一种自体脂肪颗粒低温保存方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种自体脂肪颗粒低温保存方法。

背景技术：

自体脂肪移植技术已经广泛地应用于例如：丰胸、隆鼻或者疤痕修复等整形手术中。虽然自体脂肪相较于传统的人工组织替代物具有相容性好、操作简便、填充外形好、手术创伤小、来源丰富等优势。但目前该技术仍存在移植脂肪细胞成活率低、坏死与吸收、感染等问题，移植时常需要少量、多次、反复注射。因此，如何提高自体脂肪颗粒的低温保存的成活率是一个亟待解决问题。

目前，低温保存脂肪颗粒往往是将脂肪颗粒存放在低温保护剂中，并提供较低温度，例如：-80摄氏度，进行存储。但是现有的储存方法中往往忽略了存储空间的气氛环境，由于存储空间的气氛环境不佳也会造成脂肪存储的性能裂化。

因此，需要提供一种自体脂肪颗粒低温保存方法，其能够避免脂肪污染，并提高后期脂肪移植的存活率。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种自体脂肪颗粒低温保存方法，其能够避免脂肪污染，并提高后期脂肪移植的存活率。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种自体脂肪颗粒低温保存设备，该设备包括冷藏柜1体、位于冷藏柜1体中的承载板21、气路系统、密封容器2和控制器13；冷藏柜1体包括容置空间和气体供应腔，容置空间通过多个隔板11形成多个用于容置密封容器2的独立空间，气路系统包括气体输送总管31、气体排放总管32、一端嵌入隔板内且另一端连接总管的气体输送支管33和气体排放支管34、气泵；该密封容器2，包括承载板21、密封板22、内部承载碗23、上盖24，承载板21上设置了两个通气道25，上述两个通气道25分别气体输送支管33和气体排放支管34连通。

进一步的，气体输送支管33和气体排放支管34嵌入承载板21内部，该气体输送支管33和气体排放支管34各自的一个端部嵌入隔板11内部，并且通过气体输送嘴36和气体排放嘴37从隔板11内部穿透该隔板11表面从该隔板11的上表面向上延伸。

进一步的，在气体输送总管31/气体排放总管32与气体输送支管33/气体排放支管34的连接处还设置了气体流量计以及电磁阀。

进一步的，该气体流量计和电磁阀连接控制器13，从而实现了对气路的开闭和气体流量的控制。

进一步的，气体输送总管31的进气端连接一个输入气体的气泵，气体排放总管32的出气端连接一个抽出气体的气泵；输入气体的气泵连接于一氮气气瓶35。

进一步的，输入气体的气泵、气体输送总管31、气体排放总管32、气体输送支管33、气体排放支管34、抽出气体的气泵系统设置为对称的两组。

进一步的，承载板21为纵截面为“凹”状的圆形板材，在“凹”状两侧凸起的内侧侧壁上设置了内螺纹，该上盖24为具有下部开口的钟状部件。其侧壁的下部具有外螺纹。

进一步的，通气道25的上部位向上深处的圆筒状，下部为与上部形状吻合的穿过承载板21的通孔，上部和下部构成了一个完整、贯通的通气道25。

一种所述的自体脂肪颗粒低温保存设备的自体脂肪颗粒低温保存方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，将经过提纯清洗过滤后的脂肪颗粒，装载到密封容器2内部；

第三步，将装有脂肪颗粒的密封容器2放入本申请提供的低温保存设备中，开始冷冻降温；

第四步，在冷冻降温的初始阶段，对密封容器2内部空间进行气体清洗；

第五步，在气体清洗步骤之后，脂肪完全进入冷冻状态(即脂肪本身达到-60～-80的预定冷冻温度)之前，对密封容器2进行气体充盈；

第六步，在脂肪完全进入冷冻状态后，通过控制器13关闭输入气体的气泵和抽出气体的气泵，并且关闭位于气体输送支管33和气体排放支管34的电磁阀，使得密封容器2内部的气氛稳定，进入稳定气氛冷冻状态。

进一步的，步骤六具体为在脂肪完全进入冷冻状态后，首先关闭输入气体泵和位于气体输送支管33上的电磁阀，并通过位于气体排放支管34的气体流量计进行计量，通过抽出气体的气泵和气体排放支管34将密封容器2内部容积的30％体积的气体抽出，关闭抽出气体泵和位于气体排放支管34上的电磁阀，使得密封容器2内部的气氛稳定，进入稳定气氛冷冻状态。

本发明提供的自体脂肪颗粒低温保存方法，其能够避免脂肪污染，并提高后期脂肪移植的存活率。

附图说明

图1为本发明提供的自体脂肪颗粒低温保存的结构示意图。

图2为本发明提供的自体脂肪颗粒低温保存密封容器2的结构示意图。

具体实施方式

下面将参照附图对本发明进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明而仍然实现本发明的有益效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。

为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须作出大量实施细节以实现开发者的特定目标。

为使本发明的目的、特征更明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。需要说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比率，仅用一方便、清晰地辅助说明本发明实施例的目的。

本发明提供的一种自体脂肪颗粒低温保存方法基于以下自体脂肪颗粒低温保存设备。如图1所示，该设备具有冷藏柜1体、位于冷藏柜1体中的隔板11、气路系统、密封容器2和控制器13。

冷藏柜1体包括两部分，位于上部的容置空间以及位于下部的气体供应腔。该冷藏柜1体具有必要的制冷设备、密封柜门和绝热部件以保证冷藏的效果。其中，容置空间用于容置存放冷冻脂肪颗粒的密封容器2，容置空间内部通过多个固定安装的隔板11，把容置空间分割为多个，例如4个，6个或者8个等。

气路系统包括气体输送总管31、气体排放总管32、一端嵌入隔板内且另一端连接总管的气体输送支管33和气体排放支管34、气泵。其中，气体输送支管33和气体排放支管34嵌入隔板内部，该气体输送支管33和气体排放支管34各自的一个端部嵌入隔板11内部，并且通过气体输送嘴36和气体排放嘴37从隔板11内部穿透该隔板11表面从该隔板11的上表面向上延伸，从而实现气体向放置冷冻脂肪颗粒的密封容器2内的输送和排放；该气体输送支管33和气体排放支管34各自的另一个端部分别连接气体输送总管31和气体排放总管32，从而实现气路的连接。

在气体输送总管31/气体排放总管32与气体输送支管33/气体排放支管34的连接处还设置了气体流量计以及电磁阀，该气体流量计和电磁阀连接控制器13，从而实现了对气路的开闭和气体流量的控制。气体输送总管31的进气端连接一个输入气体的气泵，气体排放总管32的出气端连接一个抽出气体的气泵。输入气体的气泵连接于一氮气气瓶35。通过控制器13的控制，输入气体的气泵能够将清洁的氮气通过气体输送总管31、气体输送支管33和气体输送嘴36通入设备内部，例如密封容器2内部。

优选地，为了更好的控制气体气流，可以将输入气体的气泵、气体输送总管31、气体排放总管32、气体输送支管33、气体排放支管34、抽出气体的气泵系统设置为对称的两组(如图1所示)。当然，如果冷藏柜1本身的容积比较小出于简化设备或者减少成本的角度考虑，可以将上述系统设置为单一一个。

在冷藏柜1内部被隔板11划分的单个的存放空间，分别单独配合放置一个密封容器2，该密封容器2存放了需要冷冻的脂肪颗粒。如图2所示，该密封容器2，包括承载板21、密封板22、内部承载碗23、上盖24。其中，承载板21为纵截面为“凹”状的圆形板材，在“凹”状两侧凸起的内侧侧壁上设置了内螺纹，方便于其他部件连接。该承载板21为不锈钢材料。在承载板21“凹”状的凹陷的底面上设置了两个中空圆柱状的通气道25，该通气道25的上部位向上深处的圆筒状，下部为与上部形状吻合的穿过承载板21的通孔，上部和下部构成了一个完整、贯通的通气道25。上述两个通气道25的位置分别对应于与该密封容器2对应的承载板21的气体输送嘴36和气体排放嘴37，并且能够将气体输送嘴36和气体排放嘴37分别插入上述两个通气道25内部，从而实现密封容器2与气路系统的连接。该通气道25的内壁材料优选为耐低温的橡胶材料，其直径尺寸比气体输送嘴36和气体排放嘴37的直径尺寸小2-3mm，从而实现气体输送嘴36和气体排放嘴37插入时的紧配合。

在承载板21“凹”状的凹陷的底面设置了密封板22，该密封板22为圆形平板，材料为耐低温的橡胶材料。该平板的外缘尺寸设置为与承载板21“凹”状的凹陷形状吻合且形成紧配合。在密封板22的与通气道25对应的位置上也设置了两个贯穿孔，方便通气道25通过并伸出。在密封板22的上表面固定连接了内部承载碗23，其用来容置脂肪颗粒。在密封板22的上表面且在内部承载碗23的外侧，还安装了上盖24。该上盖24为具有下部开口的钟状部件。其侧壁的下部具有外螺纹，方便与隔板11连接。

在使用过程中首先将承载板21通过通气道25分别与气体输送嘴36和气体排放嘴37插合，使得承载板21固定于隔板11之上，随后将固定连接内部承载碗23的密封板22安装于承载板21的凹陷表面上，最后通过将上盖24和承载板21的螺纹配合，将上盖24、承载板21和密封板22压紧安装配合，从而实现了密封容器2的密封闭合。

通过设置隔板11以及部分嵌入隔板11的气路系统能够有效地分离空间，并实现对于每一个密封容器2内部气氛的单独控制，有效地保证了冷冻的条件准确控制。

下面详细描述本发明提供的基于上述的低温保存设备的自体脂肪颗粒低温保存方法。所述的自体脂肪颗粒低温保存方法包括如下步骤：

第一步，将经过提纯清洗过滤后的脂肪颗粒，装载到密封容器2内部。

具体的，将提纯清洗过滤后的脂肪颗粒，放入内部承载碗23中，将承载板21通过通气道25分别与气体输送嘴36和气体排放嘴37插合，使得承载板21固定于隔板11之上，随后将固定连接内部承载碗23的密封板22安装于承载板21的凹陷表面上，最后通过将上盖24和承载板21的螺纹配合，将上盖24、承载板21和密封板22压紧安装配合，从而实现了脂肪颗粒的密封装载。

优选的，该脂肪颗粒可以加入低温保护剂，上述低温保护剂可以为二甲基亚砜和海藻糖，或者为其他本领域常用的低温保护剂。

第二步，将装有脂肪颗粒的密封容器2进行预冷却。

具体的，将装载脂肪颗粒的密封容器2，放置到本领域常见的冰箱或其他冷藏设备中，进行初步冷却。使得该密封容器2以及脂肪颗粒的温度降至0摄氏度附近。

优选地，根据脂肪颗粒的体积确定预冷却的时间，每5ml脂肪的预冷却时间为15分钟。

第三步，将装有脂肪颗粒的密封容器2放入本申请提供的低温保存设备中，开始冷冻降温。

具体的，将气体输送嘴36和气体排放嘴37分别插入密封容器2的两个通气道25。实现密封容器2内部的容置空间与气路系统的连接。随后关闭冷藏柜1体的密封门，开始进行冷冻降温，该冷冻的温度为-60～-80摄氏度。

第四步，在冷冻降温的初始阶段，对密封容器2内部空间进行气体清洗。

与开始进行冷冻降温的时间同步，对密封容器2内部空间的气氛进行气体清洗。具体步骤包括：通过控制器13控制输入气体的气泵和抽出气体的气泵进行工作，抽出气体的气泵通过气体排放嘴37抽出密封容器2内部的原有气体，输入气体的气泵通过气体输送嘴36向密封容器2内部冲入纯净，干燥的氮气。通过上述气体的流动清洗，净化了密封容器2内部的气氛，不仅能够去除原有气体中的颗粒污染，也能够降低密封容器2内部较高的氧分压，提高了脂肪保存的效果。

优选地，该气体清洗步骤过程中，控制器13通过控制位于气体输送支管33和气体排放支管34上的气体流量计来控制气流的流量。清洗步骤过程中，气体输送支管33上的气体流量不超过气体排放支管34上的气体流量，从而更有有利于密封容器2内部气体和颗粒的充分排出。进一步优选地，由于气体流动和相对较低的气压会影响热量传导，因此为了不影响冷冻降温的效果，上述清洗步骤的时间不超过10分钟，优选为5分钟。并且保证在清洗步骤时间内，密封容器2内部体积的气体被置换过最少一次，优选为2-3次。因此，根据密封容器2的体积可以据此选择恰当的气体流量来实现上述必要的条件。

第五步，在气体清洗步骤之后，脂肪完全进入冷冻状态(即脂肪本身达到-60～-80的预定冷冻温度)之前，对密封容器2进行气体充盈。

在气体清洗步骤之后，脂肪完全进入冷冻状态(即脂肪本身达到-60～-80摄氏度的预定冷冻温度)之前，通过控制器13控制气体流量计，实现气体输送支管33上的气体流量大于气体排放支管34上的气体流量，气体排放支管34上的气体流量不超过40sccm。优选地，气体输送支管33上的气体流量比气体排放支管34上的气体流量大10-20sccm.实现了在这个期间内密封容器2内部较高的气压。其外，气体充盈步骤中，在较低的气体流速和较高的氮气气压下，既能够实现气体的清洗，有能够实现较为快速的热量传递，提高脂肪冷却的效率，实现了脂肪的快速冷却，保证了脂肪的质量。

此外，对于在气体清洗步骤之后，脂肪完全进入冷冻状态(即脂肪本身达到-60～-80的预定冷冻温度)之前的时间段的判断，可以根据脂肪的体积来计算，根据实验数据分析，每5ml脂肪对应20-30分钟冷冻时间后完全进入冷冻状态。

第六步，在脂肪完全进入冷冻状态后，通过控制器13关闭输入气体的气泵和抽出气体的气泵，并且关闭位于气体输送支管33和气体排放支管34的电磁阀，使得密封容器2内部的气氛稳定，进入稳定气氛冷冻状态。

作为替换例，步骤六也可以为，在脂肪完全进入冷冻状态后，首先关闭输入气体泵和位于气体输送支管33上的电磁阀，并通过位于气体排放支管34的气体流量计进行计量，通过抽出气体的气泵和气体排放支管34将密封容器2内部的气体抽出，该气体抽出的流量和时间控制方式为：根据密封容器2内部容积，抽出该内部容积的30％体积的气体。随后，关闭抽出气体泵和位于气体排放支管34上的电磁阀，使得密封容器2内部的气氛稳定，进入稳定气氛冷冻状态。这样使得在稳定气氛冷冻状态中，气压较低，避免了温度的过度传导和气氛对脂肪活性的影响。

将新鲜去除的脂肪经过清洗过滤后一分为二，一部分通过本申请提供的保存方法冷冻两周(试样1)，另一部分通过常规的冷冻保存方法(加入相同的低温保护剂后置入-80摄氏度的冷冻室内冷冻两周，试样2)，两周后将上述试样1，2，采用相同的解冻恢复处理，并进行测试。试样1的葡萄糖转移量在冷冻前为1.575±0.075mmol/l，冷冻后为1.524±0.052mmol/l，试样2葡萄糖转移量在冷冻前为1.594±0.073mmol/l，冷冻后为1.248±0.063mmol/l。将上述试样1，2分别进行了动物的活体移植，在移植前记录试样1，2的脂肪体积为1ml，在移植两周后，从移植部位取材。先在移植部位找到移植物，环绕移植物周围0.3cm切开皮肤肌肉，取出脂肪移植物，分离修去周围组织及外周包膜以充分暴露纯脂肪移植体，通过组织观察和通过精密测量器微刻度试管测量。试样1，2的移植物内及周围组织均可观察到明显的炎症反应，部分脂肪包块内甚至可见坏死的组织和脓肿，试样2严重于试样1。通过精密测量器微刻度试管测量，试样1脂肪体积为0.628±0.035ml，试样2脂肪体积为0.521±0.014ml，可见本申请提供的冷冻方法保存的脂肪移植组优于常规冻存脂肪移植组，通过本申请提供的冷冻方法保存的部分细胞功能、形态较好，成活率较高。

通过上述自体脂肪颗粒低温保存方法，其能够避免脂肪污染，并提高后期脂肪移植的存活率。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。