一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法与流程

本发明是关于细胞生物学技术领域，特别是关于一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法。

背景技术：

自billings和neube于19世纪首先用自体脂肪填充软组织缺损至今已达一百多年。近年来随着脂肪抽吸技术进步和整形美容的蓬勃发展，自体脂肪移植已成为整形外科最重要的治疗手段之一。自体脂肪移植几乎可用于全身各个部位的软组织缺损填充，如皱纹、凹陷性瘢痕、隆胸和面部软组织填充等。

自体脂肪移植在整形外科应用越来越广泛，但其移植后成活率不高，常需少量、反复多次移植才能提高脂肪移植成活率，以达到满意效果。但反复、多次脂肪移植给患者造成了多次抽脂的痛苦、增加了风险及费用，同时也增加了医生的工作负担。如果能实现一次抽取足够量的脂肪并于体外长期冷冻储存，需要移植时将冷冻脂肪进行复苏，则能够避免多次脂肪组织抽取，从而做到“一次吸脂、多次使用”，减少了患者多次抽指造成的痛苦，降低了治疗费用，同时还减少医生的工作量，具有重要的临床意义。最早在1990年，fournier首次提出了冷冻法保存脂肪可能性，认为冷冻脂肪移植后的效果与新鲜脂肪无明显差异。随后又有研究者提出，脂肪组织冷冻储存两年仍有活力并可用于移植，且是安全的，为长期冻存脂肪组织移植的安全性提供了有力的支持。

低温冷冻保存(-196℃)脂肪颗粒组织最大优点是脂肪细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，当温度降到一定程度时，细胞内所有化学变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存；低温保存的脂肪颗粒以一定方式复苏后，又具有存活能力。

但脂肪颗粒在冻存过程中容易受细胞内外未结冰溶液中高浓度电解质的损伤、细胞内水分结成冰晶的损伤，所以需要冷冻保护剂。二甲基亚砜(dmso)具有膜通透性好和渗透性强等特点，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，是最常用冻存剂。但dmso具有细胞毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，具有肝肾毒性和血管毒性，dmso应用存在潜在的致癌风险，使得dmso作为冻存剂在临床应用中受到很大限制。另外，dmso作为冻存剂常与胎牛血清(fbs)一起使用，保护细胞膜，提高复苏后的细胞活性，但fbs可能含有疯牛病病毒，在临床应用上存在潜在的风险。

因此，脂肪移植后为了达到脂肪移植物保持最好的生物活性和组织结构，仍然需要对脂肪颗粒冷冻保存技术进行改进。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种脂肪颗粒组织冻存液，其解决了现有脂肪颗粒组织冻存液具有毒性且存在潜在风险的问题，可使得冻存后的脂肪颗粒组织具有更高的活力，提高了脂肪组织复苏后的存活率，能够使脂肪移植物保持最好的生物活性和组织结构。

为实现上述目的，本发明提供了一种脂肪颗粒组织冻存液，所述脂肪颗粒组织冻存液包括：海藻糖、羟基乙基淀粉、l-抗坏血酸、白蛋白、人胰岛素、碱性成纤维生长因子以及基础培养基；其中，所述海藻糖的浓度为50-90g/l，所述羟基乙基淀粉的浓度为40-90g/l，所述l-抗坏血酸的浓度为32-80mg/l，所述白蛋白的浓度为30-70g/l，所述人胰岛素的浓度为10-30mg/l，所述碱性成纤维生长因子的浓度为10-30ug/l。

上述海藻糖在脂肪颗粒组织细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征；羟基乙基淀粉可以优先同细胞中的水分子相结合，降低细胞中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，从而保护脂肪颗粒组织免受冷冻损伤；l-抗坏血酸是体内一种重要的辅酶和抗氧化剂，可参与细胞内呼吸链作用，从而有利于细胞的完整存活和生长发育；人胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，对脂肪细胞中糖代谢、脂肪代谢和蛋白代谢起着关键调节作用，对脂肪细胞的存活起到促进作用；碱性成纤维生长因子(bfgf)为一种多肽类生长因子，具有多种生物活性，可促进脂肪细胞增殖，是脂肪细胞生长必要的生长因子。

在一优选的实施方式中，所述基础培养基为dmem/f12。

在一优选的实施方式中，所述海藻糖浓度为60-80g/l，所述羟基乙基淀粉的浓度为50-80g/l，所述白蛋白的浓度为40-60g/l，所述人胰岛素的浓度为10-15mg/l，所述l-抗坏血酸的浓度为50-60mg/l，所述碱性成纤维生长因子的浓度为20-30ug/l。

在一优选的实施方式中，所述海藻糖浓度为75.6g/l，所述羟基乙基淀粉的浓度为60g/l，所述白蛋白浓度为50g/l，所述l-抗坏血酸的浓度为58mg/l，所述人胰岛素的浓度为12mg/l，所述碱性成纤维生长因子的浓度为25ug/l。

在一优选的实施方式中，所述白蛋白为人血白蛋白。

上述人血白蛋白能够保护脂肪颗粒组织不受伤害，提高了复苏后的脂肪颗粒组织活性。

本发明的另一目的在于提供一种上述脂肪颗粒组织冻存液的配制方法，包括以下步骤：

(1)在基础培养基中添加海藻糖、羟基乙基淀粉、l-抗坏血酸、人血白蛋白、人胰岛素、碱性成纤维生长因子，得到混合液；

(2)调整所述混合液ph值为7.2～7.4，然后用过滤器进行过滤除菌，得到脂肪颗粒组织冻存液，并于-20℃下进行避光保存。

在一优选的实施方式中，对步骤(2)所得混合液进行进一步检测，当检测所得渗透压为260～320mosm，细菌和真菌呈现阴性，衣原体和支原体呈现阴性，以及内毒素为0～0.5eu/ml时，所述脂肪颗粒组织冻存液合格。

在一优选的实施方式中，所述过滤器为0.22um过滤器。

本发明的另一目的在于提供一种脂肪颗粒组织的冻存方法，包括：将上述脂肪颗粒组织冻存液与脂肪颗粒组织混合。

与现有技术相比，根据本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的脂肪颗粒组织冻存液不含有二甲基亚砜和胎牛血清，对细胞没有毒性，不会使蛋白质变性，使用安全，能够在临床上广泛应用。

(2)脂肪颗粒组织冻存液中采用的海藻糖是一种非穿透性冷冻保护剂，在低温环境条件下，海藻糖在脂肪颗粒组织细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征；采用的羟基乙基淀粉可以优先同细胞中的水分子相结合，降低细胞中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，从而保护脂肪颗粒组织免受冷冻损伤；采用的人血白蛋白能够保护脂肪颗粒组织不受伤害，提高了复苏后的脂肪颗粒组织活性；l-抗坏血酸是体内一种重要的辅酶和抗氧化剂，可参与细胞内呼吸链作用，从而有利于细胞的完整存活和生长发育；采用的人胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，对脂肪细胞中糖代谢、脂肪代谢和蛋白代谢起着关键调节作用，对脂肪细胞的存活起到促进作用；采用的碱性成纤维生长因子(bfgf)为一种多肽类生长因子，具有多种生物活性，可促进脂肪细胞增殖，是脂肪细胞生长必要的生长因子。

(3)本发明提供的脂肪颗粒组织冻存液用于脂肪颗粒组织冷冻与采用胎牛血清(fbs)+质量分数为10％的二甲基亚砜(dmso)所配制的冻存液冻存后的脂肪颗粒组织相比，脂肪颗粒组织具有更高的活力；高于采用胎牛血清(fbs)+质量分数为10％的二甲基亚砜(dmso)配制的冻存液所冻存脂肪颗粒组织的细胞活率大约8％，提高了脂肪组织复苏后的存活率；能够提高脂肪颗粒组织的成脂诱导效率，脂肪组织移植后能够使脂肪移植物保持较高的生物活性和组织结构。

(4)本发明提供的脂肪颗粒组织冻存液中成分明确简单，成本较低。

附图说明

图1是根据本发明实施例2中脂肪颗粒组织冻存图片；其中，图1-a为实施例2中脂肪颗粒组织冻存前图片，图1-b为实施例2中脂肪颗粒组织冻存6个月后图片。

图2是根据本发明实验例1中肌酸激酶检测脂肪颗粒冻存后的细胞活力图。

图3是根据本发明实验例2中台盼蓝染色法检测脂肪颗粒冻存后的细胞活率图。

图4是根据本发明实验例3中脂肪颗粒冻存后的脂肪干细胞成脂分化鉴定图；其中，图4-a为对照组，图4-b为实验组。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

如下实施例中使用的试剂及其来源如下：

实施例1：脂肪颗粒组织冻存液的配制

具体步骤包括：

在dmem/f12中添加海藻糖、羟基乙基淀粉、l-抗坏血酸、人血白蛋白、人胰岛素、碱性成纤维生长因子，得到混合液，其中混合液中海藻糖浓度为75.6g/l，羟基乙基淀粉的浓度为60g/l，人血白蛋白浓度为50g/l，l-抗坏血酸的浓度为58mg/l，人胰岛素的浓度为12mg/l，碱性成纤维生长因子的浓度为25ug/l；

(2)调整所述混合液ph值为7.2-7.4，然后用0.22um的过滤器进行过滤除菌，得到脂肪颗粒组织冻存液，并于-20℃下进行避光保存；

(3)对步骤(2)所得混合液进行进一步检测，当检测所得渗透压为260～320mosm，细菌和真菌呈现阴性，衣原体和支原体呈现阴性，以及内毒素为0～0.5eu/ml时，所述脂肪颗粒组织冻存液合格。

实施例2：人脂肪颗粒组织的冻存

(1)自体脂肪的采取

常规消毒铺无菌巾，于吸脂区域边缘以2％利多卡因局部麻醉；沿皮肤做约0.3cm切口，止血钳于皮下稍做钝性分离，并在吸脂区均匀注射肿胀麻醉液；麻醉起效后，将抽吸针插入皮下脂肪层，连接20ml注射器，将注射器抽成负压后用注射器针头帽将拉出的注射器管心顶住，保持负压状态，持抽吸针柄抽吸，抽吸脂肪颗粒100ml。

(2)脂肪颗粒的纯化

将抽好的脂肪颗粒(100ml)转移到250ml无菌瓶，加入等体积生理盐水，静止30s-1min分层后，用25ml移液管将下层的红细胞、麻醉剂和生理盐水混合液弃掉。重复上述步骤直到洗涤液清亮为止。

(3)脂肪颗粒组织的冻存

实验组冻存液：实施例1所配制的脂肪颗粒组织冻存液

对照组冻存液：胎牛血清(fbs)+质量分数为10％的二甲基亚砜(dmso)

将纯化后的脂肪颗粒组织分别加入等体积实验组冻存液和对照组冻存液，混匀后装到50ml冻存袋中；将冻存袋放4℃下30min，于-20℃保存1h，然后-80℃条件下过夜后转移到气相液氮柜存储。

实验例1：肌酸激酶检测脂肪颗粒冻存后的细胞活力

其中，肌酸激酶检测试剂盒购买中生北控生物公司

具体实验步骤包括：

(1)取实施例2冻存6个月的脂肪颗粒组织，置于37℃水浴迅速解冻，待冻存液完全溶解后及时吸除保护剂，用生理盐水洗涤3次；

(2)洗去残余冻存液后放入织研磨器内，0℃下研磨脂肪颗粒组织；

(3)脂肪颗粒组织匀浆在5000r/min条件下离心2min，吸取中层液0.25ml，加等体积生理盐水，在37℃条件下加入肌酸激酶(ck)测试液2.5ml，分别于2min及3min时吸取1ml混合液测定od值a1及a2，酶活力可用△od值表示(△od＝a2-a1)。

实验组和对照组脂肪颗粒冻存6个月后，用肌酸激酶试剂盒分析脂肪细胞活力，由图2结果显示，实验组冻存脂肪颗粒组织od值明显高于对照组，也就是说实验组冻存脂肪颗粒组织活力明显高于对照组。因此，采用实施例1所配制的脂肪颗粒组织冻存液冻存的脂肪颗粒组织与采用胎牛血清(fbs)+质量分数为10％的二甲基亚砜(dmso)所配制的冻存液冻存后的脂肪颗粒组织相比，脂肪颗粒组织具有更高的活力。

实验例2：台盼蓝染色法检测脂肪颗粒冻存后的细胞存活率

具体实验步骤包括：

(1)取实施例2冻存6个月的脂肪颗粒，置于37℃水浴迅速解冻，待冻存液完全溶解后及时吸除保护剂，加入等体积0.1％的i型胶原酶，37℃水浴摇床消化1h；

(2)加入生理盐水终止消化，100um细胞筛过滤，静置2min；

(3)待滤液分层后，取油脂下方的细胞100ul；

(4)加入质量分数为0.4％的台盼兰染液100ul，均匀混合，染色3min；

(5)吸取约10ul混合液从侧面滴入放有盖玻片的血球计算板上，于倒置显微镜下野德观察计算；

(6)数据分析，脂肪细胞活率＝活细胞数/细胞总数×100％。

实验组和对照组脂肪颗粒冻存6个月后，用台盼蓝染色法检测脂肪细胞的存活率，结果如图3结果所示，实验组冻存脂肪颗粒组织的细胞存活率为90.23％±1.52％，对照组脂肪颗粒组织的细胞存活率为82.26％±1.67％，因此，实验组冻存脂肪颗粒组织的细胞活率高于对照组冻存脂肪颗粒组织的细胞活率大约8％。

实验例3：脂肪颗粒组织冻存后的脂肪干细胞成脂分化鉴定

诱导脂肪干细胞成脂分化培养基如下：

成脂诱导培养基：dmem(高糖)+10％的fbs+1umol/l地塞米松+0.5mmol/l的bmx+0.2mmol/l的吲哚美辛+10g/ml的胰岛素

实验步骤：

取实施例2冻存6个月的脂肪颗粒组织，置于37℃水浴迅速解冻，待冻存液完全溶解后及时吸除保护剂，加入等体积0.1％的i型胶原酶，37℃水浴摇床消化1h；加入脂肪干细胞培养基(厂家：helios，货号：87hf42)终止消化，2000rpm/min离心10min，用脂肪干细胞培养基悬浮沉淀细胞，以1×105/孔接种到6孔板中，待细胞达到70％汇合时更换培养基为成脂诱导培养基；每3天换液，诱导14天后用油红染色定性观察体外诱导分化结果。

其中，油红o储存液制备方法如下：称取0.25g油红干粉，溶于50ml异丙醇中，配成0.5％油红o储存液，闭光保存；油红o储存液的工作浓度为，油红o：去离子水＝3：2，用0.22um针头滤器过滤。

将细胞弃去诱导培养基，pbs漂洗1遍后使用4％多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，用d-pbs漂洗2次后加入工作浓度油红o覆盖住板底，染色20min，用75％乙醇漂洗一次再用d-pbs多次洗涤，显微镜观察。

所得成脂诱导分化结果如图4所示。其中，图4-a为对照组脂肪诱导分化结果，图4-b为实验组脂肪诱导分化结果，结果显示脂肪诱导分化14天后对照组和实验组均出现了大量的脂滴，经油红o染色后细胞内出现大量红染颗粒，且实验组出现红染颗粒明显多于对照组，说明了实验组成脂诱导效率要高于对照组。实验表明，本发明的脂肪颗粒组织冻存液能够保持脂肪颗粒较高的生物活性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。