徐香猕猴桃组培苗耐盐突变体的诱导方法与流程

本发明属于农业育种技术领域，具体为徐香猕猴桃组培苗耐盐突变体的诱导方法。

背景技术：

‘徐香’猕猴桃为猕猴桃科猕猴桃属多年生落叶藤本植物，是美味猕猴桃中综合品质最好的品种之一。‘徐香’猕猴桃主要在江苏地区种植，陕西、河南等各地也均引种种植，其耐盐性有待提高。

中国是受到土地盐碱化影响中最严重的国家之一，对盐碱土的防治可通过培育耐盐品种实现；运用组织培养的技术筛选植物体细胞耐盐突变体的技术已成为抗盐植物育种领域研究的重要课题，但目前关于‘徐香’猕猴桃组培苗耐盐突变体诱导方案的研究尚属空白。

技术实现要素：

针对现有的‘徐香’猕猴桃品种耐盐性不佳的问题，本发明提出一种徐香猕猴桃组培苗耐盐突变体的诱导方法。

本发明的徐香猕猴桃组培苗耐盐突变体的诱导方法，其特征在于通过以下步骤实现：

1）建立无菌体系：

采摘健康且生长旺盛的猕猴桃叶片，清洗叶片表面，同时对超净工作台、培养基及其他实验用品进行消毒，所述消毒液组合采用75%乙醇处理15秒，升汞处理4分钟；消毒后用无菌水充分的漂洗四到五次，每次无菌水用量以淹没外植体；

不同消毒处理对‘徐香’猕猴桃外植体消毒效果有显著差异。较死亡率而言，75%乙醇处理15秒，升汞处理4分钟死亡率为0最低，但最佳的消毒液组合应考虑其成活率和污染率，即消毒液组合75%乙醇处理15秒，升汞处理4分钟，成活率均值达95.00%，污染率均值为0，死亡率均值为5.00%。

2）愈伤组织诱导：

将将叶片切成1cm×1cm的方块，叶面朝上接种到培养基中，所述培养基为ms+tdz1.0mg/l+0.15ibamg/l；轻轻按压使其贴合培养基，接种后放置于培养室中培养，先进行5天遮光暗处理，而后光照培养25天，形成愈伤组织；

‘徐香’猕猴桃愈伤组织的诱导与细胞分裂素和生长素紧密相关，需要二者的之间平衡调节；经试验采用本专利的培养基，愈伤组织颜色为绿色，呈致密的团块状且生长较快，愈伤质量较好，愈伤诱导达100%。

3）ems诱导：

采用混培法，将存活的愈伤组织接种到培养基中，所述培养基为琼脂4.5g/l+蔗糖30.0g/l，ph=5.8-6.0；将磷酸缓冲液配置的ems溶液过滤灭菌，所述ems溶液浓度为0.4g/l，采用添加法加入培养基，生长20天，得到经ems诱导的植株；

ems浓度为本发明核心问题之一：将上述浓度的ems加入温度50℃左右还未凝固的增殖培养基中震荡均匀，待培养基凝固后再接入生长势良好的愈伤组织，20天后愈伤组织平均致死率为53.33%，存活下的愈伤组织也近乎有一半褐化死亡，因此采用添加法加入培养基，生长20天后可达半致死。

4）不定芽诱导分化：

将生长良好的愈伤组织材料接种到培养基中，所述培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l，接种后放置于培养室中培养；

‘徐香’猕猴桃不定芽诱导分化结果需考虑出芽数、增值系数、平均苗高和平均出芽数，综合苗高和激素用量情况，上述处理组合激素使用量较少，不定芽平均出芽数为6.43，平均芽高1.37cm。

5）耐盐植株筛选：

将经ems诱导存活下的愈伤培养成完整植株后，接入盐浓度1.0%的盐培养基中，所述培养基为ms培养基+1mg/ltdz+0.15mg/liba+蔗糖25g/l+琼脂4.5g/l，ph为5.8，在含盐培养基生长15天后，再转入不含盐的增殖培养基中生长15天，如此进行耐盐筛选；交替培养3个周期，将存活下来的苗转至不含盐的增殖培养基复壮，得到香猕猴桃苗耐盐植株。

接入上述盐浓度的盐培养基20天后，‘徐香’猕猴桃植株的致死率达95%，此浓度为临界浓度，筛选存活下的突变体耐盐性更强；

目前全国盐碱地面积较大，对盐碱地的开发利用具广阔的发展空间。‘徐香’猕猴桃综合性状良好，经济价值高，但其耐盐性具提升空间。在组培体系中用ems诱导，使用以nacl作为耐盐选择剂，进而筛选耐盐突变体筛选，培育出较高耐盐能力的‘徐香’猕猴桃苗。经试验验证，经本发明的诱导方法得到的突变植株和正常植株一同放置于95%致死浓度的含盐量1.0%的培养基中，一周后正常植株受到明显的盐害，而突变植株正常生长，以此初步得出突变植株具有耐盐性。该发明得到应用后，‘徐香’猕猴桃推广种植面积将会得到提高，同时还可有效的开发利用盐碱地，提高土地利用率和及经济效益，对农林业生产率及其可持续性具有重要的意义。

6）生根诱导：

选取生长势良好的组培苗接种到培养基中，所述培养基为ms+iba0.75mg/l+ac0.30g/l，接种时去掉愈伤组织，截取茎段部分，接种后放置于培养室中培养；

‘徐香’猕猴桃组培苗生根以生长素为主，选择作用强烈，作用时间长，诱导根多而长的生长素iba，同时结合活性炭进行生根诱导，采用上述培养基，平均生根数为8.91，平均根长达9.38cm，平均生根率达98.33%。

7）炼苗移栽：

选用腐殖土：园土：草炭土按1:1:1混合的基质，将长势旺盛生根正常的组培苗移至自然光下进行生长10天后松动组培瓶盖，5天后将组培瓶瓶盖打开并用纱布掩住，再过5天后取出组培苗用流水将附着于根上的培养基冲洗干净，并用多菌灵溶液进行消毒泡洗5分钟，之后在阴凉环境下晾干表面水分，栽种到提前用多菌灵杀菌剂进行杀毒处理的不同的土壤基质中，所述土壤基质选用含腐殖土、园土、草炭土或蛭石中几种，放置于阴凉处，用塑料盖将花盆盖住，保持温度在26±3℃，喷施水雾湿度控制在80%以上；

上述基质组合平均成活率达83.33%，为最佳基质组合；基质可选用腐殖土、园土、草炭土或蛭石中一种或几种：蛭石疏松多孔，质地轻，能吸收大量水，保水、持肥、吸热、保温的能力也较强；草炭土是植物残骸腐烂形成，保水性好蓄肥能力强；腐殖土由落叶腐烂形成，含大量矿质营养及有机物质；园土黏性好，具有一定肥力。经试验，腐殖土与草炭土混和使用时更适合‘徐香’猕猴桃的组培苗的存活。四种基质的炼苗移栽效果进行排序：草炭土>腐殖土>园土>蛭石。

附图说明

图1为‘徐香’猕猴桃突变植株在含盐1%的培养基上的生长状况。

图2为‘徐香’猕猴桃正常与突变植株均置于含1.0%盐培养基中的生长情况。

具体实施方式

实施例1：采摘健康且生长旺盛的猕猴桃叶片，清洗叶片表面，同时对超净工作台、培养基及其他实验用品进行消毒，所述消毒液组合采用75%乙醇处理15秒，升汞处理4分钟；消毒后用无菌水充分的漂洗四到五次，每次无菌水用量以淹没外植体；

将将叶片切成1cm×1cm的方块，叶面朝上接种到培养基中，所述培养基为ms+tdz1.0mg/l+0.15ibamg/l；轻轻按压使其贴合培养基，接种后放置于培养室中培养，先进行5天遮光暗处理，而后光照培养25天，形成愈伤组织；

将生长良好的愈伤组织材料接种到培养基中，所述培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l，接种后放置于培养室中培养；

将存活的愈伤组织接种到培养基中，所述培养基为琼脂4.5g/l+蔗糖30.0g/l，ph=5.8-6.0；将磷酸缓冲液配置的ems溶液过滤灭菌，所述ems溶液浓度为0.4g/l，采用添加法加入培养基，生长20天，得到经ems诱导的植株；

将经ems诱导存活下的愈伤培养成完整植株后，接入盐浓度1.0%的盐培养基中，所述培养基为ms培养基+1mg/ltdz+0.15mg/liba+蔗糖25g/l+琼脂4.5g/l，ph为5.8，在含盐培养基生长15天后，再转入不含盐的增殖培养基中生长15天，如此进行耐盐筛选；交替培养3个周期，将存活下来的苗转至不含盐的增殖培养基复壮，得到香猕猴桃苗耐盐植株；

选取生长势良好的组培苗接种到培养基中，所述培养基为ms+iba0.75mg/l+ac0.30g/l，接种时去掉愈伤组织，截取茎段部分，接种后放置于培养室中培养；

选用腐殖土：园土：草炭土按1:1:1混合的基质，将长势旺盛生根正常的组培苗移至自然光下进行生长10天后松动组培瓶盖，5天后将组培瓶瓶盖打开并用纱布掩住，再过5天后取出组培苗用流水将附着于根上的培养基冲洗干净，并用多菌灵溶液进行消毒泡洗5分钟，之后在阴凉环境下晾干表面水分，栽种到提前用多菌灵杀菌剂进行杀毒处理的不同的土壤基质中，所述土壤基质选用含腐殖土、园土、草炭土或蛭石中几种，放置于阴凉处，用塑料盖将花盆盖住，保持温度在26±3℃，喷施水雾湿度控制在80%以上。