本发明涉及林业生物防护
技术领域：
，尤其涉及一种无人工合成药物的微生物复配制剂及其在处理感染松材线虫病的松树病疫木(枝)方面的应用。
背景技术：
：松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)是国际上公认的检疫性有害生物，给很多国家造成了极为严重的经济、生态和社会损失，也是我国危害最为严重的林业外来有害生物之一。松材线虫病，即松树萎蔫病(pinewiltdisease，pwd)，是一种以松材线虫为病原，松墨天牛属昆虫为主要媒介，综合人为参与、寄主松树、相关伴生菌和环境因素相互作用的复杂病害系统。松材线虫是一种需要显微镜才能看得见的寄生虫，主要寄生在松墨天牛上。松墨天牛作为松材线虫病传播的主要媒介，仅一只天牛就可以携带28万条松材线虫，羽化的天牛携带着松材线虫飞到生长茂盛的松树上取食。在天牛啃食松树皮的过程中，松材线虫进入松树，并大量繁殖，吸食树的汁液，破坏养分输送。染病的松树枝叶大多呈暗红色，树枝上的针叶轻轻一碰就掉；树干上布满棕黄色的木屑，树皮轻轻一剥就掉。松树染病后在60～90天内枯死，3～5年即可摧毁成片的松林。因此，松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,被称为松树的“艾滋病”，具有传播途径广、致病力强、防治难度大等特点，是我国目前最严重的森林灾害。当前使用最广泛的处理感染松材线虫病疫木(枝)的方法是填埋加药物熏蒸。为了彻底灭杀松材线虫，该方法要求对患病、受感染的松树整枝或整棵去除，对于与染病松树靠得比较近的松树，即使暂时没有染病症状，也要进行部分去除。砍下的松树疫木，将分为两种处理方法：山势较高、交通不便无法运输的地区，将就地挖坑集中堆放处理，将疫木锯成小段后，用塑料布对疫木包裹，避免昆虫媒介携带其逃窜，并在外部增加密网，施放剧毒药物熏蒸杀虫，木材将会在原地腐烂分解；便于运输的地区，疫木将被施工单位统一运送至木业处理厂进行高温消毒处理，合格的将被加以利用。一般是前者的情况比较多，这种方法不仅严重破坏自然景观和森林生态系统的健康，也在人力、物力、财力、资源方面有相当大的消耗。但除此之外，世界上尚无简便、经济可行的办法治疗该病害。针对松材线虫的防治，申请人于2015年研制出一种较为有效的药剂，包括天然皂苷和抗生素溶杆菌，在实验室环境下对松材线虫的杀灭效果很好，但是将其用于户外松林时，防控效果有限，仍然需要进一步研究寻找更好的防控方法。技术实现要素：本发明的目的在于针对林业防治松材线虫病存在的局限性，提供一种新的复配制剂，主要针对有天牛卵存在的松树，虽然不能彻底杀灭松材线虫，但可以中断其在原有基础上进行蔓延的趋势，既能减少化学农药的污染，又能达到成本可控，保护我国森林资源和生态环境的效果。本发明提供的一种复配制剂，由a组分微生物发酵液和b组分植物萃取物复配而成；其中，a组分微生物发酵液由微生物、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、糖蜜、复合肥及水发酵而成；所述微生物为枯草芽孢杆菌；b组分植物萃取物为无患子皂苷、皂荚皂苷和茶皂苷中的一种或多种。研究发现感病松树是由于输水管被松材线虫及其共生菌过度繁殖而堵塞，导致水分传导下降，致使木质部变薄，形成层破坏，从而引起整棵松树病变。本发明采用枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)发酵液与植物萃取物联合复配，抑制从天牛取食、产卵一直到线虫生长繁殖的整个过程，进而阻止输水管堵塞，保护林木。由于不同的枯草芽孢杆菌优势菌株分泌的物质及作用效果存在差别，上述技术方案中，采用的枯草芽孢杆菌菌株优选来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为cgmccno.14950。该枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌，在与其他需氧微生物共存时，能够迅速夺取氧气，阻止其他微生物定殖，同时产生能够抑制细菌、病毒、真菌和病原体的生长的抗生素类物质，如此，既有效提高营养物质的利用效率，也能保护植物免受侵害。除此之外，其能分泌几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶，可作用于生物的组织结构。可以对堵塞输水管的松材线虫及其伴生微生物作用，保证输水管的畅通。上述技术方案中，胶原蛋白(collagen)为动物皮、骨粉碎或提取的粉末，其中胶原蛋白的含量为30％～65％。一些实例中，胶原蛋白为猪皮胶原蛋白。另一些实例中，胶原蛋白为牛皮胶原蛋白。还有一些实例中胶原蛋白为鱼类软骨胶原蛋白。上述技术方案中，氨基酸(aminoacid)是重要的营养物质，本发明所用的复合氨基酸的主要成分为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等。其来源不限制，可以是动物或植物酸解或碱解制得，也可以是微生物发酵制得。本发明中，所述复合氨基酸为饲料用复合氨基酸。上述技术方案中，糖蜜是制糖工业的副产品，含有少量粗蛋白质和大量蔗糖，一般有甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等。本发明中，所述糖蜜为甘蔗糖蜜。上述技术方案中，复合肥为普通市售农用复合肥。上述技术方案中，b组分优选天然无患子皂苷提取物。上述技术方案中，a组分微生物发酵液原料优选混合后微生物的质量分数为0.01‰～1‰；胶原蛋白的质量分数为0.1‰～1‰；氯化钠的质量分数为0.01‰～9‰；复合氨基酸的质量分数为0.1‰～10‰；糖蜜的质量分数为1‰～10‰；复合肥的质量分数为1‰～20‰。作为优选，上述技术方案中，复配制剂中微生物活菌数不低于1×109cfu/ml～20×109cfu/ml。最佳的活菌数为1×1010cfu/ml。上述技术方案中，所述微生物、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、糖蜜、复合肥的质量比优选为(0.01～1)：(0.1～1)：(0.01～9)：(0.1～10)：(1～10)：(1～20)。上述技术方案中，所述复合氨基酸优选为动物蛋白废弃物、豆粕、猪血粉中的一种或几种的提取物。上述技术方案中，所述复合肥的n、p、k的质量比优选为(10～20)：(10～20)：(10～20)。n、p、k均为水溶性的组分存在，如：no3-、nh4+、po3-、po43-、hpo42-、h2po4-、p6o186-、p2o74-、k+。一些实例中，复合肥n、p、k的存在形式为nh4no3/k2hpo4/kh2po4，n/p/k＝15/15/15、n/p/k＝15/15/17或n/p/k＝15/15/20。上述技术方案中，优选将所述a组分微生物发酵液稀释1～4倍后和b组分植物萃取物按照质量比(100～500)：1复配而成。以上任一所述技术方案中，a组分微生物发酵液中的微生物优选还有蜡状芽孢杆菌和抗生素溶杆菌。蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)常用作生物防制剂，已被证实在106cfu/ml的发酵液具有杀灭作物致病菌的作用，同时也有杀虫活性。抗生素溶杆菌(lysobacterantibioticus)可破坏原有微生物环境，并对多种微生物和植物线虫具有抑制活性。此两种菌株皆为一般市售即可。枯草芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌和抗生素溶杆菌复配以后，相互协同作用，可显著增强对天牛产卵的抑制以及天牛孵化的抑制作用。上述技术方案中，枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和抗生素溶杆菌的优选数量比为(1～10)：(1～10)：(1～10)。本发明还提供了以上任一所述复配制剂的制备方法，包括以下步骤：将微生物、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、糖蜜、复合肥与水混合，25℃～35℃、鼓泡通气、ph6～8的条件下发酵48小时，进行发酵制得a组分微生物发酵液；优选鼓气速率20l/min，溶氧量为20％。a组分微生物发酵液与b组分植物萃取物复配。本发明还提供了一种用于处理感染松材线虫病的松树疫木的生物复配菌剂，其含有以上任一所述的复配制剂。本发明还提供了上述生物复配菌剂的使用方法，是对染病松树整体表面均匀喷洒、湿润生物复配菌剂，施用量为50l/亩～100l/亩。本发明提供的复配制剂及其制备方法和应用方式，具有如下有益效果：本发明的复配制剂a组分对松材线虫和松墨天牛卵及幼虫有抑制作用，b组分的存在使得a组分更容易发挥作用。在实例中对染病的松树林进行喷洒，结果表明，使用本产品后对天牛的杀灭率达70％以上，从源头上阻断了松材线虫的传播，大大降低了患病树木对未患病树木的感染率，并且喷洒过该复配制剂的染病松树，没有出现疫情的再次扩大和传播的现象，有效阻止了病情向其他健康松树蔓延的情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚详细地说明，以使本领域技术人员能够更好地理解并予以实施。本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。实施例1枯草芽孢杆菌1kg，胶原蛋白0.1kg，氯化钠5kg，复合氨基酸1kg，糖蜜10kg，复合肥10kg。其中胶原蛋白为猪皮胶原蛋白，复合氨基酸为饲料用，复合肥中n/p/k＝15/15/15。水1000l，加入微生物、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、糖蜜、复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度为室温25℃，培养时间为48h，即得a组分生物制剂。将所得a组分稀释1倍，加入8lb组分。其中b组分为无患子皂苷提取液。b组分在整个体系中的质量百分比为：0.395％。实施例2枯草芽孢杆菌0.2kg，蜡状芽孢杆菌0.01kg，抗生素溶杆菌0.5kg，胶原蛋白0.1kg，氯化钠9kg，复合氨基酸2kg，糖蜜1kg，复合肥5kg。其中胶原蛋白为牛皮胶原蛋白，复合氨基酸为饲料用，复合肥中n/p/k＝15/15/15。水1000l，加入微生物、胶原蛋白、糖蜜、复合氨基酸、复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度为室温33℃，培养时间为48h，即得a组分生物制剂。将所得a组分稀释4倍，加入40lb组分。其中b组分为茶皂苷提取液。b组分在整个体系中的质量百分比为：0.797％。实施例3枯草芽孢杆菌0.5kg，蜡状芽孢杆菌0.5kg，胶原蛋白0.1kg，氯化钠9kg，复合氨基酸2kg，糖蜜1kg，复合肥5kg。其中胶原蛋白为猪皮胶原蛋白，复合氨基酸为饲料用，复合肥中n/p/k＝15/15/20。水1000l，加入微生物、胶原蛋白、糖蜜、复合氨基酸、复合肥鼓泡通气进行培养，培养温度为室温35℃，培养时间为48h，即得a组分生物制剂。将所得a组分稀释2倍，加入30lb组分。其中b组分为无患子皂苷提取液。b组分在整个体系中的质量百分比为：0.994％。各实施例制得复配生物制剂a组分经检测，菌种密度如表1：表1各实施例菌种密度实施例菌种密度实施例12.8×1012实施例28.1×1013实施例31.0×1013结果表明，本发明各实施例中提供的复配制剂a组分具有非常高的菌体密度。对比例1枯草芽孢杆菌2.0kg、胶冻样芽胞杆菌0.5kg、胶状溶杆菌1.0kg、蟹粉0.5kg、虾粉0.5kg、胶原蛋白0.05kg、nacl0.05kg、氨基酸10kg、碳水化合物20kg、复合肥10kg。其中，胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白，氨基酸为菜叶发酵物，每100g氨基酸添加硫酸锌40g、硼酸5g，碳水化合物为蔗糖、复合肥中n/p/k＝15/15/15。水1000l，加入菌种、虾壳粉、胶原蛋白、nacl鼓泡通气进行培养，培养温度保持在30℃，培养时间为3天；在一次培养的基础上，加入氨基酸、碳水化合物、复合肥，继续鼓泡通气进行培养，培养温度保持在30℃，培养时间为4天，即得微生物制剂。上述微生物制剂用水稀释至106cfu/ml，再加入无患子提取液，组成复配制剂，使无患子提取液在整个体系中质量百分比为0.40％。对比例2取抗生素溶杆菌培养物稀释至106cfu/ml，再加入无患子提取液，组成复配制剂，无患子提取液在整个体系中质量百分比为0.40％。实施例4复配制剂对存在松墨天牛卵的疫木(枝)，即间接对松材线虫传播的防治效果：a.将实施例1～3中的复配生物制剂a组分使用水稀释后，复配b组分检测其对松墨天牛的防治效果。另外将对比例1和对比例2进行同样条件下的实验。b.试验方案1.采样地松木分布图绘制选择已部分发生松材线虫虫害的松林作为试验点，并绘制采样地松木分布图，并使用不同符号标记每棵松树的染病情况，以便于对比使用复配生物制剂前后的效果。表2松树的染病情况标记表标记方式染病情况0级未染病，树体健康，无侵染ⅰ级轻度染病，树梢侵染变红ⅱ级轻中度染病，侵染至树冠中上部ⅲ级中度染病，侵染至树冠中部ⅳ级中重度染病，侵染至树冠中下部ⅴ级重度染病，接近死亡2.取样部位：若整株个别枝条枯萎则于枝条处取样；若植株针叶失绿则于树木高处取样；若整株感病则于离地1.5m主干处取样。3.取样方法：钻孔取样：留取无树脂的钻孔的木屑(ⅴ级树整株变红的)；诱剂取样：使用信息素制成诱芯在钻孔处诱捕线虫取样。4.取样记录：详细记录感病树木的树木编号、树木胸径、取样位置、症状(等级)、携带线虫数的情况。并对染病树木根据编号进行拍照，每棵树每次拍照位置相同。5.室内试验方法：将取回的样品分别做4组实验。第一组：天牛取食实验步骤：1.将取回的松木段12～16cm长，一分为二，一半喷施复配生物制剂，另一半喷施清水作为对照，自然风干30分钟；2.试前将天牛饥饿6小时，再将处理过的木段和天牛放于培养皿中，18小时后观察天牛对松枝的取食情况。第二组：天牛产卵实验步骤：将多对处于孵化期的天牛置于箱中观察天牛对于喷施复配生物制剂和不喷施的木段的产卵情况，连续观察15天左右。第三组：天牛孵化率实验步骤：将已经产了卵的木段进行喷药。10天后观察天牛幼虫孵化率。第四组：对天牛的灭杀实验步骤：将复配生物制剂直接喷在天牛表面，观察天牛成活情况。对照组喷清水。结果分析：表3天牛取食实验结果表4天牛产卵实验结果表5天牛孵化率实验结果表6对天牛的杀灭实验结果从上述4组实验的结果可以看出复配制剂在对松墨天牛的杀灭及在防控感染松材线虫病的疫木(枝)传播方面效果明显。以上述实验方案为例，对不同的采样点在不同的时间段进行数次的检测，结论均表现出方案有效性肯定。除以上4组实验外，我们还对松材线虫虫卵、幼虫和成虫的灭杀效果做了对应实验，实验将上述5组指标加入到线虫培养液中，清水作为对照，结果如下：表7对松材线虫的作用效果如上表所示本发明中复配制剂几乎可以全部杀灭线虫虫卵、幼虫及成虫；对比例配方制剂可有效溶解虫卵和幼虫表皮使其死亡，但对成年线虫灭杀效果不明显。6.户外试验方法：试验点：为部分已经染病的湿地松林和马尾松林；试验方法：随机划分不同区域块，每块区域包含50棵松树以上，每个区域块至少间隔50m以上(避免发生交叉扩散的现象)。对该区域松树发病级别进行统计后，对松林中染病区域进行喷施，喷施周期为50～60天。喷施一次后，再次统计喷施后的结果。表8对马尾松林的实验结果表9对湿地松林的实验结果因考虑到户外对照组对松林的影响极其恶劣，并且后果是不可逆转的，故在第二次选择湿地松林实验时未做对照试验。由表7可以看出马尾松林试点，试验组实施例1、2、3的松树与两个月前比较没有大的变化，基本保持了原有感病状态，甚至有部分松树患病等级减弱的趋势，如实施例2中ⅱ和ⅲ级树均减少1棵，有2棵患病树转变为健康树；实施例3减少了1棵ⅳ级树和3棵ⅱ级树。对比例1、2较本发明中复配制剂对松材线虫蔓延控制效果略差，但好于对照组，对比例1、2分别有10％和17％的健康树转变为感病树，但是感病程度较重的ⅱ、ⅲ、ⅳ级松树没有继续发展。对照组扩散明显，健康树减少22％，ⅰ～ⅴ级患病树都有增加，有明显的疫情加重及持续扩散的迹象。表8湿地松林试点，实施例1期间仅有2.2％的健康树被侵染，减少4棵ⅱ级树和1棵ⅳ级树。实施例2健康树没有变化，同时减少2棵ⅱ级树。实施例3有1棵健康树变成ⅰ级病树，ⅳ级树减少2棵。对比例1、2中分别有6％和3％健康树被侵染，且对比例1中ⅳ级树增加1棵，对比例2ⅴ级树增加一棵有少部分健康树向一级染病树变化的趋势。林间施用过程中发现在单棵树上，复配制剂喷施充分部位病况不再蔓延和侵染，喷施不充分的部位可见少量枝条被侵染，故被侵染部分可以猜测是喷施不充分造成的。从以上的户外松林实验可以看出，本发明中的复配生物制剂在用于治理松树的松材线虫病方面的手段及效果要好于市面上现有方法。可以在不砍伐染病松树的情况下控制(减缓或阻止)松材线虫疫情持续在松林内蔓延的趋势及减轻(或阻止)患病松树继续向更严重的等级发展，虽不能彻底根除松材线虫病，但是在当前阶段保护松林，控制松材线虫病上绝对是一大进步。本发明提供了一种处理感染松材线虫病的松树疫木(枝)的复配制剂及应用。本领域的技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域的技术人员来说都是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3