一种通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法与流程

本发明属于植物良种快繁
技术领域：
，具体地说，涉及一种通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法。
背景技术：
：水曲柳(fraxinusmandshuricarupr.)为木犀科白蜡树属落叶乔木。是东地区重要的珍贵阔叶树种，分布范围较广。主要分布于小兴安岭、长白山、辽宁东部山地，日本的北海道、本州，朝鲜半岛等地。生长迅速、材质优良、强度适中，木材利用价值极高，是著名的军用材种和高级的家具用材。但此树种的资源历来非常贫乏，加之长期的不合理地过渡采伐利用，其资源已尽枯竭。水曲柳己被列为渐危种。水曲柳主要用种子繁殖，也可用扦插繁殖和萌蘖更新。水曲柳是表现出显著发芽缓慢的树种之一。如果播种成熟的干燥种子，需要2年左右的时间才能发芽。同时种子繁殖有受结实大小年的影响等缺点；而萌蘖更新受伐根有无、数量、采伐季节等因素的制约；扦插繁殖因采条母树的年龄不同表现出极大的差异，因此，研究者从组织培养的角度研究扩繁水曲柳。利用水曲柳叶柄、未成熟胚和成熟胚的不完整子叶和下胚轴为外植体进行愈伤组织诱导，获得愈伤组织，在通过对愈伤组织的诱导获得体细胞胚(孔冬梅等，2006；张宇等，2007；kongetal.,2012a；2012b；yangetal.,2013；丁小萌等，2013；kongetal.,2014；张丽杰等，2015；2014)，但这些研究报到很难得到水曲柳的再生植株，而且体胚的诱导率也极低，且水曲柳体胚的产生普遍伴随着外殖体揭化，也就是说，体胚都是在已经褐化的外殖体上产生，没有褐化的外植体则不会产生体胚。因此这些问题都阻碍了水曲柳植株的快速繁殖以及在实际中的应用。而直接诱导水曲柳外植体形成不定芽的研究未见报道。技术实现要素：本发明的目的旨在提供一种通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，为水曲柳质种苗的快速繁殖提供技术平台。一种通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，包括：1、双重表面杀菌，获得无菌外植体；2、外植体预处理，提高不定芽的萌发率；3、获得外植体最佳接种时间和最佳切割部位，提高不定芽的萌发率；4、通过六种生长调节剂组合，获得能够快速直接形成不定芽的最佳培养基；5、通过光、暗交替变换，获得最适不定芽生长的保持状态，并促进不定芽的生长；6、通过两步培养法，促进不定芽的伸长，提高成活率，获得健康的再生植株。本发明的有益效果1、双重表面杀菌获得无菌的外植体，有效降低了污染；2、获得外植体最佳接种时间和最佳切割部位；3、获得了不通过愈伤组织，而直接形成不定芽的萌发培养基；4、不定芽启动后的状态调整及保持，有效提高了不定芽的形成率；5、通过两步法促进不定芽的伸长，提高成活率，获得健康的再生植株。附图说明图1外植体切割位置图2培养11d的水曲柳下胚轴形成的芽点图3由水曲柳芽点形成的不定芽图4水曲柳不定芽伸长培养形成的丛生芽图5水曲柳的再生植株具体实施方式一种通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，包括以下步骤：步骤一获得无菌外植体：将健康饱满无损害的水曲柳种子浸泡24h，去掉外种皮，用70％的酒精消毒30s后、转入10％的次氯酸钠溶液中消毒13min，无菌水冲洗5-6次，吸干水分后用刀切开种子，取出合子胚，分别接种在不添加任何激素的培养基上(wpm+30％蔗糖+5.6g·l-1琼脂)和添加预处理剂的培养基上(wpm+30g·l-1蔗糖+5.6g·l-1琼脂+6g·l-1柠檬酸钾)，在温度为25℃下暗培养0-7d。步骤二外植体的切割：无菌条件下将胚根和胚轴一起切下(如图1)，确保胚芽全部切掉。步骤三获取能够快速形成芽点的培养基：将切下的胚轴和胚根平放于诱导培养基上，诱导培养基以wpm为基本培养基，蔗糖浓度为30g·l-1，琼脂为5.6g·l-1，ph5.8，生长调节剂种类及浓度见表1。每种类型的培养基接种30个材料，25℃下暗培养，培养2d下胚轴开始膨大，培养5d下胚轴顶端形成突起，培养11d下胚轴形成芽点(如图2)，形成芽点的诱导率最高达到82.1％(见表2)，虽然预处理的材料形成芽点为56.7％，但是每一个外植体形成的芽点数要多余没有预处理的材料。步骤四不定芽状态调整和保持：将培养11d的材料转入弱光下培养(半光半暗)，光照强度为10μmol·m-2·s-1，光照时间为14h/d，温度25℃，培养2个继代，每个继代15-20d，芽点开始形成叶片状，形成不定芽(如图3)，不定芽形成率最高为91.6％。步骤五不定芽的伸长和增殖诱导：将步骤四的不定芽转入a1培养基(wpm+0.25mg·l-1tdz+1.0mg·l-1ga3，蔗糖浓度为30g·l-1，琼脂为5.6g·l-1，ph5.8)，光照强度为80μmol·m-2·s-1，光照时间为14h/d，温度25℃，待不定芽伸长0.5-2cm的丛生芽时(如图4)，可以转入a6培养基(wpm+0.05mg·l-1tdz+2mg·l-1ga3+0.6mg·l-1ba，蔗糖浓度为30g·l-1，琼脂为5.6g·l-1，ph5.8)壮苗，或者转入z1培养基(wpm+0.05mg·l-1tdz+0.6mg·l-1ba，蔗糖浓度为30g·l-1，琼脂为5.6g·l-1，ph5.8)继续增殖培养，光照强度为80μmol·m-2·s-1，光照时间为14h/d，温度25℃，获得水曲柳再生植株(如图5)。以上步骤中所用的wpm培养基成分包括：nh4no3400mg/l，kh2po4170mg/l，k2so4990mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，ca(no3)2·4h2o556mg/l，cacl2·2h2o96mg/l，mnso4·4h2o22.5mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，cuso4·5h2o0.25mg/l，h3bo36.2mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2edta37.3mg/l，烟酸(vb3)0.5mg/l，vb11mg/l，vb60.5mg/l，甘氨酸2mg/l，肌醇100mg/l。表1水曲柳外植体诱导芽点形成的培养基激素组合表2水曲柳外植体形成芽点的情况培养基编号下胚轴数芽点数量芽点生成率(％)wy124937.5wy2301963.3wy3301756.7wy4282382.1wy5302480.0wy6301963.3wy2(柠檬酸钾预处理)301756.7％与现有技术相比，本发明通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，是利用水曲柳幼嫩组织，通过对诱导条件、培养条件以及两步法进行伸长培养的方法筛选，选择出了不经过愈伤组织而直接获得不定芽的诱导方法，可在短时间内高效率的获得水曲柳再生植株的技术，该方法的建立一方面，可用于濒危植物水曲柳的保育，提高水曲柳的种群数量；其次，可用于水曲柳不定芽再生发育过程中的相关基因在木本植物中的调控网络的研究提供材料；第三，也为通过转基因方式改变植物某个基因的功能来有效改良水曲柳繁殖体系提供新途径。以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12