施例2提高了16.3mg/l，黄芪皂苷含量比实施例2提高了13.7mg/l，表明添加磁粉fe3o4并对固定化黄芪细胞进行磁场处理产生了有益效果。磁场处理产生的磁场效应能够促进黄芪细胞的生长代谢，还能激活黄芪细胞的防御反应，从而提高某些次生代谢产物的合成能力，使培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷的量有所提高；磁粉fe3o4经过外加磁场处理具有了磁性，成为“小磁场”，从而延续了这种磁场效应。
实施例4芽孢杆菌混悬液对培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量的影响
按照实施例1提供的方法进行试验，步骤6）中芽孢杆菌混悬液的接种量分别为0、2.5%、5%、7.5%、10%，培养结束后对放出的培养液进行黄芪多糖和黄芪皂苷的含量测定，结果见下表3。
从表3可以看出，在0~5%范围内，随着芽孢杆菌混悬液接种量的增加，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量也逐渐增加，当芽孢杆菌混悬液接种量为5%时，黄芪多糖含量为69.0mg/l，黄芪皂苷含量为42.7mg/l，为最大值，但随着混悬液接种量的继续增加，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量反而逐渐降低。芽孢杆菌是黄芪内共生菌中的一类，长期与宿主协同进化并形成了互惠互利的共生关系，能够诱导黄芪细胞中次生代谢产物积累，并促进次生代谢产物向胞外的释放。但是当芽孢杆菌混悬液接种量过多时，芽孢杆菌在培养基中大量增殖，消耗了培养基中的营养物质，不利于黄芪细胞的生长，因此5%为最适芽孢杆菌混悬液接种量。
实施例5硫氢化钠对培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量的影响
按照实施例1提供的方法进行试验，步骤6）中硫氢化钠的浓度分别为0、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l，培养结束后对放出的培养液进行黄芪多糖和黄芪皂苷的含量测定，结果见下表4。
从表4可以看出，在0~100μmol/l范围内，随着硫氢化钠浓度的增加，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量也逐渐增加，当硫氢化钠浓度为100μmol/l时，黄芪多糖含量为67.7mg/l，黄芪皂苷含量为40.3mg/l，为最大值，当硫氢化钠浓度为200μmol/l时，培养液中黄芪多糖和黄芪皂苷含量降低了。硫氢化钠是h2s气体的供体，h2s气体是重要的逆境响应信号分子，能够诱导黄芪细胞中次生代谢产物的积累，但同时h2s气体也具有一定的毒性，如果浓度过高会对黄芪细胞产生毒害作用，因此本试验中100μmol/l为最适硫氢化钠浓度。
实施例6固定化细胞与悬浮细胞培养的比较
按照实施例1步骤1）、2）、3）的方法制备好黄芪细胞悬浮液，进过磁场处理后将悬浮液以10%的接种量接入生产培养基中进行培养，培养方法与实施例1步骤6）相同，培养结束后对放出的培养液进行黄芪多糖和黄芪皂苷的含量测定，结果见下表5。
从表5可以看出，实施例1中黄芪多糖含量比实施例6提高了19.3mg/l，黄芪皂苷含量比实施例6提高了20.1mg/l，表明固定化细胞培养比悬浮细胞培养更能促进次生代谢产物的积累，提高活性成分的含量。培养细胞的组织化水平越接近整体植物水平，就越能以与整体植物相同的方式对环境因子的刺激起反应。而固定化细胞就越近乎体内环境而对培养中的因子起反应。第二，固定化细胞的生长速度一般低于悬浮培养细胞的生长速度，而生长速度的降低与次生代谢产物的积累之间具有相关性，固定化细胞既达到组织化要求又限制了生长，因此显著提高了次生代谢产物的产量。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。