本发明属于生物
技术领域：
，本发明具体涉及一种苹果树腐烂病病菌抑菌剂。
背景技术：
：苹果树腐烂病(valsamalimiyabe&yamada)是苹果树中发生最严重的病害之一，在中国、日本、朝鲜、美国、俄罗斯、加拿大等苹果产区均有发生，而在亚洲东部地区发病尤为严重(曹克强等，2009；wangetal，2011)。该病分布广、危害重、防治难，被称为果树上的“癌症”。近年来，苹果树腐烂病在中国南北方各苹果产区危害较重，严重威胁着苹果产业的安全生产和农民增收。日本在20世纪初期首先报道了苹果树腐烂病的发生，并将病原菌定名为valsamalimiyabe&yamada(陈策，1980)。kobayashi根据子囊和子囊孢子的形态特征又将该病菌命名为valsaceratosperma。随后世界各国发现苹果树腐烂病及其严重危害的报道相继面世，越来越引起果农和相关领域科研工作者的重视，并纷纷开展相关研究和防治措施的探索，取得了较好的效果。但截止目前，该病仍然是一种难以治愈的果树病害。目前防治苹果树腐烂病多采用化学药剂，由此会导致病原菌产生抗药性，还会造成农药残留和环境污染。因此，筛选经济高效、环境友好的，以原生态生物材料制成的抑菌剂，对苹果树树腐烂病防控具有重要现实意义。参考文献[1]曹克强，国立耘，李保华，孙广宇，陈汉杰，2009，中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查，植物保护，35(20):114-116[2]wangxl，weijl，huangll.re-evaluationofpathogenscausingvalsacankeronappleinchina[j].mycologia,2011,103(2):317-324[3]陈策，1980，国外对于苹果树腐烂病、桃树腐烂病以及其他同类病害的研究近况，中国果树，(s1)：68～77[4]徐涛，胡同乐，王亚南，王树桐，曹克强，2012，苹果树皮内生真菌的分离及其对腐烂病的生物防治潜力，植物保护学报，39(4)：327～334[5]刘应敏，尹永香，张艳，蔡桂芳，赵颖，马荣，2016，新疆苹果树腐烂病病原菌(cytosporaschulzeri)的分离、鉴定及其生物学特性的研究，新疆农业大学学报，39(6)：447～452[6]桂腾茸，孔宝华，学林，姬盼，杨毅娟，石安宪，张彦明，马玉梅，曹克强，马钧，黄文静，2015，云南苹果树腐烂病菌分离株生物学特性和致病性研究，西南农业学报，28(5)：2096～2102[7]伦莹莹，于成明，李琴，何邦令，刘会香，2014，山东省苹果树腐烂病菌不同分离株的生物学特性研究，落叶果树，46(3)：30～33[8]王娟，王树桐，任佳慧，曹克强，2013，河北省苹果树腐烂病菌不同分离株生物学性状及致病性研究，河南农业科学，42(7)：72～75[9]臧睿，黄丽丽，康振生，王旭丽，2007，陕西苹果树腐烂病菌(cytosporaspp.)不同分离株的生物学特性与致病性研究，植物病理学报，37(4)：343～351[10]冯浩，程明明，张冕，高小宁，黄丽丽，2017，苹果树腐烂病菌生长发育相关突变体筛选及侧翼序列分析，西北农业学报，26(1)：144～151[11]薛应钰，范万泽，张树武，徐秉良，2016，苹果树腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及防效，应用生态学报，27(10):3379～3386技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种苹果树腐烂病病菌抑菌剂，本发明从抑制苹果树腐烂病病菌的生长出发，选用本发明技术方案的抑菌剂抑腐清，以目前抑制苹果树腐烂病病菌最为有效的腐植酸·铜为对照，对本发明技术方案提供的抑菌剂抑腐清的抑菌效果进行了实验研究。结果表明抑腐清的抑菌效果极显著高于腐植酸·铜的抑菌效果。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种苹果树腐烂病病菌抑菌剂；其原料组成包括新鲜钩吻叶片、新鲜苦菜叶片、苦豆子种子、大蒜、茶树油；所述新鲜钩吻叶片、新鲜苦菜叶片、苦豆子种子、大蒜、茶树油重量比为；10％～30％：10％～30％：10％～30％：10％～30％：10％～30％。进一步的，优选的新鲜钩吻叶片、新鲜苦菜叶片、苦豆子种子、大蒜、茶树油重量比为1:1:1:1:1。所述的一种苹果树腐烂病病菌抑菌剂其具体制备步骤如下：第一步，称取10～30wt％新鲜钩吻叶片、10～30wt％新鲜苦菜叶片、10～30wt％苦豆子种子，10～30wt％大蒜；第二步，将上述材料粉碎后加入10～30wt％茶树油，用蒸馏水定容至总重量的10～40倍；第三步，将上述溶液静置浸提12～48h，纱布过滤，过滤液备用。本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明的抑菌剂基于新鲜钩吻、新鲜苦菜、苦豆子、大蒜、茶树油的杀菌、抑菌协同作用原理。与目前抑制苹果树腐烂病病菌最为有效的腐植酸·铜相比，本发明提供的抑菌剂的抑菌效果极显著高于腐植酸·铜的抑菌效果，使用成本低，且无毒、无害、无副作用，属于环境友好型抑菌药剂。具体实施方式下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例采用如下实验步骤进行抑菌效果实验：pda培养基平板制作→培养基中央打孔并加入抑菌剂→接种→恒温培养→测量并统计分析。实施例1将灭菌后稍冷却的pda培养基倒入培养皿(直径9cm)制成平板，用打孔器(直径6mm)在平板中央打孔，将抑菌剂加入孔中，在孔四周接种苹果腐烂病菌菌盘，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水的处理为对照，每处理重复4次。待对照长满皿时测量各处理抑菌带大小并进行统计分析。所述抑菌剂的配比为：新鲜钩吻叶片10g、新鲜苦菜叶片10g、苦豆子种子10g，大蒜10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至2000ml，静置浸提12h，过滤液备用。表1.1对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(抑菌带，cm)对表1.1进行方差分析，结果见表1.2。表1.2对表1.1结果的方差分析变异来源自由度平方和均方f值f0.05f0.01处理间112.7512.751610.68**5.9913.70误差60.050.01总变异712.80由表1.2可知，处理与对照之间差异极显著。即：此种处理极显著好于不用药的。实施例2将灭菌后稍冷却的pda培养基倒入培养皿(直径9cm)制成平板，用打孔器(直径6mm)在平板中央打孔，将抑菌剂加入孔中，在孔四周接种苹果腐烂病菌菌盘，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水的处理为对照，每处理重复4次。待对照长满皿时测量各处理抑菌带大小并进行统计分析。所述抑菌剂的配比为：新鲜钩吻叶片15g、新鲜苦菜叶片15g、苦豆子种子15g，大蒜15g，粉碎后加入茶树油15ml，用蒸馏水定容至1500ml，静置浸提48h，过滤液备用。表2.1对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(抑菌带，cm)与实施例1同理，此种处理极显著好于不用药的。实施例3将灭菌后稍冷却的pda培养基倒入培养皿(直径9cm)制成平板，用打孔器(直径6mm)在平板中央打孔，将抑菌剂加入孔中，在孔四周接种苹果腐烂病菌菌盘，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水的处理为对照，每处理重复4次。待对照长满皿时测量各处理抑菌带大小并进行统计分析。所述抑菌剂的配比为：新鲜钩吻叶片30g、新鲜苦菜叶片30g、苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。表3.1对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(抑菌带，cm)与实施例1同理，此种处理极显著好于不用药的。一、抑菌效果比对实验以实施例3的配比为最优配比进行抑菌效果比对实验；将灭菌后稍冷却的pda培养基倒入培养皿(直径9cm)制成平板，用打孔器(直径6mm)在平板中央打孔，将抑菌剂加入孔中，在孔四周接种苹果腐烂病菌菌盘，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水的处理为对照，每处理重复4次。待对照长满皿时测量各处理抑菌带大小并进行统计分析。所述抑菌剂的配比为：新鲜钩吻叶片30g、新鲜苦菜叶片30g、苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。表4.1不同抑菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(抑菌带，cm)注：2.12％腐植酸·铜为生产上常用的苹果树腐烂病菌抑菌剂。对表4.1进行方差分析，见表4.2。表4.2对表4.1数据的方差分析变异来源自由度平方和均方f值f0.05f0.01处理间11.621.6214.84**5.9913.70误差60.660.11总变异72.28由表4.2可知，两种灭菌剂对苹果树腐烂病菌的抑制效果具有极显著差异，于是进行差异显著性检验，结果见表4.3。表4.3对表4.1数据的差异显著性检验处理平均数5％差异1％差异处理14.03aa处理23.13bb由表4.3可知，处理1极显著地好于处理2，即抑腐清对苹果树腐烂病菌的抑制效果极显著地好于腐植酸·铜的灭菌效果。二、钩吻、苦菜、苦豆子、大蒜、茶树油协同作用实验数据在实验中发现，新鲜钩吻叶片、新鲜苦菜叶片、苦豆子种子、大蒜、茶树油五种物质在一起时，对苹果树腐烂病病菌的抑制效果极显著地好于这五种物质各四四混合的抑菌效果。由于所有处理中试剂所用总量是相当的，如果这五种物质之间不存在明显的协同作用，这五种物质在一起的抑菌效果不会极显著地好于其他处理。这一结果实际上表明五者之间确实存在着协同作用，下面是实验结果(以最优配比为例)。抑菌剂1：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂2：新鲜钩吻叶片60g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂3：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片60g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂4：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子60g，大蒜30g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂5：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜60g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂6：新鲜钩吻叶片60g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂7：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片60g，苦豆子种子30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂8：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子60g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂9：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，粉碎后加入茶树油60ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂10：新鲜钩吻叶片60g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂11：新鲜钩吻叶片30g，苦豆子种子60g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂12：新鲜钩吻叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜60g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂13：新鲜钩吻叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油60ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂14：新鲜钩吻叶片60g，新鲜苦菜叶片30g、大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂15：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片60g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂16：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，大蒜60g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂17：新鲜钩吻叶片30g，新鲜苦菜叶片30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油60ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂18：新鲜苦菜叶片60g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂19：新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子60g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂20：新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜60g，粉碎后加入茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂21：新鲜苦菜叶片30g，苦豆子种子30g，大蒜30g，粉碎后加入茶树油60ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂22：新鲜钩吻叶片50g，新鲜苦菜叶片50g，苦豆子种子50g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂23：新鲜钩吻叶片50g，新鲜苦菜叶片50g，大蒜50g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂24：新鲜钩吻叶片50g，新鲜苦菜叶片50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂25：新鲜苦菜叶片50g，苦豆子种子50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂26：新鲜钩吻叶片50g，苦豆子种子50g，大蒜50g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂27：新鲜钩吻叶片50g，大蒜50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂28：新鲜苦菜叶片50g，苦豆子种子50g，大蒜50g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂29：新鲜苦菜叶片50g，苦豆子种子50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂30：新鲜苦菜叶片50g，大蒜50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂31：苦豆子种子50g，大蒜50g，粉碎后加入茶树油50ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂32：新鲜钩吻叶片75g，新鲜苦菜叶片75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂33：新鲜钩吻叶片75g，苦豆子种子75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂34：新鲜钩吻叶片75g，大蒜75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂35：新鲜钩吻叶片75g，粉碎后加入茶树油75ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂36：新鲜苦菜叶片75g，苦豆子种子75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂37：新鲜苦菜叶片75g，大蒜75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂38：新鲜苦菜叶片75g，粉碎后加入茶树油75ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂39：苦豆子种子75g，大蒜75g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂40：苦豆子种子75g，粉碎后加入茶树油75ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂41：大蒜75g，粉碎后加入茶树油75ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂42：新鲜钩吻叶片150g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂43：新鲜苦菜叶片150g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂44：苦豆子种子150g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂45：大蒜150g，粉碎后用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。抑菌剂46：茶树油30ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提36h，过滤液备用。将灭菌后稍冷却的pda培养基倒入培养皿(直径9cm)制成平板，用打孔器(直径6mm)在平板中央打孔，将以下各种抑菌剂加入孔中，在孔四周接种苹果腐烂病菌菌盘，放入26℃恒温培养箱培养，以加灭菌水的处理为对照，每处理重复5次。待对照长满皿时测量各处理抑菌带大小并进行统计分析。见表5.1。表5.1不同抑菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(抑菌带，cm)对表5.1进行方差分析，结果见表5.2。表5.2对表5.1结果的方差分析变异来源自由度平方和均方f值f0.05f0.01处理间45128.622.86118.36**1.491.76误差1383.330.02总变异183131.95由表5.2可知，处理之间存在着极显著的差异，于是进行差异显著性检验，结果见表5.3。表5.3对表1结果的差异显著性检验由表5.3可以看出，抑菌剂1的抑菌效果极显著地好于其他处理，即五种物质混合的抑菌效果极显著地好于各自单独，或两两混合、三三混合、四四混合的抑菌效果。由于所有处理中试剂所用总量是相当的，如果这五种物质之间不存在明显的协同作用，这五种物质在一起的抑菌效果不会极显著地好于其他处理。这一结果实际上表明五者之间确实存在着协同作用。以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。当前第1页12