本发明属于湖羊养殖
技术领域：
，具体涉及一种湖羊精液冷冻保存液及其用途。
背景技术：
：湖羊是太湖平原重要的家畜之一，是我国一级保护地方畜禽品种。湖羊体格中等，公、母均无角，头狭长，鼻梁隆起，多数耳大下垂，颈细长，体躯狭长，背腰平直，腹微下垂，尾扁圆，尾尖上翘，四肢偏细而高。被毛全白，腹毛粗、稀而短，体质结实。湖羊为稀有白色羔皮羊品种，具有早熟、四季发情、一年二胎、每胎多羔、泌乳性能好、生长发育快、改良后有理想产肉性能、耐高温高湿等优良性状，分布于我国太湖地区，终年舍饲中国羔皮用绵羊品种，产后1～2日宰剥的小湖羊皮花纹美观，著称于世。精液冷冻保存与人工授精技术在现代化畜牧业生产中发挥着举足轻重的作用，应用冷冻精液进行人工授精可以不受时间、地域、品种及个体的限制，并且大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优良种公畜的利用率，提高养殖业的经济效益。同时该技术对品种引进、杂交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及保护遗传多样性保护方面也具有重要的意义。羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力。现有羊冷冻精液解冻后活率较低且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差，很难满足人工授精的需要。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种湖羊精液冷冻保存液，可有效提高湖羊精液在保存过程中的存活率、活力和完整性，保存的精液解冻后仍然具有较好的授精能力，受胎效果稳定，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种湖羊精液冷冻保存液，包含以下组分：tris、葡萄糖、棉子糖、麦芽油、柠檬酸钠、甘油、冷冻保护剂、青霉素和链霉素；所述冷冻保护剂包括黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物。优选地，所述冷冻保护剂中黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。麦芽油中含有维生素e、胆碱、植物固醇等营养物质，还有谷胱甘肽等多种微量元素。其含有的二十八碳醇是国际公认的抗疲劳物质，作为天然营养剂而具有增强体力，改善肌肉机能，提高反应灵敏性和运动耐久力的作用。麦芽油具有抗不育、抗衰老、促进人体新陈代谢，增强体力和记忆力，降低胆固醇、防治动脉硬化，改善血液循环和增强人体免疫力的功能。黄芪提取物，豆科植物黄芪的根提取物，含有皂苷、黄酮、多糖以及氨基酸等成分，具有增强免疫力，增强能量，抗疲劳，抗突变，保肝和抑制破骨细胞等作用。黄芪多糖具有降血脂，即降低胆固醇和甘油三酯、升高高密度脂蛋白的作用；能够预防和治疗心脑血管疾病，如动脉粥样硬化、冠状动脉病变、周围血管病变以及高脂血症等。黄芪甲苷具有显著降低血糖、糖化血红蛋白和尿蛋白的作用，可降低肾皮质和血清中的ages，显示黄芪甲苷具有抗氧化作用，并对醛糖还原酶有抑制作用，还有抑制系膜细胞增生、减轻肾脏肥大的作用。针叶樱桃提取物，金虎尾科植物巴西针叶樱桃的果实提取物，含有维生素c、a、b1、b2、e、p、烟碱酸、抗衰老因子(sod)、钙、铁、锌、钾和蛋白质等多种营养物质，营养价值极高。其中维生素p能防止维生素c被氧化而受到破坏，是一种很好的抗氧化剂，具有很好的抗贫血、抗真菌、抗遗传毒性，还有很强的超氧阴离子自由基、羟自由基、dpph自由基清除能力。竹叶提取物，禾本科植物淡竹的叶的提取物，主要活性成分为竹叶黄酮，其具有类似sod和gsh-px的作用。竹叶黄酮类化合物的有效成分主要是黄酮糖苷和香豆素类内酯。具有机体免疫调节功能，能消除疲劳、消除体内过氧化物、保护肝脏、促进新陈代谢、增强生命活力，具有很好的抗氧化、抗菌和防腐功效。本申请发明人经过研究发现，黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物按质量比为2:1:1复配得到的冷冻保护剂能有效提高冷冻保护液对湖羊精液的冷冻保存效果，且所述冷冻保护剂在冷冻保存液中的浓度为0.1g/l取得的冷冻保存效果最好。优选地，所述的湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris30～35g/l、葡萄糖8～15g/l、棉子糖30～50g/l、麦芽油2～5％(v/v)、柠檬酸钠15～20g/l、甘油5～8％(v/v)、冷冻保护剂0.05～0.15g/l、青霉素80～100万iu/l和链霉素0.8～1g/l。优选地，所述的湖羊精液冷冻保存液中冷冻保护剂浓度为0.1g/l。本发明还提供了所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法，包括以下步骤：(1)按比例称取tris、葡萄糖、棉子糖、柠檬酸钠和冷冻保护剂，加入双蒸水中，充分溶解并混合均匀后，用0.2um滤膜过滤，然后加入青霉素和链霉素，混合均匀，得到溶液a；(2)按比例向溶液a中加入麦芽油，混合均匀，得到溶液b；(3)按比例向溶液b中加入甘油，混合均匀，即得所述湖羊精液冷冻保存液。本发明还提供了所述湖羊精液冷冻保存液在湖羊精液冷冻保存中的用途。本发明还提供了一种湖羊精液冷冻保存方法，包括以下步骤：(1)取湖羊新鲜精液，对精液活率进行评定，活率大于0.8才能用于冻存；(2)将所述湖羊精液冷冻保存液加入步骤(1)获得精液中，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置1～2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8～10min，最后投入液氮中进行保存。优选地，所述步骤(2)冻存管中精液的密度为6×108个/ml。相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的冷冻保存液可有效提高湖羊精液在保存过程中的存活率、活力和完整性，保存的精液解冻后仍然具有较好的授精能力，受胎效果稳定，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，应用前景广阔；(2)本申请发明人经过研究发现，黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物按质量比为2:1:1复配得到的冷冻保护剂能有效提高冷冻保护液对湖羊精液的冷冻保存效果，且所述冷冻保护剂在冷冻保存液中的浓度为0.1g/l时取得的冷冻保存效果最好。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris30g/l、葡萄糖10g/l、棉子糖40g/l、麦芽油3％(v/v)、柠檬酸钠18g/l、甘油5％(v/v)、冷冻保护剂0.1g/l、青霉素100万iu/l和链霉素1g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法包括以下步骤：(1)按比例称取tris、葡萄糖、棉子糖、柠檬酸钠和冷冻保护剂，加入双蒸水中，充分溶解并混合均匀后，用0.2um滤膜过滤，然后加入青霉素和链霉素，混合均匀，得到溶液a；(2)按比例向溶液a中加入麦芽油，混合均匀，得到溶液b；(3)按比例向溶液b中加入甘油，混合均匀，即得所述湖羊精液冷冻保存液。实施例2本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris33g/l、葡萄糖15g/l、棉子糖30g/l、麦芽油5％(v/v)、柠檬酸钠20g/l、甘油6％(v/v)、冷冻保护剂0.06g/l、青霉素100万iu/l和链霉素1g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法同实施例1。实施例3本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris35g/l、葡萄糖12g/l、棉子糖35g/l、麦芽油2％(v/v)、柠檬酸钠16g/l、甘油8％(v/v)、冷冻保护剂0.13g/l、青霉素80万iu/l和链霉素0.8g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法同实施例1。实施例4本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris30g/l、葡萄糖8g/l、棉子糖50g/l、麦芽油4％(v/v)、柠檬酸钠20g/l、甘油7％(v/v)、冷冻保护剂0.15g/l、青霉素80万iu/l和链霉素0.8g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法同实施例1。实施例5本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris35g/l、葡萄糖10g/l、棉子糖45g/l、麦芽油2％(v/v)、柠檬酸钠20g/l、甘油5％(v/v)、冷冻保护剂0.05g/l、青霉素100万iu/l和链霉素0.9g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法同实施例1。实施例6本发明湖羊精液冷冻保存液的一种实施例，所述湖羊精液冷冻保存液包含以下浓度的组分：tris32g/l、葡萄糖15g/l、棉子糖40g/l、麦芽油3.5％(v/v)、柠檬酸钠18g/l、甘油8％(v/v)、冷冻保护剂0.08g/l、青霉素100万iu/l和链霉素1g/l；所述冷冻保护剂包含黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物，且所述黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物的质量比为2:1:1。所述湖羊精液冷冻保存液的制备方法同实施例1。实施例7冷冻保存液保存效果用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求即进行冷冻保存，保存方法如下：将实施例1～6所述湖羊精液冷冻保存液加入采集到的精液中，使精液的密度为6×108个/ml，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置10min，最后投入液氮中进行保存。解冻和检测：将上述冻存的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行质量指标检测。结果如表1所示：表1质量指标检测结果组别活率活力顶体完整率实施例172.3％58.1％75.8％实施例265.5％55.2％72.3％实施例366.1％54.3％73.1％实施例464.8％56.1％72.6％实施例567.9％55.8％71.4％实施例666.2％56.9％71.9％上述结果表明，本发明实施例1～6上述冷冻保存液对湖羊精液具有很好的保存效果，解冻后精子的活率、活力和顶体完整率均保持在较高的水平，提高了冻精品质。实施例8本发明所述冷冻保存液包含由黄芪提取物、针叶樱桃提取物和竹叶提取物按质量比为2:1:1复配得到的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含多种抗氧化成分，能有效提高湖羊精液冷冻保存效果。设计实验组1和2，实验组1使用实施例1所述冷冻保存液进行湖羊精液保存，实验组2中使用的冷冻保存液除了不包含冷冻保护剂外，其他组分与实施例1完全相同。用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求即进行冷冻保存，保存方法如下：将实验组1和2所述湖羊精液冷冻保存液加入采集到的精液中，使精液的密度为6×108个/ml，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置1.5h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8min，最后投入液氮中进行保存。解冻和检测：将上述冻存的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行质量指标检测。结果如表2所示：表2质量指标检测结果组别活率活力顶体完整率实验组171.8％58.6％74.9％实验组250.2％35.1％48.7％上述结果表明，包含冷冻保护剂的实验组1所述冷冻保存液对湖羊精液的保存效果显著优于不含冷冻保护剂的实验组2所述冷冻保存液，实验组1所述冷冻保存液保存的湖羊精液在解冻后精子活率、活力和顶体完整率明显高于实验组2，说明冷冻保护剂能有效提高冷冻保存液对湖羊精液的冷冻保存效果。实施例9本发明所述冷冻保存液中冷冻保护剂的浓度为0.05～0.15g/l，本实施例研究冷冻保护剂浓度对冷冻保存液保存效果的影响。设计实验组3～9，各实验组所述冷冻保存液除了冷冻保护剂的浓度不同外其他组分均相同，具体如表3所示：表3冷冻保存液中冷冻保护剂的浓度设计用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求即进行冷冻保存，保存方法如下：将实验组3～9所述湖羊精液冷冻保存液加入采集到的精液中，使精液的密度为6×108个/ml，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置1h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置10min，最后投入液氮中进行保存。解冻和检测：将上述冻存的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行质量指标检测。结果如表4所示：表4质量指标检测结果组别活率活力顶体完整率实验组361.7％49.1％65.9％实验组466.7％54.4％71.5％实验组565.2％55.3％72.0％实验组671.9％58.3％74.3％实验组767.4％53.8％71.7％实验组866.1％54.7％71.2％实验组960.3％50.3％66.5％上述结果表明，当所述冷冻保存液中冷冻保护剂的浓度为0.05～0.15g/l(实验组4～8)时，冷冻保存液对湖羊精液的冷冻保存效果更好，尤其是当冷冻保护剂的浓度为0.1g/l(实验组6)时，解冻后精液质量指标效果最优；当冷冻保护剂的浓度低于0.05g/l(实验组3)或高于0.15g/l(实验组9)时会影响冷冻保存液的保存效果，使保存质量下降。实施例10本实施例以实施例1所述冷冻保存液保存的湖羊精液为例，研究使用本发明所述冷冻保存液保存的湖羊精液解冻后的授精效果。用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求即进行冷冻保存，保存方法如下：将实施例1所述湖羊精液冷冻保存液加入采集到的精液中，使精液的密度为6×108个/ml，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置10min，最后投入液氮中进行保存。解冻：将上述冻存的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行人工授精。经检测，上述解冻后的湖羊精液具有授精能力的时间高达26h，使发情期湖羊母羊受胎率高达85％。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12