本发明涉及植物病害防治领域，具体涉及阿米替林在植物疫病防治中作为杀菌增效剂的应用。
背景技术：
植物疫病是一种毁灭性病害，其病原菌peronophthora.spp寄主范围广，常见病害有马铃薯晚疫、番茄晚疫、辣椒疫病、荔枝霜疫霉病、大豆疫病等，其中马铃薯晚疫病对我国农业生产产生巨大威胁。该病害首次受到广泛关注是在1845年的欧洲，当时晚疫病的肆虐造成了历史上著名的爱尔兰大饥荒，数百万人因此流离失所甚至死亡。另外其它如辣椒疫病目前已广泛分布于我国的辣椒种植区。辣椒在苗期、成株期都可感染疫病，而且在田间扩展迅速。疫霉病害对我国的农作物生产造成了巨大损失。kamoun等做了一项调查，经过来自15个国家的62位同行科学家投票，评选出十大卵菌纲致病菌，十大卵菌中有6个属于疫霉属。化学防治常采用苯酰胺类、羧酸酰胺类、取代苯类、有机硫类以及哌啶基噻唑异噁唑啉类等杀菌剂进行，其中，哌啶基噻唑异噁唑啉类的代表性品种氟噻唑吡乙酮被认为是人类迄今为止开发的活性最高的一个杀菌剂品种。
由于田间连续施药，病原菌抗药性发生严重，尤其是多药抗性的发生使常用药剂在部分地区植物疫病的防治中失败。常规的治理方法如药剂轮换施用和混配施用等均难以实现该病害的有效控制。因此，植物疫病的抗药性治理问题急需新的解决策略。
在此情形之下，一些农药研发机构不断设计开发新型作用机制的杀菌剂来替代现有药剂，试图解决这一抗性问题。但是，新药开发周期长、新靶标寻找困难，费用巨大，开发难度极大。针对现有杀菌剂进行增效剂开发，特别是提高杀菌剂对抗性群体的活性，将为杀菌剂抗性治理中最难解决的一类问题——多药抗性问题的治理提供有效途径。目前，对农作物疫霉抗性群体有特效的杀菌剂增效剂鲜有报道。
阿米替林是医学上一种用于治疗抑郁症的药物，有研究表明该物质具有外排蛋白竞争性抑制剂作用，发明人将其与农用杀菌剂复配应用于农作物的致病性疫霉菌的研究中，发现阿米替林具有显著提高多药抗性突变体对杀菌剂敏感性的特性。这类物质在农业上的开发应用将为有效控制植物疫霉抗药性群体的危害提供重要的借鉴。
技术实现要素：
基于上述缺陷，本发明的第一目的，是提供阿米替林在植物疫病防治中作为杀菌增效剂的应用。
阿米替林对于多种不同作用机制的杀菌剂都具有显著的增效作用。阿米替林，分子式c20h23n，化学名称3-(10,11-二氢-5h-二苯并[a,d]环庚烯-5-亚基)-n,n-二甲基-1-丙胺，英文名amitriptyline，cas号50-48-6。
本发明将阿米替林与杀菌剂混合后，对抗药性植物疫霉有很好的增效作用，可以有效提高杀菌剂的毒力作用，并降低了杀菌剂的使用剂量。
本发明一并提出如下改进：
所述杀菌增效剂中的杀菌剂为二芳胺类杀菌剂、取代苯胺类杀菌剂、哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂(其使用形式可包含以组合物的形式应用，先后分别应用等多种方式)
优选地，所述二芳胺类杀菌剂为双苯菌胺或氟啶胺；
或，所述取代苯类杀菌剂为百菌清；
或，所述哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂为氟噻唑吡乙酮。
本发明所提出的应用方法中，所述的植物疫病的致病菌为解偶联剂、多作用位点抑制剂和氧化固醇结合蛋白抑制剂中的一种或多种产生抗性的菌株；
优选地，所述的植物疫病的致病菌为双苯菌胺、氟啶胺、百菌清、氟噻唑吡乙酮中的一种或多种产生抗性的菌株；和/或，所述的植物疫病的致病菌为二芳胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂、哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂中的一种或多种的抗性菌株。本发明所提供的应用，针对上述抗性菌株具有卓越的杀菌效果。
本发明的第二个目的，是提供一种用于植物疫病防治的组合物，包括(由以下组分组成)阿米替林和杀菌剂；
优选地，所述杀菌剂为二芳胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂、哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂。本发明意外地发现，阿米替林能显著提升二芳胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂、哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂对的杀菌效果。
在所述组合物中，优选地，所述二芳胺类杀菌剂为双苯菌胺或氟啶胺。
进一步地，所述阿米替林和双苯菌胺杀菌剂的重量比为(2-128)∶1；在此范围内，阿米替林的增效效果可达3倍以上。更优选所述重量比为(16-128)∶1；
或，所述阿米替林与氟啶胺杀菌剂的重量比为(2-128)∶3；在此范围内，阿米替林的增效效果可达14倍。更优选所述重量比为(16-128)∶1。
在所述组合物中，优选地，所述取代苯类杀菌剂为百菌清。
进一步地，所述阿米替林与取代苯类杀菌剂的重量比为(1-64)∶5；在此范围内，阿米替林的增效效果可达39倍。更优选所述重量比为(2-64)∶5。
在所述组合物中，优选地，所述哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂为氟噻唑吡乙酮。
进一步地，所述阿米替林与哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂的重量比为(2500-40000)∶1；在此范围内，阿米替林的增效效果可达1.9倍。更优选所述重量比为(5000-40000)∶1。
本发明所提供的增效剂可以和杀菌剂以组合产品的形式，加工成水分散粒剂、可湿性粉剂、悬浮剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、微囊悬浮剂、种衣剂。在此不做特殊限制。
本发明意外地发现了阿米替林对二芳胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂、哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂具有增效作用，与杀菌剂混合使用能提高杀菌剂的毒力，恢复抗药性菌株对药剂的敏感性，可作为杀菌剂的增效剂使用，可用于植物疫病抗药性治理，特别是对于具备抗性的疫霉菌有更好的治理效果。
本发明的优点在于：
1.阿米替林对杀菌剂具有增效作用，与杀菌剂混合使用可以提高杀菌剂的毒力，提高抗药性菌株对杀菌剂的敏感性，并减少杀菌剂的使用量，为现有杀菌剂新制剂的开发应用提供了新的方法。
2.阿米替林多用于医学领域，对环境友好。本发明提供了该类药物的新用途，可在农业领域用于病害防治，并为植物疫病抗性治理提供了新的途径。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下各实施例中，所涉及“质量份”按照本领域理解，为重量单位，可为“g”、“kg”、“mg”、“μg”等。
以下各实施例、试验例中涉及试剂披露如下：
双苯菌胺(98％，沈阳化工研究院有限公司)，氟啶胺(98％，山东潍坊润丰化工股份有限公司厂家)，百菌清(98.5％，山东潍坊润丰化工股份有限公司)，氟噻唑吡乙酮(95％，美国杜邦公司)。
菌株来源如下：
rj-2(辣椒疫霉田间采集菌株pc3，此菌株已在期刊pesticidebiochemistryandphysiology,147:83-89,2018公开发表，经双苯菌胺药剂驯化获得的抗性突变体，由中国农业大学提供)，上述菌株经检验，双苯菌胺对该菌株的ec50为1.48μg/ml，超出敏感基线范围(0.625±0.343μg/ml)；氟啶胺对该菌株的ec50为16.54μg/ml，超出敏感基线范围(2.620±1.172μg/ml)；氟噻唑吡乙酮对该菌株的ec50为0.0014μg/ml，超出敏感基线范围(5.61×10-4μg/ml)；百菌清对该菌株的ec50为54.23μg/ml，远大于亲本菌株的ec5012.96μg/ml。验证其对二芳胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂和哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂均为抗性，为多药抗性菌株。
多药抗性辣椒疫霉为本领域技术人员从实验室药剂驯化获得的一类抗药性突变体，本领域技术人员可采用常规的药剂驯化方法，以双苯菌胺、氟啶胺、百菌清或氟噻唑吡乙酮进行驯化，获得对上述药剂抗性的突变体。
实施例1
实施例1提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数16份阿米替林和1份双苯菌胺组成。
实施例2
实施例2提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数32份阿米替林和1份双苯菌胺组成。
实施例3
实施例3提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数64份阿米替林和1份双苯菌胺组成。
实施例4
实施例4提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数128份阿米替林和1份双苯菌胺组成。
应用例1
本应用例提供阿米替林在辣椒疫病防治的杀菌增效剂的应用，其中，所述杀菌增效剂与解偶联剂杀菌剂以组合物的形式混配可以有效提高杀菌剂对辣椒疫霉的抑菌作用。
1.试验对象
实施例1-4所提供的杀菌组合物，以及双苯菌胺和阿米替林单剂。
2.试验方法
带毒培养基制备：使用有机溶剂二甲基亚砜(dmso)溶解，分别配制双苯菌胺和阿米替林母液。在pda培养基(每升葡萄糖18g，马铃薯200g，琼脂15g)添加双苯菌胺和阿米替林(对照为dmso)制成带毒培养基。
ec50的测定：双苯菌胺和阿米替林以1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的比例进行复配，分别以双苯菌胺的浓度为基准进行梯度稀释，获得杀菌剂组合物中双苯菌胺的浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10μg/ml的药液。
采用菌丝生长速率法测定杀菌剂对菌落直径扩展的抑制率，分别设置空白对照、双苯菌胺处理、阿米替林处理、双苯菌胺与阿米替林复配处理，每种处理3次重复，于25℃培养箱中黑暗培养，3d后测量菌落直径，并计算各比例复配药液及单剂药液的ec50。
抑制率按照如下公式计算：
增效性测定：测定双苯菌胺单剂、阿米替林单剂、双苯菌胺与阿米替林复配后对辣椒疫霉rj-2的ec50，计算以上各复配比例对杀菌剂的增效倍数。
数据处理：计算各处理的抑制机率值和浓度对数，绘制毒力线性回归曲线与毒力回归方程，求出ec50值。计算参数包括截距、斜率、相关系数。
增效倍数＝(杀菌剂单独使用的有效抑制中浓度ec50/杀菌剂增效剂混合使用的有效抑制中浓度ec50)-1
3.试验结果
双苯菌胺与阿米替林单剂和混剂对辣椒疫霉抗性突变体rj-2的毒力检测结果如表1所示。
增效性试验测定结果(表1)表明，阿米替林能够明显提高双苯菌胺对辣椒疫霉抗性突变体rj-2的毒力。当双苯菌胺与阿米替林在1∶16～1∶128的配比浓度下，阿米替林对双苯菌胺的增效倍数为0.4～3.8倍。其中，双苯菌胺与阿米替林以1∶128的比例复配时，相对于双苯菌胺单剂增效3.8倍，表现为最佳增效作用。
表1阿米替林对双苯菌胺抑制辣椒疫霉抗性突变体的增效作用
注：“-”表示不适合。
实施例5
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数2份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例6
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数4份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例7
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数8份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例8
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数16份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例9
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数32份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例10
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数64份阿米替林和3份氟啶胺组成。
实施例11
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数128份阿米替林和3份氟啶胺组成。
应用例2
本应用例提供阿米替林在辣椒疫病防治的杀菌增效剂的应用，其中，所述杀菌增效剂与解偶联剂杀菌剂以组合物的形式混配可以有效提高杀菌剂对辣椒疫霉的抑菌活性。
1.试验对象
解偶联剂杀菌剂(氟啶胺)单剂、实施例5-11所提供的组合物和阿米替林单剂。
2.试验方法
带毒培养基制备：使用有机溶剂二甲基亚砜(dmso)溶解，分别配制氟啶胺和阿米替林母液。在pda培养基(每升葡萄糖18g，马铃薯200g，琼脂15g)添加氟啶胺和阿米替林(对照为dmso)制成带毒培养基。
ec50的测定：氟啶胺和阿米替林以3∶2、3∶4、3∶8、3∶16、3∶32、3∶64、3∶128的比例进行复配，分别以氟啶胺的浓度为基准进行梯度稀释，获得杀菌剂组合物中氟啶胺浓度分别为1.875、3.75、7.5、15、30、60μg/ml的药液。按照应用例1所记载的方法进行抑制率测定，并计算各比例复配药液及单剂药液的ec50。
增效性测定：按照应用例1所记载的方法分别测定氟啶胺单剂、阿米替林单剂、氟啶胺与阿米替林复配后对辣椒疫霉突变体rj-2的ec50，计算以上复配比例下阿米替林对杀菌剂的增效倍数。
3.试验结果
氟啶胺与阿米替林单剂和混剂对辣椒疫霉抗药性突变体的毒力检测结果如表2所示。
增效性测定试验结果(表2)表明，阿米替林与氟啶胺在一定配比下复配，能够明显提高氟啶胺对辣椒疫霉抗性突变体rj-2的毒力。氟啶胺与阿米替林3∶2、3∶4、3∶8、3∶16、3∶32、3∶64、3∶128这五种配比均表现为增效作用，增效倍数为2.1～14.0倍。其中，氟啶胺与阿米替林以3∶128的比例复配使用时，增效作用最为显著达到14倍。
表2阿米替林对氟啶胺抑制辣椒疫霉抗性突变体的增效作用
注：“-”表示不适合。
实施例12
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数1份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例13
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数2份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例14
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数4份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例15
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数8份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例16
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数16份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例17
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数32份阿米替林和5份百菌清组成。
实施例18
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数64份阿米替林和5份百菌清组成。
应用例3
本应用例提供阿米替林在辣椒疫病防治的杀菌增效剂的应用，其中，所述杀菌增效剂与取代苯类杀菌剂以组合物的形式混配可以有效提高杀菌剂对辣椒疫霉的抑菌作用。
1.试验对象
取代苯类杀菌剂(百菌清)单剂、实施例12-18所提供的组合物和阿米替林单剂。
2.试验方法
带毒培养基制备：使用有机溶剂二甲基亚砜(dmso)溶解，分别配制百菌清和阿米替林母液。在pda培养基(每升葡萄糖18g，马铃薯200g，琼脂15g)添加百菌清和阿米替林(对照为dmso)制成带毒培养基。
ec50的测定：百菌清和阿米替林以5：1、5∶2、5∶4、5∶8、5∶16、5∶32、5∶64的比例进行复配，分别以百菌清的浓度为基准进行梯度稀释，获得杀菌剂组合物中百菌清浓度分别为0.5、1、5、10、25、50、100μg/ml的药液。按照应用例1所记载的方法进行抑制率测定，并计算各比例复配药液及单剂药液的ec50。
增效性测定：按照应用例1所记载的方法分别测定百菌清单剂、阿米替林单剂、百菌清与阿米替林复配后对辣椒疫霉突变体rj-2的ec50，计算以上复配比例下阿米替林对杀菌剂的增效倍数。
3.试验结果
百菌清与阿米替林单剂和混剂对辣椒疫霉抗药性突变体rj-2的毒力检测结果如表5所示。5：1、5∶2、5∶4、5∶8、5∶16、5∶32、5∶64
增效性测定试验结果(表3)表明，阿米替林与百菌清在一定配比下能够明显提高百菌清对辣椒疫霉抗性突变体的毒力。当百菌清与阿米替林在5∶1～5∶64的配比浓度下，百菌清对辣椒疫霉rj-2的ec50随着阿米替林添加比例的增加而减小，增效倍数为0.7～39.2倍。当百菌清与阿米替林以5∶64的比例复配时，相对于百菌清单剂增效39.2倍，表现为最佳增效作用。
表3阿米替林对百菌清抑制辣椒疫霉抗性突变体的增效作用
注：“-”表示不适合。
实施例19
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数5000份阿米替林和1份氟噻唑吡乙酮组成。
实施例20
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数10000份阿米替林和1份氟噻唑吡乙酮组成。
实施例21
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数20000份阿米替林和1份氟噻唑吡乙酮组成。
实施例22
本实施例提供一种用于辣椒疫病防治的组合物，由质量份数40000份阿米替林和1份氟噻唑吡乙酮组成。
应用例4
本应用例提供阿米替林在辣椒疫病防治的杀菌增效剂的应用，其中，所述杀菌增效剂与哌啶基噻唑异噁唑啉类杀菌剂以组合物的形式混配可以有效提高杀菌剂对辣椒疫霉的抑菌作用。
1.试验对象
哌啶基噻唑异噁唑啉类(嘧霉胺)单剂、实施例19-22所提供的组合物和阿米替林单剂。
2.试验方法
带毒培养基制备：使用有机溶剂二甲基亚砜(dmso)溶解，分别配制氟噻唑吡乙酮和阿米替林母液。在pda培养基(每升葡萄糖18g，马铃薯200g，琼脂15g)添加氟噻唑吡乙酮和阿米替林(对照为dmso)制成带毒培养基。
ec50的测定：氟噻唑吡乙酮和阿米替林以1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000的比例进行复配，分别以氟噻唑吡乙酮的浓度为基准进行梯度稀释，获得杀菌剂组合物中氟噻唑吡乙酮浓度分别为0.00025、0.0005、0.001、0.002、0.004、0.008μg/ml的药液。按照应用例1所记载的方法进行抑制率测定，并计算各比例复配药液及单剂药液的ec50。
增效性测定：按照应用例1所记载的方法分别测定氟噻唑吡乙酮单剂、阿米替林单剂、氟噻唑吡乙酮与阿米替林复配后对辣椒疫霉突变体rj-2的ec50，计算以上复配比例下阿米替林对杀菌剂的增效倍数。
3.试验结果
增效性测定试验结果(表4)表明，阿米替林与氟噻唑吡乙酮在一定配比下能够明显提高氟噻唑吡乙酮对辣椒疫霉抗性突变体rj-2的毒力。在1∶5000～1∶40000的配比浓度下，阿米替林对氟噻唑吡乙酮的增效倍数为0.6～1.9倍，氟噻唑吡乙酮与阿米替林以1∶20000的比例复配时相对于氟噻唑吡乙酮单剂增效1.9倍，表现出最佳增效作用。
表4阿米替林对氟噻唑吡乙酮抑制辣椒疫霉抗性突变体的增效作用
注：“-”表示不适合。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。