一种红托竹荪试管母种的生产方法与流程

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种红托竹荪试管母种的生产方法。

背景技术：

目前，国内食用菌母种培养基普遍采用pda培养基，pda培养基具有生产成本低，原料易得，制备简便等优点，但是以pda培养基为母种培养基存在菌丝只生长在培养基表面，不进入培养基内部生长的问题。而采用pda培养基制备红托竹荪母种时，相较于其他大多数食用菌，红托竹荪菌种的菌丝极为纤弱，且生长速度极为缓慢，约0.5～1mm/d，长满10cm斜面需要50～60天，且生长20d左右气生菌丝开始变紫红色，出现老化现象，不利于后续转管或菌种扩繁，因此目前的母种生产方法从根源上限制了红托竹荪的产业化栽培。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红托竹荪试管母种的生产方法，具有培养时间短且菌丝活力高的特点。

本发明提供的一种红托竹荪试管母种的生产方法，包括以下步骤：

1)调整木屑培养基的含水量至60～70％，灭菌，制成斜面培养基；

所述木屑培养基包括以下质量百分含量的组分：60～80％木屑、5～20％麦麸、5～20％玉米面、1～10％黄豆面、0.5～1.5％石膏、0.5～2％糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾和0.1～0.5％硫酸镁；所述木屑包括阔叶落叶树种的木材加工得到的木屑；

2)在无菌环境下，将表面消毒的红托竹荪子实体从菌柄处纵剖，在菌柄剖开面的中部组织分割成组织块，将每3块组织块按照3等分的距离接种于一支斜面培养基上，让组织块紧贴培养基，进行母种培养。

优选的，所述木屑培养基包括以下质量百分含量的组分：65～75％木屑、10～15％麦麸、8～15％玉米面、2～5％黄豆面、0.8～1.2％石膏、0.8～1.5％糖、0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.1～0.3％硫酸镁。

优选的，所述木屑培养基包括以下质量百分含量的组分：70％木屑、14.8％麦麸、10％玉米面、3％黄豆面、1％石膏、1％糖、0.1％磷酸二氢钾和0.1％硫酸镁。

优选的，所述木屑的粒度为5～50目。

优选的，所述木屑培养基的灭菌方法在0.11～0.13mpa下高压蒸汽灭菌30min。

优选的，所述阔叶落叶树种包括杨柳科、壳斗科、桑科和胡桃科树种中的一种或多种。

优选的，所述红托竹荪子实体选择7～8成熟、健康的子实体。

优选的，红托竹荪子实体消毒用溶液为高锰酸钾溶液或二氯异氰尿酸钠溶液，所述高锰酸钾溶液或二氯异氰尿酸钠溶液液的浓度为0.05～0.1％。

优选的，所述母种培养的温度为20～25℃。

优选的，所述母种培养的时间为25～30d。

本发明提供的一种红托竹荪试管母种的生产方法，以木屑培养基为红托竹荪试管母种用培养基，其中阔叶落叶树种木屑对红托竹荪菌种菌丝具有较高的利用性能，可持续为菌丝生长提供营养，配合在短期内麦麸和黄豆面提供氮源，玉米面和糖提供碳源以及石膏、磷酸二氢钾和硫酸镁提供无机盐，使菌丝快速适应新环境的营养，保证了菌丝旺盛、快速的生长。采用本发明提供的红托竹荪试管母种培养基制备母种，红托竹荪菌种长满试管，生长速度具有明显优势，同时菌丝洁白粗壮，活力强，而在相同的培养条件下，采用常规母种培养基pda培养基制备红托竹荪试管母种，菌丝纤弱，且菌丝生长速度缓慢未充满试管，而且菌丝有老化、萎蔫现象出现，这表明本发明提供的红托竹荪试管母种培养基比常规pda培养基在红托竹荪母种制备中具有无可比拟的优势。同时在组织分离接种时，采用三点接种法替代了传统生产方法中一点接种方法，保证了组织块快速长出菌丝，同时利用木屑培养基具有营养物质丰富，菌丝吸收利用率好、长效提供营养物质的特点，采用三点接种方法避免了组织块对营养需求量大而随着培养时间长的造成的营养供应不足的问题，因此，本发明提供的生产方法克服了长久以来红托竹荪母种制备的技术障碍，为大规模栽培红托竹荪提供了保证。

附图说明

图1为本发明提供的的生产方法培养24d得到的红托竹荪试管母种形态图；

图2为采用pda培养基培养24d得到的红托竹荪试管母种形态图。

具体实施方式

本发明提供的一种红托竹荪试管母种的生产方法，包括以下步骤：

1)调整木屑培养基的含水量至60～70％，灭菌，制成斜面培养基；

所述木屑培养基包括以下质量百分含量的组分：60～80％木屑、5～20％麦麸、5～20％玉米面、1～10％黄豆面、0.5～1.5％石膏、0.5～2％糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾和0.1～0.5％硫酸镁；所述木屑包括阔叶落叶树种的木材加工得到的木屑；

2)在无菌环境下，将表面消毒的红托竹荪子实体从菌柄处纵剖，在菌柄剖开面的中部组织分割成组织块，将每3块组织块按照3等分的距离接种于一支斜面培养基上，让组织块紧贴培养基，进行母种培养。

本发明调整木屑培养基的含水量至60～70％，灭菌，制成斜面培养基。在本发明中，所述木屑培养基包括以下质量百分含量的组分：60～80％木屑、5～20％麦麸、5～20％玉米面、1～10％黄豆面、0.5～1.5％石膏、0.5～2％糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾和0.1～0.5％硫酸镁；优选包括以下质量百分含量的组分：65～75％木屑、10～15％麦麸、8～15％玉米面、2～5％黄豆面、0.8～1.2％石膏、0.8～1.5％糖、0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.1～0.3％硫酸镁，更优选包括以下质量百分含量的组分：70％木屑、14.8％麦麸、10％玉米面、3％黄豆面、1％石膏、1％糖、0.1％磷酸二氢钾和0.1％硫酸镁。所述木屑包括阔叶落叶树种的木材加工得到的木屑。所述阔叶落叶树种包括桦木科、杨柳科、壳斗科、桑科和胡桃科树种中的一种或多种。红托竹荪菌种能够在快速吸收利用所述温带阔叶落叶树种木材提供的营养物质，并且使菌丝长势粗壮快速。而研究发现红托竹荪菌种对树种种类中营养物质的利用具有选择性，例如对针叶树木则无法利用。为了说明红托竹荪菌种对阔叶落叶树种木屑的利用情况，本发明以桦木科桦树和杞木、杨柳科中杨树、壳斗科中的板栗树、桑科的桑树和胡桃科的胡桃树为例加以说明，但这并不能理解为对本发明保护范围的限制。所述木屑的粒度优选为5～50目，更优选为30目。本发明对所述木屑培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域常规培养基的配制方法即可。所述木屑培养基的灭菌方法优选在0.11～0.13mpa下高压蒸汽灭菌30min。灭菌的压力优选为0.12mpa。制成斜面培养基的方法将木屑培养基在试管中铺成斜面10cm的平整斜面。

得到斜面培养基后，本发明在无菌环境下，将表面消毒的红托竹荪子实体从菌柄处纵剖，在菌柄剖开面的中部组织分割成组织块，将每3块组织块按照3等分的距离接种于一支斜面培养基上，让组织块紧贴培养基，进行母种培养。

在本发明中，所述红托竹荪子实体优选7～8成熟、健康的子实体。7～8成熟的子实体根据本领域经验丰富的竹荪养殖人员的经验判断即可。

在本发明中，红托竹荪子实体消毒用溶液优选为高锰酸钾溶液或二氯异氰尿酸钠溶液，所述高锰酸钾溶液或二氯异氰尿酸钠溶液的浓度为0.05～0.1％；所述溶液的消毒浸泡时间优选为1～2min，更优选为1.5min。

在本发明中，所述组织块的规格为5～7mm×7～10mm。让组织块紧贴培养基的方法用接种针轻轻压按组织块，使所述组织块稳固接触到培养基，从而保证组织块在培养基上萌发。

在本发明中，所述母种培养的温度优选为20～25℃，更优选为23℃。所述母种培养的时间优选为25～30d，更优选为27～28d。经过母种培养过程，组织块迅速在木屑培养基上萌发长出菌丝，由于木屑培养基中含有木屑，能够为菌丝提供丰富的营养，有利于菌丝深入培养基内部充分吸收营养物质，缩短母种培养时间，减少了污染几率，同时将培养得到母种转管时所转试管基本不感染或污染很低(约5％以下)，比常规方法制备竹荪母种时间缩短了1半时间(需要60天左右)，同时比常规方法制备的竹荪母种转管感染率(达到30-50％)有显著降低。

下面结合实施例对本发明提供的一种红托竹荪试管母种的生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、木屑培养基的配制和灭菌

配方如下：杨木木屑70％、14.8％麦麸、10％玉米面、3％黄豆面、1％石膏、1％糖、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁。

将上述组分按照配比混合，调整培养基的含水量至65％，在试管内做成10cm的斜面。

将制成斜面的培养基采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在0.13mpa条件下保持30分钟，灭菌完毕，取出冷却备用。

2、三点接种法

选择7成熟、健康的竹荪子实体，用高锰酸钾溶液消毒处理1.5min后，在超净工作台内用灭菌的接种刀将子实体纵剖成两瓣，再将内部菌柄部分纵横分割成7mm×10mm的小方块，不能切破子实体除菌柄外的组织，轻轻挑起菌柄组织块，让各组织块松动、分开，用镊子或接种针将组织块接种于培养基上，每支试管分成3等分，接3块组织块，压实，让组织块紧贴培养基。

3、母种培养

将接种有组织块的斜面培养基在25℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将发生污染的试管取出。将菌丝长满斜面的母种进行转管培养，统计转管的萌发率以及感染率。

实施例2

1、木屑培养基的配制和灭菌

配方如下：胡桃木木屑63.4％、20％麦麸、5％玉米面、10％黄豆面、0.5％石膏、0.5％糖、0.1％磷酸二氢钾、0.5％硫酸镁。

将上述组分按照配比混合，调整培养基的含水量至60％，在试管内做成10cm的斜面。

将制成斜面的培养基采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在0.11mpa条件下保持30分钟，灭菌完毕，取出冷却备用。

2、三点接种法

选择8成熟、健康的竹荪子实体，用二氯异氰尿酸钠溶液消毒处理1min后，在超净工作台(或接种箱)上用灭菌的接种刀将子实体纵剖成两瓣，再将内部菌柄部分纵横分割成5mm×7mm的小方块，不能切破子实体除菌柄外的组织，轻轻挑起菌柄组织块，让各组织块松动、分开，用镊子或接种针将组织块接种于培养基上，每支试管分成3等分，接3块组织块，压实，让组织块紧贴培养基。

3、母种培养

将接种有组织块的斜面培养基在22-25℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将发生污染的试管取出。

实施例3

1、木屑培养基的配制和灭菌

配方如下：板栗木木屑80％、5％麦麸、11.4％玉米面、1％黄豆面、1.5％石膏、0.5％糖、0.5％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁。

将上述组分按照配比混合，调整培养基的含水量至70％，在试管内做成10cm的斜面。

将制成斜面的培养基采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在0.12mpa条件下保持30分钟，灭菌完毕，取出冷却备用。

2、三点接种法

选择7-8成熟、健康的竹荪子实体，用高锰酸钾溶液消毒处理1min后，在超净工作台(或接种箱)上用灭菌的接种刀将子实体纵剖成两瓣，再将内部菌柄部分纵横分割成7mm×7mm的小方块，不能切破子实体除菌柄外的组织，轻轻挑起菌柄组织块，让各组织块松动、分开，用镊子或接种针将组织块接种于培养基上，每支试管分成3等分，接3块组织块，压实，让组织块紧贴培养基。

3、母种培养

将接种有组织块的斜面培养基在23℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将发生污染的试管取出。

实施例1～3制备的红托竹荪母种培养25-30d，菌丝长满斜面，制备的母种菌丝洁白，粗壮，长势良好，活力较强(见图1)。将培养的母种进行转管时，萌发率较高，达到100％，感染率较低，达到1％以下

对比例1

配制pda培养基，将pda培养基在0.12mpa下高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完毕，取出。将灭菌后的培养基摆斜面，待冷却后，得到pda斜面培养基。

按照实施例5的方法将红托竹荪菌种按照一点法接种至pda斜面培养基上，每种培养基重复接种3个平行。接种后在25℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将污染的斜面或未萌发的斜面剔除。统计接种成功率并拍照记录菌丝生长情况。

母种培养需要60天左右长满斜面。但是菌丝纤弱，呈现萎蔫现象，活力较低(见图2)，后续用以转管培养时，萌发率低，且感染率较高。

对比例2

按照对比例1的方法配制pda培养基，灭菌后摆斜面，冷却后得到pda斜面培养基。

按照实施例1中记载的三点接种法接种至pda斜面培养基中，接种后在25℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将污染的斜面或未萌发的斜面剔除。

结果发现，在培养15d左右时，菌丝出现萎蔫现象，菌丝颜色略发黄。分析原因可能是pda培养基营养成分有有限，加之菌丝对pda培养基中营养物质吸收利用较差的问题，出现培养过程营养供应不足，导致母种活力较低，后续用以转管培养时，萌发率低。

对比例3

用松木木屑替换实施例1中红托竹荪栽培种培养基中杨树木屑，其他操作按照实施例1记载的方法操作。

松木、杉木等基质制备栽培种培养基不能长出红托竹荪菌丝，这说明松木、杉木等基质不适合做红托竹荪培养基的基质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。