一种选育穿心莲高产优质抗逆优良新品种的方法与流程

本发明属于生物种植技术领域。更具体地，涉及一种选育穿心莲高产优质抗逆优良新品种的方法。

背景技术：

穿心莲来源于爵床科植物穿心莲andrographispaniculata(burm.f.)nees，以地上部分入药，由于其长期人工栽培，品种退化、产量下降、有效成分含量降低等现象严重，开展产量高、有效成分高、优质新种质的培育研究迫在眉睫。辐射诱变主要是通过一定剂量的射线辐射处理材料，从而使材料产生突变，诱发变异，经筛选、测定、选择，最终从变异材料中选育出对科研或生产上有利用价值的新品种育种过程。辐照诱变技术具有突变率高、突变谱宽、后代性状稳定、育种周期短等优点，目前已成为获得新种质资源的有效途径之一。γ射线是辐射诱变射线中的一种，其辐射源为⁶⁰co，是一种中性射线，穿透能力较强，辐射剂量相对均匀且一次能够处理大量的材料。⁶⁰co-γ射线是最常用的辐照射线，具有诱变成本低，突变率高，穿透力强，易引起植物形态结构和生理生化变异等特点，育种前景广阔。

目前已经开展观赏植物菊花、玉簪、月季等组培苗⁶⁰co-γ射线辐射诱变育种方法及半致死剂量的相关研究，如菊花组培苗半致死剂量为20gy(李黎，胡金萍.辐射对菊花组培苗生长的影响[j].国土与自然资源研究，2011)；紫萼玉簪组培苗半致死剂量为5gy(李黎，曲彦婷，陈菲.紫萼玉簪组培苗的辐射育种研究[j].林业科技，2014)；丰花月季组培苗半致死剂量为50gy(张兴，唐焕伟，车代弟.丰花月季⁶⁰co-γ辐射育种研究及后代变异的初步分析[j].国土与自然资源研究，2010)；中国专利文献cn103975861a公开了蕨类植物绿色球状体⁶⁰co-γ射线辐射诱变方法，在离体培养条件下，以蕨类植物无菌苗诱导产生的绿色球状体为材料，⁶⁰co-γ射线为辐射源，为在器官水平上开展蕨类植物辐射诱变育种提供新技术，适用于蕨类植物新品种选育。

但是，辐射诱变育种是一个复杂的过程，包含有不同表型的阶段，而每个阶段既决定于细菌基因，又依赖于寄主植物的基因。目前对非豆科药材的生物固氮及其结瘤固氮对药材质量影响等相关研究甚少，对穿心莲的影响研究更是罕见，开发利用根瘤菌资源、提高穿心莲原料药材的质量已经成了市场迫切请求。

现代中药植物的辐射诱变也存在一些问题。首先是辐照诱变很容易严重损害中草药植物的遗传背景；其次，在辐射诱变育种过程中很难确定不同植物所需的最适诱变因子和诱变剂量。因而对辐射诱变因子和诱变剂量的选择有较大的盲目性需要通过实验进行反复筛选才能确定。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中穿心莲品种退化，产量和质量下降的问题，提供一种选育穿心莲高产优质抗逆优良新品种的方法。

本发明另一目的是提供上述方法在进行耐盐和/或耐干旱穿心莲育种中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种选育穿心莲高产优质抗逆优良新品种的方法，包括以下步骤：

s1.材料准备：以穿心莲种子为材料，⁶⁰co-γ射线为辐射源进行辐射处理，⁶⁰co-γ射线的辐照剂量是10～300gy；

s2.将经过辐射诱变处理的穿心莲种子分成3组，对照组进行蒸馏水浸种处理萌发，第一试验组在含nacl溶液的盐胁迫环境下进行萌发，第二试验组在含peg6000溶液的干旱胁迫环境下进行萌发，萌发3～4d后计算发芽势，萌发7～8d后计算发芽率，并计算发芽指数、活力指数、根长、芽长或鲜重；

s3.根据盐胁迫处理和干旱胁迫处理种子的每个样品中发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长和鲜重的变化筛选耐盐、耐干旱的高产优质抗逆优良新品种。

优选地，⁶⁰co-γ射线的辐照剂量是50～100gy。实验结果显示，50gy辐照剂量组的穿心莲总内酯内酯含量最高，为2.7514％，是对照组的175.14％；100gy辐照剂量组的穿心莲亩产产量最高，为128.147kg，是对照组的143.08％；穿心莲50gy辐照剂量组的耐盐性和抗旱性最优。

优选地，所述盐胁迫环境下进行萌发为：将经过辐射诱变处理的穿心莲种子分别浸泡在处理液：蒸馏水、0.1％nacl、0.2％nacl、0.3％nacl、0.4％nacl、0.5％nacl、0.6％nacl、0.7％nacl、、0.8％nacl、0.9％nacl、1.0％nacl溶液中24～30h。

优选地，所述干旱胁迫环境下进行萌发为：将经过辐射诱变处理的穿心莲种子分别浸泡在处理液：蒸馏水、10％peg6000、12％peg6000、15％peg6000、18％peg6000、21％peg6000溶液中2～4h。

优选地，将所得的盐胁迫、干旱胁迫穿心莲种子浸泡后，用无菌滤纸吸干附着水分，分别置于铺有双层滤纸的培养皿内，置于光照培养箱中进行萌发培养实验；其中盐胁迫每个培养皿内加入5ml对应浓度的盐溶液。

优选地，所述萌发培养的条件为：温度为25±2℃，光照强度为10000～12000lx，光照时间为12h光/12h暗。

优选地，盐胁迫种子萌发期间每1d补加一次蒸馏水，使盐浓度在种子萌发过程中保持恒定；干旱胁迫种子萌发期间每2d更换一次peg6000溶液，使水势在种子萌发过程中保持恒定。

优选地，每培养皿20～50粒种子，实验设3～5次重复。

优选地，在⁶⁰co-γ射线辐射前，对穿心莲种子进行预处理：精选无破损、大小一致的种子，分别用0.5％～1％的次氯酸钠消毒20～25min，用蒸馏水冲洗3～5次，用滤纸吸干附着水分。

所述方法在进行耐盐和/或耐干旱穿心莲育种中的应用，也在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明表明采用适宜剂量的⁶⁰co-γ射线辐照穿心莲种子有望成为实践中分别改善穿心莲在盐胁迫和干旱胁迫下耐性的好方法，应用潜力很大。本发明可以选育出高产、优质、抗逆性优良的穿心莲新种质，丰富穿心莲种质资源，具有较强的实用性和推广性，实验证明，该方法设计合理，结果可信，并具有推广价值，是解决穿心莲的品种退化、产量和质量下降等多种问题的有效途径之一，为丰富穿心莲种质资源提供理论依据和技术基础。

附图说明

图1是50gy辐照剂量组穿心莲内酯含量高效液相图。

图2是50gy辐照剂量组脱水穿心莲内酯含量高效液相图。

图3是不同nacl浓度对穿心莲幼苗根长、芽长的影响；其中，1～3：对照组穿心莲幼苗；4～6：0.1％nacl胁迫的穿心莲幼苗；7～9：0.2％nacl胁迫的穿心莲幼苗；10～13：0.3％nacl胁迫的穿心莲幼苗。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1⁶⁰co-γ射线对穿心莲亩产产量的影响

1、方法

挑选饱满均匀的穿心莲种子，用去离子水清洗，除去悬浮的瘪粒和杂质后，用1％的次氯酸钠消毒20min，用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干附着水分后，用不同剂量的⁶⁰co-γ射线(0、10、20、50、100、200、300gy)辐照后，取各个辐照剂量组的穿心莲种子100粒，用蒸馏水浸泡24h。将各个剂量组的穿心莲种子播种于50穴育苗盆中，每1粒种子一个穴，每组两个育苗盆。每天中午12点和下午5点补充育苗盆中的水分，使培养土保持湿润，观察穿心莲幼苗的生长情况，待长出第三对真叶时随机选取20株穿心莲幼苗移栽于大棚。始花期采收穿心量植株，用分析天平测定穿心莲单株的鲜重、干重，结果见表1。

2、结果

表1不同辐照剂量下穿心莲植株鲜重的统计分析(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

由表1可知，p＜0.05，即不同辐照剂量对穿心莲植株鲜重有显著性影响，随着辐射剂量的增高，穿心莲植株的鲜重呈先上升后下降的趋势。其中，100gy剂量组的穿心莲植株鲜重最大，约为对照组的143.08％；50gy剂量组次之；而300gy剂量组的最小，约为对照组的46.61％。因此，50～100gy为选育穿心莲高产品质的较佳辐照剂量。

实施例2⁶⁰co-γ射线对穿心莲有效成分含量的影响

1、方法

选择生长状况良好的穿心莲植株，用药典方法进行有效成分含量的测量：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(52：48)为流动相；穿心莲内酯检测波长为225nm，脱水穿心莲内酯检测波长为254nm。理论板数按穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰计算均应不低于2000。取穿心莲内酯对照品、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml各含0.1mg的混合溶液，即得。取实施例1经过辐射诱变处理的穿心莲植株样品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％甲醇25ml，称定重量，浸泡1h，超声处理(功率250w，频率33khz)30min，放冷，再称定重量，用40％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，置中性氧化铝柱(200～300目，5g，内径为1.5cm)上，用甲醇15ml洗脱，收集洗脱液，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。然后分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见表2。

2、结果

图1是50gy辐照剂量组穿心莲内酯含量高效液相图。图2是50gy辐照剂量组脱水穿心莲内酯含量高效液相图。发明人经过大量的初步研究显示，不同照射剂量对穿心莲有效成分含量的测定结果有很大的影响。

表2不同剂量穿心莲地上部分的有效成分亩产量(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

由表2可知，p＜0.05，即不同辐照剂量对穿心莲有效成分含量有显著性影响，其中50gy辐照剂量组的穿心莲总内酯含量最高，为2.7514％，为对照组的175.14％；100gy辐照剂量组次之；因此，针对穿心莲优质新品种的选育，最佳辐照剂量为50～100gy。

实施例3穿心莲耐盐性实验

1、盐胁迫实验

(1)方法

盐分设置为(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0％)的nacl溶液(g/ml)。将穿心莲种子用不同浓度nacl溶液分别浸泡24h，取出后用滤纸吸干表面的水分。将浸泡过的种子均匀地放入铺有2层滤纸的培养皿中，每个培养皿内加入5ml相应浓度的nacl溶液(盐溶液浓度与浸种浓度一致)；将培养皿置于光照培养箱中培养，温度为25℃，光照强度为10000～12000lx，光照时间为12h光/12h暗。每个处理组50粒种子，设3个重复，每天补充一次蒸馏水以保证各盐浓度在种子萌发过程中保持恒定。每隔24h统计种子的萌发情况(以胚根突出种皮1mm为标准)，统计7天。统计发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、新重等生长指标，实验结果见表3。

(2)结果

表3不同nacl浓度下穿心莲种子各生长指标的统计分析(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

由表3可知，p＜0.05，即不同nacl浓度对穿心莲生长发育情况有显著性影响。在不同浓度的nacl胁迫下，穿心莲种子的生长状况受到不同程度的影响，随着nacl浓度的增高，穿心莲种子的各生长指标均呈下降的趋势。0.1％的nacl处理与对照组相比，发芽势，根长、鲜重的生长指标的差异较小；0.2％的nacl处理下，发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、鲜重等各个生长指标与对照组相比差异显著，分别为对照组的48.39、63.04、35.90、12.31、43.75、56.52％；0.3％、0.4％nacl处理下，发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、鲜重等各个生长指标与对照组相比差异显著，但是大多数穿心莲种子不能成长为正常苗，浓度0.4％以上的nacl盐溶液处理下，穿心莲种子发芽率为0，说明盐胁迫程度过重。综上所述，0.2％的nacl可以作为穿心莲种子耐盐性鉴定的适宜处理浓度。

2、⁶⁰co-γ射线对盐胁迫穿心莲的影响

(1)方法

将实施例1不同辐射剂量组的穿心莲种子用适宜浓度nacl溶液分别浸泡24h。将浸泡过的种子均匀地放入铺有2层滤纸的培养皿中，每个培养皿内加入5ml相应浓度的nacl溶液(盐溶液浓度与浸种浓度一致)，将培养皿置于光照培养箱中培养。每个处理组50粒种子，设3个重复，每天补充一次蒸馏水，以保证各盐浓度在种子萌发过程中保持恒定。每隔24h统计种子的萌发情况(以胚根突出种皮1mm为标准)，统计7天，实验结果见表4。

(2)结果

表40.2％nacl浓度下不同剂量组穿心莲种子各生长指标的统计分析(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

图3为不同nacl浓度对穿心莲芽长、根长的影响。由图3和表4可知，在0.2％nacl胁迫下，不同辐照剂量组的穿心莲种子的生长状况受到不同程度的影响，随着辐照剂量的增高，其中50gy剂量组的穿心莲幼苗的鲜重、根长、芽长最大，分别为对照组的137.50％、129.69％、102.78％，为0.2％nacl盐胁迫下的最佳辐照剂量，100gy剂量组次之。

实施例4穿心莲抗旱性实验

1、干旱胁迫实验

设置peg浓度为10％、12％、15％、18％、21％共5个处理组，空白组用蒸馏水，考察不同浓度peg6000对穿心莲种子干旱胁迫的影响。挑选预处理后的80颗种子，分为4组，每组20颗，浸入4组处理液中，室温下浸泡2h，取出后用滤纸吸干表面的水分，接种到铺有2层滤纸的培养皿内进行萌发培养实验，每个处理组重复3次，观察记录并计算各组种子的发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、新重等生长指标，实验结果见表5。

(2)结果

表5不同peg6000浓度下穿心莲种子各生长指标的统计分析(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

由表5可知，在不同浓度的peg胁迫下，穿心莲种子的生长状况受到显著性影响，随着peg6000浓度的增高，穿心莲种子的各生长指标均呈下降的趋势。10％、12％、15％的处理与对照组相比，发芽率的差异较小，18％、21％处理组则显著降低；随着peg浓度的增高，穿心莲种子的发芽势、根长等生长指标均呈下降的趋势。12％处理组的穿心莲发芽势、根长较对照组有显著差异，分别为对照组的64.90、49.86％；12％以上的pfg处理下，发芽势、根长、鲜重等各个生长指标与对照组相比差异显著，但是大多数穿心莲种子不能成长为正常苗，说明干旱胁迫程度过重。综上所述，12％的peg可以作为穿心莲种子耐旱性鉴定的适宜处理浓度。

2、⁶⁰co-γ射线对干旱胁迫穿心莲的影响

将不同辐射剂量组的穿心莲种子置于垫有2层滤纸的9cm培养皿中，在培养皿中分别添加5ml适宜浓度的peg6000溶液后，然后置于25℃恒温培养箱内进行培养，光照条件为12h光/12h暗，光照强度为10000～12000lx，每处理组3个重复，每个重复50粒种子。以蒸馏水处理的种子为对照。发芽期间每2d更换1次peg6000溶液处理的发芽床，以保持水势恒定。胚根突破种皮1mm计为萌发，以3次重复中最早有一粒种子发芽之日作为该处理发芽的开始期。统计发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、新重等生长指标，实验结果见表6。

(1)方法

将实施例1不同辐射剂量组的穿心莲种子置于垫有2层滤纸的9cm培养皿中，在培养皿中分别添加5ml适宜浓度的peg6000溶液后，然后置于恒温培养箱内进行培养，光照条件为12h光/12h暗，光照强度为10000～12000lx，每处理组3个重复，每个重复50粒种子。以蒸馏水处理的种子为对照。发芽期间每2d更换1次peg6000溶液处理的发芽床，以保持水势恒定。胚根突破种皮1mm计为萌发，以3次重复中最早有一粒种子发芽之日作为该处理发芽的开始期。统计发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长、新重等生长指标，实验结果见表6。

(2)结果

表612％peg6000浓度下不同剂量组穿心莲种子各生长指标的统计分析(n＝3)

p＜0.05，有显著性差异。

由表6可知，在12％peg6000胁迫下，不同剂量组的穿心莲种子的生长状况受到不同程度的影响，随着辐照剂量的增高，其中50gy剂量组的穿心莲种子鲜重、根长最高，分别为对照组的106.90％、103.92％，为12％peg6000干旱胁迫下的最佳辐照剂量。

从以上实例可以看出，采用适宜剂量的⁶⁰co-γ射线辐照穿心莲种子可有效地促进不同逆境胁迫下穿心莲种子的萌发和幼苗的生长，增加穿心莲幼苗生物量的积累，分别提高盐和干旱胁迫下穿心莲的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长和鲜重，减轻盐胁迫和干旱胁迫对种子和植株的伤害。采用⁶⁰co-γ射线辐照穿心莲种子在实践中易操作，有实效，有望成为实践中有效提高穿心莲种子发芽率，并分别改善穿心莲在盐胁迫和干旱胁迫下耐性的好方法，应用潜力

很大。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。