淡色生赤壳菌的新用途及防治媒介蚊虫的方法与流程

本发明涉及生物防治领域。更具体地说，本发明涉及一种淡色生赤壳菌的新用途。
背景技术：
：淡色生赤壳菌是一类广泛存在于土壤中的重寄生菌，可抑制番茄灰霉病、番茄叶霉病、番茄绵疫病、番茄黄萎病、番茄枯萎病、杨树烂皮病、杨树枯萎病和黑穗醋栗叶斑病、烟草青枯病等病原真菌的生长。该菌株杀虫活性的研究报道较少，目前仅做过菌株发酵液对卤虫、蚜虫、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾的毒杀活性，其中对卤虫校正死亡率达100％，对蚜虫、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾有明显的毒杀活性，校正死亡率在78.9％以上。然而，其用于媒介蚊虫的防治并未见有报道。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种淡色生赤壳菌的新用途，其能够防治媒介蚊虫。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种淡色生赤壳菌的新用途，所述淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫。优选的是，所述淡色生赤壳菌用于防治蚊虫的幼虫。优选的是，所述淡色生赤壳菌用于防治淡色库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、三带喙库蚊和骚扰阿蚊。优选的是，所述淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的温度为20-30℃。优选的是，所述淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的温度为24-26℃。优选的是，所述淡色生赤壳菌与药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备成制剂使用，其中，所述制剂的剂型为悬浮剂、乳剂、片剂、粉剂。一种淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的方法，包括以下步骤：1)使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培育淡色生赤壳菌，培育温度为20-22℃，获得淡色生赤壳菌孢子；2)收集步骤1)获得的淡色生赤壳菌孢子与载体混合，获得淡色生赤壳菌孢子制剂；其中，所述载体为蒸馏水、吐温水、硅藻土、腐殖质、粘土微粒等；3)往含有蚊虫的水体中添加所述淡色生赤壳菌孢子制剂，即完成对媒介蚊虫的防治。优选的是，往纳米级的粘土微粒中添加稀盐酸，浸泡24h，离心收集沉淀然后使用蒸馏水洗涤3次，离心后的沉淀再次悬浮于蒸馏水中，添加edta，搅拌30min，过滤，洗涤3次，悬浮于吐温溶液中，获得粘土微粒悬浮液；将腐殖质溶于水中，搅拌均匀，静止2h，获得腐殖质悬浮液，将腐殖质悬浮液与所述粘土微粒悬浮液混合，搅拌均匀，自然沉降2h，取上清液，加入淡色生赤壳菌孢子，搅拌均匀，获得淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂。本发明至少包括以下有益效果：利用淡色生赤壳菌防治蚊虫，防治方法简单，对常见的蚊种淡色库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、三带喙库蚊和骚扰阿蚊均有良好的防治效果，并且淡色生赤壳菌对蚊虫的防治的温度适应范围广，在20-30℃中均能发挥良好的蚊虫防治效果；通过制备粘土微粒悬浮液，利用粘土微粒表面携带的负电生成吸附淡色生赤壳菌孢子，使得淡色生赤壳菌孢子分泌产生的胞外蛋白酶被粘土微粒吸附，在粘土微粒表面形成较高的胞外酶区域，使得淡色生赤壳菌孢子更加容易的附着在蚊虫的体壁，增强了淡色生赤壳菌孢子的蚊虫防治作用。并且，将纳米级粘土微粒与腐殖质制备悬浮液，一方面增强了粘土微粒吸附孢子的性能，另一方面腐殖质中含有一股特殊的泥土气息，降低了蚊虫对陌生物质的抵触远离，从而增加了孢子对蚊虫体壁的附着率。本发明具有蚊虫防治效果好，防治方法简单、防治效果高效等特点。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明在不同温度下淡色生赤壳菌孢子悬浮液处理淡色库蚊幼虫，处理时间与累计死亡率的关系。具体实施方式下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。从山东省青州市弥河镇下黄山村农田土壤中分离获得，保种于山东省寄生虫病防治研究所。分离方法：去掉土壤中的石粒和杂物后，称取10g放入90ml0.1％的吐温-80溶液中，搅拌均匀，静置20min，取上清液2ml稀释于8ml0.05％吐温-80中。取0.1ml悬浮液接种于选择培养基平板上，用玻璃涂布器将悬浮液涂布于平板表面，22℃倒置培养，待长出菌落后，转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato-dextroseagar，pda)。pda培养基：去皮马铃薯200g，切成小块，加水1l，煮沸20分钟，双层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热使其融化，加水补足至1000ml。选择性培养基：将pda培养基1000ml冷却至50℃时，加入放线菌酮0.2g，氯霉素0.2g，孟加拉红0.0133g。该菌的菌丝生长缓慢，平板背面产生黄色色素，菌落边缘呈轮纹状向外扩散，正面呈橙红色，有白色沙绒状，显微条件下菌丝无色。经分子生物学鉴定该菌为淡色生赤壳菌；分类地位：子囊菌亚门(ascomycotina)生赤壳属(bionectria)淡色生赤壳(bionectriaochroleuca)。与中国林业微生物保藏管理中心保藏的菌株cfcc88460为同种。试验一、菌株对媒介蚊虫的致病力测定供试蚊种：淡色库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊为室内饲养品系，三带喙库蚊和骚扰阿蚊为野外采集吸血雌成蚊，室内饲养孵化后，随机挑选3龄健康幼虫用于试验。方法：试验在150ml的透明塑料水杯中进行，每杯盛有100ml浓度为1×106孢子/ml的淡色生赤壳菌孢子悬浮液，3龄蚊幼虫25头/杯。蚊幼虫根据种类分为五个处理组(淡色库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、三带喙库蚊和骚扰阿蚊)，每组设4个重复，并相应设置不含淡色生赤壳菌孢子的阴性对照组。试验条件：温度24℃，光周期为光照:黑暗＝14l:10d。每天加一次饲料，连续观察10d，逐日统计感染死亡虫数，计算蚊幼虫的累计死亡率，结果如表1所示。表1淡色生赤壳菌处理后媒介蚊虫的致死中时lt50通过淡色生赤壳菌对5种蚊幼虫的致病力测定试验，结果发现淡色库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、三带喙库蚊和骚扰阿蚊的阴性对照组的蚊虫均正常蛹化，死亡率为0，淡色生赤壳菌对五种蚊子均有一定的防治作用。其中，中华按蚊幼虫对菌株最敏感，其次为淡色库蚊，浓度为1×106孢子/ml孢子悬浮液处理，两种蚊幼虫的lt50分别为2.09d和2.26d，10d的累计死亡率达100％。菌株对三带喙库蚊和白纹伊蚊幼虫均有较高的致病力，10d的累计死亡率分别为95％和90％，lt50分别为3.41d和4.9d。菌株对骚扰阿蚊幼虫的致病力最差，10d的累计死亡率为76％。试验二、温度对菌株致病性的影响供试蚊种：淡色库蚊，室内饲养孵化后，随机挑选3龄健康幼虫用于试验。试验方法：设20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃六个温度梯度，光周期为光照:黑暗＝14l:10d。每个温度下，用100ml浓度为1×106孢子/ml的淡色生赤壳菌孢子悬浮液(吐温水悬浮液)处理淡色库蚊3龄幼虫，每个处理淡色库蚊幼虫25头，重复4次，另设不加孢子悬浮液的阴性对照组。每天加一次饲料，连续观察10d，逐日统计感染死亡虫数，计算淡色库蚊的累计死亡率，结果如表2所示。表2孢子悬浮液处理后淡色库蚊不同温度的致死中时lt50淡色生赤壳菌孢子悬浮液处理淡色库蚊3龄幼虫，累计死亡率与处理温度有关，不同温度情况下，淡色库蚊累计死亡率与处理时间的关系见图1。随着温度的升高，菌株对淡色库蚊的致病力先增强后减弱，菌株的最佳侵染温度24℃，其次为26℃，lt50均低于3d，菌株在20℃的致病力最差，lt50为5.56d，不同温度处理10d，菌株对淡色库蚊的致病力差异显著(f＝27.569，df＝23，p<0.05)。试验三、野外试验将野外同一片区域的蚊虫滋生的水体分隔成区域a和区域b，两片区域的水体不连通，往区域a中加入淡色生赤壳菌孢子悬浮液，区域b不作处理，观察区域a和区域b水里的蚊虫密度。6天、10天后用勺(250ml)在水体中5个不同部位各取一勺，统计水体中的蚊虫平均数。对水中找到的死蚊取回镜检，以确认蚊虫是否被所施放的真菌感染。水中蚊幼虫数目越少说明灭蚊真菌的效果越好。结果表明，6天后区域a的蚊虫数目比区域b的蚊虫数目减少了80％以上，10天后区域a中的蚊虫数目几乎为零，而区域b的蚊虫数目变化无统计学意义。实施例1一种淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的方法，包括以下步骤：1)使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培育淡色生赤壳菌，培育温度为22℃，获得淡色生赤壳菌孢子；2)收集步骤1)获得的淡色生赤壳菌孢子悬浮于吐温水中，制备孢子悬浮液；3)往含有蚊虫的水体中添加所述孢子悬浮液，即完成对媒介蚊虫的防治。实施例2一种淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的方法，包括以下步骤：1)使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培育淡色生赤壳菌，培育温度为22℃，获得淡色生赤壳菌孢子；2)收集步骤1)获得的淡色生赤壳菌孢子与硅藻土粉末混合，制备粉末状孢子粉；3)往含有蚊虫的水体中添加所述粉末状孢子粉，即完成对媒介蚊虫的防治。实施例3一种淡色生赤壳菌用于防治媒介蚊虫的方法，包括以下步骤：1)使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培育淡色生赤壳菌，培育温度为22℃，获得淡色生赤壳菌孢子；2)往纳米级的粘土微粒中添加稀盐酸，浸泡24h，离心收集沉淀然后使用蒸馏水洗涤3次，离心后的沉淀再次悬浮于蒸馏水中，添加edta，搅拌30min，过滤，洗涤3次，悬浮于质量分数为1％的吐温溶液中，获得粘土微粒悬浮液；将腐殖质溶于水中，搅拌均匀，静止2h，获得腐殖质悬浮液，将腐殖质悬浮液与所述粘土微粒悬浮液混合，搅拌均匀，自然沉降2h，取上清液，加入淡色生赤壳菌孢子，搅拌均匀，获得淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂；3)往含有蚊虫的水体中添加淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，即完成对媒介蚊虫的防治。通过制备粘土微粒悬浮液，利用粘土微粒表面携带的负电生成吸附淡色生赤壳菌孢子，使得淡色生赤壳菌孢子分泌产生的胞外蛋白酶被粘土微粒吸附，在粘土微粒表面形成较高的胞外酶区域，使得淡色生赤壳菌孢子更加容易的附着在蚊虫的体壁，增强了淡色生赤壳菌孢子的蚊虫防治作用。并且，通过将纳米级粘土微粒与腐殖质悬浮液，一方面增强了粘土微粒吸附孢子的性能，另一方面腐殖质中含有一股特殊的泥土气息，降低了蚊虫对陌生物质的抵触远离，从而增加了孢子对蚊虫体壁的附着率。对比试验对比一、将实施例3步骤1)培育的淡色生赤壳菌孢子直接悬浮于吐温水中，制备淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，并投放到含有100ml淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂的150ml的透明塑料水杯中，在24℃的条件下进行试验，每杯均含有3龄淡色库蚊幼虫25头，重复4次，第5天观察并统计淡色库蚊幼虫的死亡率，结果如表3所示。对比二、根据实施例3的方法制备淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，但制备过程不添加腐殖质，并投放到含有100ml淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂的150ml的透明塑料水杯中，在24℃的条件下进行试验，每杯均含有3龄淡色库蚊幼虫25头，重复4次，第5天观察并统计淡色库蚊幼虫的死亡率，结果如表3所示。对比三、根据实施例3的方法淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，但制备过程不添加纳米级粘土微粒，并投放到含有100ml淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂的150ml的透明塑料水杯中，在24℃的条件下进行试验，每杯均含有3龄淡色库蚊幼虫25头，重复4次，第5天观察并统计淡色库蚊幼虫的死亡率，结果如表3所示。对比四、将实施例3步骤1)培育的淡色生赤壳菌孢子直接悬浮于蒸馏水中，制备淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，并投放到含有100ml淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂的150ml的透明塑料水杯中，在24℃的条件下进行试验，每杯均含有3龄淡色库蚊幼虫25头，重复4次，第5天观察并统计淡色库蚊幼虫的死亡率，结果如表3所示。对比五、将实施例3制备的淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂，投放到含有100ml淡色生赤壳菌孢子水悬浮制剂的150ml的透明塑料水杯中，在24℃的条件下进行试验，每杯均含有3龄淡色库蚊幼虫25头，重复4次，第5天观察并统计淡色库蚊幼虫的死亡率，结果如表3所示。表3淡色库蚊幼虫死亡率死亡率(％)对比一83.4对比二93.3对比三85.6对比四61.7对比五100从表3结果可知，通过将淡色生赤壳菌孢子与纳米级粘土微粒和腐殖质的悬浮液混合，增强了淡色库蚊幼虫的防治效果。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页12