一种检测水稻叶片中叶绿体经光处理后分布情况的方法与流程

本发明涉及植物光信号研究技术领域，具体涉及一种检测水稻叶片中叶绿体经光处理后分布情况的方法。

背景技术：

叶绿体作为植物光合作用的场所，吸收二氧化碳，释放氧气，合成有机物，随着各个植物中光信号研究的逐渐深入，叶绿体对不同光强和不同光质敏感程度的研究与鉴别具有重要意义。

水稻(oryzasativa)作为重要的粮食作物之一，保证水稻的高产量是关系国计民生的问题。水稻是禾本科单子叶植物，喜温湿，水稻幼苗的室内水培方法由于其快速、便捷，被广泛应用于水稻的各方面研究中。而确保其高产量的关键一点在于提高水稻苗的光合效率，利用观察不同水稻品种在不同光照条件下水稻叶片叶绿体的分布情况这一方法，对研究水稻光信号途径提供了便捷，也可以快速筛选出适合于不同水稻品种的种植光照条件，利于水稻育种工作，为解决我国以及世界许多其他国家粮食问题提供可能，对全人类社会的农业生产有着无可比拟的作用。

目前，随着植物光信号中越来越多基因的发掘，一套精准的调控体系存在于植物对光的反应中，叶绿体可以对不同的光强和光质做出不同反应，通过调整叶绿体在细胞中的位置分布和形态变化，来最大限度地为光合作用提供光能，积累最多的有机物，同时避免了过强的光对叶绿体造成伤害，因此，位于植物叶肉细胞中的叶绿体，在较微弱的光照条件下，叶绿体最大限度地平铺于细胞的上下表面，垂直于入射光的有效面积最大化，使得其光合效率最大化；相反，在强烈的光照条件下，叶绿体平行立细胞四周侧壁，平行于入射光，减少直射面积，以减少强光直接照射造成的光伤害。叶绿体对光照做出的位置变化灵敏、快速，作为植物的自我保护反应，已经在多个物种中发现，水稻也不例外。

然而，水稻叶片存在着以下特点：第一，水稻叶片具有密集的维管束，大小各异，由丰富的木质部和韧皮部组成，使得叶片凹凸不平，用普通荧光显微镜观察时，处于同一平面的细胞数少，且没有维管束存在的区域极窄，不易观察；第二，水稻叶片表皮存在蜡质层，是抵抗外界刺激的第一道屏障，这对叶片的固定处理带来挑战；第三，水稻叶片细胞形态不规则，且表皮还有表皮毛，叶肉细胞薄，极不好观察。由此，用过去常规的方法极难观察到清晰的叶绿体分布情况，因而不适用于水稻与光相关的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测水稻叶片中叶绿体经光处理后分布情况的方法，以解决水稻叶片难观察的问题。利用该方法可以研究水稻幼苗对不同光照条件的敏感程度或不同品种水稻对相同光照条件的反应，以推动水稻光信号的深入研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测水稻叶片中叶绿体经光处理后分布情况的方法，包括以下步骤：

(1)取待测水稻种子，利用水培法获得水稻幼苗；

(2)将水稻幼苗置于无光环境中进行黑暗处理12-36h；

(3)将经过黑暗处理的水稻幼苗置于不同的光照条件下进行培养；

(4)剪取经光照处理后的水稻幼苗的旗叶中部区域，置于固定液中，固定叶片；

(5)将固定的叶片从固定液中取出，制片，再利用激光共聚焦显微镜观察并记录水稻叶绿体在细胞中的分布情况。

步骤(1)中，使用水培的方法，可以快速便捷地得到水稻幼苗。

优选的，所述水培法包括：将水稻种子浸泡于水中催芽，待出芽后播种，先水培2-4天，再更换成水稻培养液培养2周，培养条件为30℃，每天12-14小时光照培养，10-12小时暗培养。

步骤(2)中，使用不同光照条件处理水稻幼苗前，进行严格黑暗处理，可以有效地除去光影响下的叶绿体分布诱导作用，使叶绿体全部因重力沉至细胞底部，为后面的光照处理提供一个统一的起始点。

优选的，将水稻幼苗放入置于暗室的无光培养箱中进行黑暗处理24h。

步骤(3)中，根据研究的不同需求选择不同的的光照条件(如不同的光照强度、不同光质)对黑暗处理的水稻幼苗进行光照处理，此时叶片中的叶绿体可以对不同光照条件做出不同反应，其在细胞中的位置分布和形态发生变化。

优选的，光照培养的时间为2小时。研究表明，经2个小时的培养后，叶绿体已做出了充分的反应。

步骤(4)中，光照处理结束后，对水稻叶片进行固定处理，迅速固定叶片内部细胞的状态。

优选的，于水稻幼苗旗叶中部区域剪取2-3mm小段，置于固定液中，每个样品剪3-4段。

优选的，所述固定液中含有20mmpipes、5mmmgcl2、5mmegta、0.5mm苯甲基磺酰氟、1％二甲基亚砜，ph值为7.0。

固定液充分充盈于细胞，达到细胞内各细胞器充分固定的效果。优选的，将叶片置于固定液中，于真空度为-0.1mpa的条件下处理5-10min，再于4℃条件下放置5-7天。剪成小段的水稻叶片通过真空处理，固定液充分进入，达到更好地固定效果。

步骤(5)中，利用激光共聚焦显微镜观察水稻叶片叶肉细胞内叶绿体的分布情况。叶绿体位于植物叶肉细胞中，其中主要含有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素，叶绿素a和b较多地吸收蓝紫光和红光，另两者主要吸收蓝紫光，这些色素吸收了蓝紫光后不用于光合作用的一部分光就形成荧光重新辐射出来，但由于辐射过程中部分能量化为热能损失了，所以辐射出来的荧光是比蓝紫光能量少的红光。本发明利用这一自发荧光的原理，采用激光共聚焦显微镜观察水稻叶片叶肉细胞内叶绿体的分布情况，得到清晰、强信号的结果。同时激光共聚焦显微镜拍摄技术可减小普通荧光显微镜观察时细胞层数过多而无法分离的问题，清楚观察到单层水稻叶片叶肉细胞内叶绿体的分布情况。

优选的，制片时，将叶片从固定液中取出，吸干液体，剪去叶片的长臂端，近轴面朝上，置于50％甘油中，封片。

通过剪去叶片的长臂端，减少水稻叶片的不平整性，利于同一层细胞的观察，制片时加入50％的甘油，有利于减少由于叶片不平整引起的空腔，造成观察不清的问题，同时保证叶片不会由于失水干瘪。

利用激光共聚焦显微镜观察时，采用波长为568nm的激发光。

优选的，选取水稻叶片短臂端最边缘的叶肉细胞进行观察。通过统一选取短臂端最边缘的叶肉细胞层，统一观察表皮细胞下的叶肉细胞层，可以减少每个样品之间的误差，使结果具有极大的可比性和可靠性。

本发明具备的有益效果：

本发明通过快速便捷地培养水稻幼苗，建立完善的水稻幼苗不同光照处理的系统，摸索出适当的取样、固定、制片和观察的方法，利用了叶绿体在568nm波长下可自发荧光的原理，采用激光共聚焦显微镜拍摄技术可高效且清晰地观察到水稻叶片叶绿体的分布情况，操作过程简单，观察结果清楚、真实、直观，有效地解决了现有技术中水稻叶片难观察的问题。

利用本发明提供的方法可用于研究水稻叶绿体与光信号的关系，为进一步解析水稻叶绿体光信号调控机制提供帮助，同时可有效地筛选出不同水稻品种培养时需要的最适光强，有利于不同地区培养水稻时对其进行适当的补光操作，也可用于作物遗传改良，对创制高光效水稻品种具有重要意义。

附图说明

图1为水稻种子催芽过程的图片，其中a为选取的水稻种子；b为水稻种子催芽；c为水稻种子出芽。

图2为幼苗的黑暗处理，其中a为培养2周的水稻幼苗；b为无光培养箱培养。

图3为不同光强、光质条件下处理水稻幼苗2小时，其中a为光照强度为50μmol/m²/s的白光；b为光照强度为300μmol/m²/s的白光；c为光照强度为50μmol/m²/s的蓝光；d为光照强度为250μmol/m²/s的蓝光。

图4为取样示意图，a为选取的取样位置；b为取样叶片。

图5为叶片固定于固定液中。

图6为临时装片。

图7为观察所选取的部位图，图中方框所标注区域。

图8为水稻叶片表皮细胞。

图9为激光共聚焦所观察到的结果图。a光照强度为0μmol/m²/s；b光照强度为50μmol/m²/s的白光；c光照强度为300μmol/m²/s的白光；d光照强度为50μmol/m²/s的蓝光；e光照强度为250μmol/m²/s的蓝光。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例中使用的溶液组成如下：

水稻培养液：9.14％硝酸铵；8.86％氯化钙；32.4％七水硫酸镁；7.14％硫酸钾；4.03％二水磷酸二氢钠；0.9315％二水乙二胺四乙酸二钠；0.6965％七水硫酸铁；0.15％四水氯化锰；0.0934％硼酸；0.0074％钼酸铵；0.0035％七水硫酸锌；0.0031％五水硫酸铜。

固定液：20mmpipes、5mmmgcl2、5mmegta、0.5mmphenylmethylsulfonylfluoride、1％dimethylsulfoxide，ph值为7.0，新鲜配置最佳。

临时装片制作：50％甘油。

实施例中采用的水稻品种为对光敏感的正常野生型水稻品种nip。实施例1

1、水稻幼苗的培养

1)从收获种子中挑选出饱满的种子，放入平皿，加入纯净水，以没过种子为佳，如图1a-b所示。

2)将平皿置于30℃环境催芽2-3天。每日早晚跟换纯净水，注意发芽情况，如图1c所示。

3)当种子出芽后播种于pcr板中，pcr板在播种前将每个孔的底端剪去，播种密度不可过大，3孔播种一粒种子，防止由于过度密植影响生长。

4)播种完成，先用水培养3天后，防止过度营养化造成的绿藻泛滥，随后跟换为水稻培养液培养，一周跟换一次，每天保证培养液充足，持续培养2周，培养条件为30℃，14小时光照，10小时黑暗。

针对不同的水稻品种，视其发芽效率，出芽时间，做细微调整，通过这一培养方法，可快速便捷得到实验材料，减少了田间取样的繁琐，便于水稻幼苗期的各类研究。

2、水稻幼苗的黑暗处理

1)培养2周后的水稻幼苗(如图2a所示)分为若干份(根据后期采用多少种光强处理而定)，置于无光培养箱中培养24小时，进行黑暗处理(如图2b所示)。

此黑暗处理过程必须严格，鉴于水稻对光的敏感，若有漏光现象发生，其初始状态就不一致，极大影响最后的观察结果，所以在黑暗处理时，无光培养箱置于暗室，保证下一步取苗过程不会影响0μmol/m²/s处理的材料，不同光强处理的材料之间也不造成相互影响。

3、水稻幼苗的不同光照条件处理

1)在暗室中从培养箱中取出黑暗处理后的水稻幼苗，分别置于不同的光照条件(光照强度为0μmol/m2/s；光照强度为50μmol/m²/s的白光；光照强度为300μmol/m²/s的白光；光照强度为50μmol/m²/s的蓝光；光照强度为250μmol/m²/s的蓝光)下培养2小时，防止各个光之间相互影响，也可逐一处理(如图3所示)。

此操作可选取各种光照条件，有利于更精细地研究水稻幼苗对不同光照强度和不同光质的反应，也可用于不同水稻品种对相同光照条件的反应。

4、水稻幼苗在不同光照条件处理后取样的方法

1)不同光照条件处理结束前，准备好已加了1毫升固定液的1.5毫升离心管，确定好要取样的叶片及位置(水稻幼苗旗叶中部区域)(如图4a所示)，处理时间一到，迅速剪下叶片，将选取区域剪成2mm的小段(如图4b所示)，快速放至固定溶液中，至真空装置中进行真空处理5分钟，真空度约为-0.1mpa(如图5所示)。

2)将真空处理完的样品置于4℃冰箱，放置5-7天，期间若固定液有所挥发，及时补充。

此步骤操作需快，对于光照强度为0μmol/m²/s的处理组，取样需在暗室进行。每份样品剪取3-4片，切勿贪多，过多的叶片影响真空固定效果。

5、利用激光共聚焦显微镜观察水稻叶片叶绿体分布情况

1)从4℃冰箱取出样品，准备好载玻片和盖玻片，首先在载玻片上滴加一滴50％甘油，用小镊子轻轻取出要观察的叶片，用吸水纸吸去固定液，正面向上放置于甘油中，用剪刀剪去水稻叶片的长臂端，盖上盖玻片，封片(如图6所示)。

2)将临时装片倒置放入，选取观察部位为短臂端最边缘的叶肉细胞层(如图7所示，方格标示)。

3)选取好位置后，设置拍摄波长为568nm，从叶片的表层开始扫描。首先看到长方形锯齿状的表皮细胞，分布有气孔(如图8所示)；往下扫描，即可看到叶肉细胞，出现叶绿体形态和分布情况(如图9所示)，拍摄照片。

如图9所示，对水稻植株持续黑暗处理，叶片中叶绿体因重力原因沉于细胞底部，当垂直叶片拍摄细胞表皮叶绿体分布时，基本无叶绿体自发荧光信号，如图9a所示；当50μmol/m²/s的白光或弱蓝光处理时，叶绿体由于聚集反应，聚合至细胞的上下表面，此时，叶片叶肉细胞表面布满叶绿体自发荧光信号，如图9b和9d所示；当300μmol/m²/s的白光或250μmol/m²/s的强蓝光处理叶片时，叶绿体避光运动至细胞周壁，使叶绿体自发荧光出现在细胞周边，如图9c和9e所示。

由此可见，根据本发明所提供的方法，可有效地分析不同水稻品种对光的敏感程度。根据不同的研究目的，都可利用这一方法观察叶绿体的分布情况。

在温室培养水稻时，为光照强度的选择提供了参考与支持；为不同纬度、不同地区培养水稻进行补光操作提供依据；为研究水稻叶绿体与光信号的关系提供有效方法。