本发明属于动物胚胎工程，具体涉及一种羊胚胎玻璃化冷冻保存液配方及冷冻方法。
背景技术：
动物胚胎冷冻技术是一种重要的胚胎工程技术，它在遗传资源保存、物种交流和胚胎移植生产实践中有着重要实用价值。胚胎玻璃化冷冻保存技术由于其操作简便、时间短、无需专门冷冻仪器而成为一种普遍使用的胚胎冷冻方法。目前已有不少研究者开发出玻璃化冷冻液配方和相应的冷冻程序。在玻璃化冷冻液中最常用的冷冻保护剂是二甲基亚砜(dmso)和乙二醇。此外，丙二醇(proh)由于毒性较小也常作为动物胚胎玻璃化冷冻保护剂。但是，不同冷冻保护剂及其组合在不同物种胚胎冷冻中的效果和程序差别较大，在施用于具体物种中需要优化冷冻液配方和冷冻保护剂配比以及相应的冷冻程序。
目前羊胚胎玻璃化冷冻技术仍不完善，特别是对体外胚胎的冷冻效果较差。目前胚胎玻璃化冷冻保护剂主要包括甘油(丙三醇)、dmso，乙二醇和丙二醇等几种，其中应用最普遍的是dmso和乙二醇组合(在冷冻液的浓度分别是15％左右)。但是，dmso的细胞毒性比较大，对胚胎有伤害作用。而且羊胚胎冷冻主要是冷冻桑椹胚/囊胚时期的胚胎，冷冻方法仍需改进，胚胎冷冻存活率有待进一步提高。此外，目前对早期卵裂阶段(2-8细胞期)胚胎的冷冻方法报道极少，实用于冷冻桑椹胚和囊胚的冷冻方法对早期卵裂阶段胚胎的冷冻效果较差，因此急需优化和发展羊胚胎玻璃化冷冻方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种基于丙二醇和乙二醇为冷冻保护剂的羊胚胎玻璃化冷冻液。
本发明所提供的羊胚胎玻璃化冷冻液，包括基础液、蔗糖、乙二醇和丙二醇；其中，所述基础液由sof-hepes溶液和胎牛血清组成，两者的体积比为6-9：2-1；所述蔗糖的量在所述羊胚胎玻璃化冷冻液中的浓度为0.5-0.8mol/l(具体可为0.67)；所述乙二醇占所述羊胚胎玻璃化冷冻液总体积的体积分数为15％；所述丙二醇占所述羊胚胎玻璃化冷冻液总体积的体积分数为12-21％。
优选地，所述丙二醇的量占所述羊胚胎玻璃化冷冻液总体积的体积分数为15-21％。
更优选地，所述丙二醇的量占所述羊胚胎玻璃化冷冻液总体积的体积分数的18-21％。
所述基础液中sof-hepes溶液和胎牛血清的体积比可进一步为6-8：2。
当然本发明所提供的羊胚胎玻璃化冷冻液，也可只由基础液、蔗糖、乙二醇和丙二醇组成。
上述羊胚胎玻璃化冷冻液在使用时需现用现配。
本发明的再一个目的是提供羊胚胎冷冻用的预平衡液。
所述预平衡液包括基础液、乙二醇和丙二醇；其中，所述基础液由sof-hepes溶液和胎牛血清组成，两者的体积比为6-9：2-1；所述乙二醇的用量为所述预平衡液体积分数的7.5％；所述丙二醇的用量为所述预平衡液体积分数的2.5-7.5％。
优选地，所述丙二醇的用量为所述预平衡液体积分数的7.5％。
所述基础液中sof-hepes溶液和胎牛血清的体积比可进一步为6-8：2或8-9：2-1。
当然本发明所提供的羊胚胎冷冻用的预平衡液，也可只由基础液、乙二醇和丙二醇组成。
本发明中所述sof-hepes溶液的制备方法如下：1lsof-hepes液中含有nacl6.542g、kcl0.555g、kh2po40.168g、mgso4·7h2o0.189g、nahco30.42g、cacl2·2h2o0.347g、丙酮酸钠0.036g、质量分数60％的乳酸钠溶液0.64ml，hepes4.766g，调节溶液ph值到7.0-7.5，用1l容量瓶定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
本发明的另一个目的是提供一种羊胚胎玻璃化冷冻方法。
本发明所提供的羊胚胎玻璃化冷冻方法，包括下述步骤：
将准备冷冻的羊胚胎先放入基础液中，然后移入上述预平衡液中平衡3-8min，再转移到所述羊胚胎玻璃化冷冻液中平衡30-40s，然后通过冷冻载体投入液氮中进行冷冻。
所述冷冻载体选自下述任意一种：开放式拉长麦管(ops)、开放式冷冻载杆(cryotop)、冷冻环(cryoloop)、开放式玻璃微细管(gmp)。
所述羊胚胎为羊早期胚胎，所述羊早期胚胎选自下述至少一种：2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚。
所述羊胚胎可为通过常规超数排卵技术生产的体内胚胎或者利用体外成熟/体外受精技术生产的体外胚胎。
所述ops管可按照下述方法制备：将0.25ml冷冻麦管在酒精灯上加热变软后，轻轻牵拉细管两端，使其中部均匀变细，用锋利的刀片在细管均匀变细的中央切断，使细管的内经和壁厚大约为原来的一半。
以冷冻载体选自开放式拉长麦管(ops)为例，对于囊胚，每个ops管中放入10μl冷冻液和3枚胚胎。对于2-细胞胚胎、4-细胞胚胎和8-细胞胚胎，每个ops管中放入6μl冷冻液和3枚胚胎。
所述羊早期胚胎为桑葚胚和囊胚，所述预平衡液中丙二醇浓度为7.5％、预平衡时间为5min；
所述羊早期胚胎为2-细胞胚胎、4-细胞胚胎或8-细胞胚胎，所述预平衡液中丙二醇浓度为7.5％、预平衡时间为8min。
所述冷冻的时间为可永久冷冻保存。
目前在羊玻璃化冷冻液中最常用的的冷冻保护剂是dmso和乙二醇。本发明的核心技术方案是利用毒性较小的丙二醇取代了原冷冻保护液中的dmso。经过检验和优化，在冷冻液中含有15％乙二醇和0.67mol/l蔗糖的基础上，加入18％的丙二醇，即乙二醇和丙二醇的配比是15％和18％；预平衡液中的最佳丙二醇浓度是7.5％；冷冻2-8细胞胚胎最佳预平衡时间是8分钟，冷冻囊胚预平衡时间是5分钟。这种冷冻保护液配方和预平衡程序适合冷冻羊早期胚胎。本方法对绵羊早期胚胎的冷冻效果优于含有dmso的冷冻保护液，特别是适合于冷冻卵裂期胚胎。用本发明方法冷冻卵裂期胚胎(2-8细胞)的存活率和发育率均高于国内外同类研究报道。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所述的“％”未经说明的均为体积百分含量。
实施例1：
(1)羊胚胎生产
通过常规体外受精技术生产体外受精胚胎。
(2)液体配制
以下所用的试剂如无特殊说明，均购自美国sigma-aldrich公司。
①胚胎操作液(h199)：配制1lh199溶液需加tcm199粉末9.5g，hepes10.412g,100μl胎牛血清,定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
②sof液(输卵管合成液)：1lsof液中含有nacl6.542g、kcl0.555g、kh2po40.1688g、mgso4·7h2o0.189g、nahco32.1g、cacl2·2h2o0.347g、丙酮酸钠0.036g、60％(质量百分比)乳酸钠溶液0.642ml，用1l容量瓶定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
③sof-hepes液：1lsof-hepes液中含有nacl6.542g、kcl0.555g、kh2po40.168g、mgso4·7h2o0.189g、nahco30.42g、cacl2·2h2o0.347g、丙酮酸钠0.036g、60％(质量百分比)乳酸钠溶液0.642ml，hepes4.766g，调节溶液ph值到7.0-7.5，，用1l容量瓶定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
④基础液：8mlsof-hepes溶液中加入2ml胎牛血清，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
⑤含蔗糖的基础液：在6.5mlsof-hepes溶液中加入2ml胎牛血清，将2.738g蔗糖融入，待蔗糖全部溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
⑥预平衡液：在基础液中加入乙二醇和丙二醇，乙二醇占预平衡液总体积的7.5％，丙二醇占预平衡液总体积的2.5-7.5％。现用现配。
⑦冷冻液：在上述含蔗糖的基础液中加入乙二醇和丙二醇，乙二醇占冷冻液总体积的体积分数为15％，丙二醇占冷冻液总体积的体积分数为12-21％。现用现配。
⑧解冻液：1mol/l蔗糖的基础液、0.5mol/l蔗糖的基础液。
⑨胚胎培养液：sof液+2％必需氨基酸+2％非必需氨基酸+8mg/ml牛血清白蛋白。
(3)ops(open-pulledstraw)管的制备：
将0.25ml冷冻麦管在酒精灯上加热变软后，轻轻牵拉细管两端，使其中部均匀变细，用锋利的刀片在细管均匀变细的中央切断，使细管的内经和壁厚大约为原来的一半。
(4)胚胎冷冻：
将准备冷冻的早期胚胎先放入基础液中，然后移入预平衡液中，按实验设计平衡一定的时间(3-8min)，再转移冷冻液中平衡34s，利用毛细管虹吸的原理，快速吸入ops管中，快速投入液氮中冷冻1-6个月。对于2-细胞胚胎、4-细胞胚胎和8-细胞胚胎，每个ops管中放入6μl冷冻液和3枚胚胎。对于囊胚，每个ops管中放入10μl冷冻液和3枚胚胎。
(5)胚胎解冻：
用四孔培养板分别配制1mol/l蔗糖溶液、0.5mol/l蔗糖溶液、不含有蔗糖的基础液，放入37℃培养箱中平衡15min以上。待平衡好后放在37℃恒温台上，从液氮中取出ops，将含有胚胎部分直接浸入盛有1mol/l蔗糖溶液的孔中，平衡1min,解冻后用捡卵针将胚胎移入0.5mol/l蔗糖溶液的孔中平衡5min，再将胚胎转移到不含有蔗糖的基础液中，最后用预热的胚胎培养液洗3次，移入含有500μl培养孔中培养，培养条件是38.5℃、5％co2、7％o2和88％n2。一般在冷冻后2-6天从形态上判断胚胎的成活情况,标准为解冻12h后胚胎形态恢复完整,早期胚胎恢复卵裂,处于囊胚期的胚胎重新出现囊胚腔。对解冻后的早期胚胎继续培养,培养5-7天统计囊胚发育率。
(6)数据分析：
使用spss19.0软件单因素方差分析中(anova)的duncan多重比较法对结果进行统计分析,p<0.05表示组间具有显著性差异。
(7)结果
①冷冻液中丙二醇/乙二醇组合与dmso/乙二醇组合对冷冻绵羊囊胚的效果比较
本实验比较了在冷冻液含有15％乙二醇的基础上再加入15％dmso或15％丙二醇(proh)对冷冻囊胚的效果。结果见表1，在冷冻液中加入15％丙二醇后冷冻囊胚的存活率显著高于加入15％dmso(69.2％vs54.0％)，即15％乙二醇/15％丙二醇组合优于15％乙二醇/15％dmso。
表1不同玻璃化冷冻保护剂组合处理绵羊囊胚
*:表示两个不同的组间具有显著性差异(p<0.05)。
②不同浓度丙二醇对冷冻2-细胞胚胎的效果比较
本实验比较了在15％乙二醇基础上添加不同浓度丙二醇对绵羊2-细胞胚胎的冷冻效果。结果见表2，冷冻液中含有18％或21％的丙二醇，冷冻2-细胞胚胎的存活率和发育率显著高于12％和15％的丙二醇，说明18％和21％是冷冻2-细胞胚胎的适合浓度。
表2不同浓度丙二醇与乙二醇组合处理绵羊2-细胞胚胎
注：a,b,c,d同一列中相同上标字母表示差异不显著(p＞0.05)；每个实验组重复次数n≥3(下表同)；对照为未冷冻体外受精二细胞胚胎。
③预平衡液中不同丙二醇浓度和不同预平衡时间优化
基于上述实验结果，选择15％乙二醇和18％丙二醇作为冷冻液中的冷冻保护剂组合，然后比较预平衡液中不同丙二醇浓度和不同预平衡时间的冷冻效果。不同处理组的实验设计见表3。
表3不同玻璃化冷冻体系处理绵羊2-细胞胚胎
不同预平衡处理对2-细胞胚胎冷冻效果见表4。实验结果显示，当预平衡液中丙二醇浓度为7.5％、预平衡时间为8min时(9号处理组)，冷冻的2-细胞存活率和囊胚发育率最高，冷冻胚胎存活率达到93％，囊胚发育率达到32％，显著高于其他各处理组，其囊胚发育率与对照组(非冷冻组)差异不显著。
表4不同预平衡处理对2-细胞胚胎冷冻的影响
注：a,b,c,d,e同一列中相同上标字母表示差异不显著(p＞0.05)；对照为未冷冻胚胎。
不同预平衡处理对绵羊囊胚的冷冻效果见表5。结果显示，当预平衡液中丙二醇浓度为7.5％、预平衡时间为5min时(6号处理组)，冷冻的囊胚存活率最高，达到80％。
表5不同预平衡处理对囊胚冷冻的影响
④对4-8细胞胚胎的冷冻效果
根据上述实验结果，冷冻液中含有18％丙二醇和15％乙二醇，预平衡液中含有7.5％丙二醇和7.5％乙二醇，预平衡时间为8min，冷冻2-细胞胚胎的存活率和发育率最高。本实验检验了这个冷冻程序对冷冻4-细胞和8-细胞胚胎的效果。结果显示，这个冷冻程序对4-细胞和8-细胞胚胎也有较好的冷冻效果。
表6最优玻璃化程序处理体外受精绵羊4-细胞和8-细胞胚胎解冻后成活率与囊胚发育率
*:表示实验组与对照组相比具有显著性差异(p<0.05)；对照为未冷冻胚胎。