本发明涉及辅助生殖
技术领域：
，具体是一种冷冻保护剂及其应用和一种精子冷冻液及其制备方法。
背景技术：
：体外受精(invitrofertilization，ivf)，又称试管婴儿，是一种辅助生殖治疗的方法，具体是指分别将卵子与精子从体内取出后，在体外特定的环境条件下使精子与卵子结合受精形成受精卵，待受精卵在体外连续培养发育至囊胚期胚胎后再将胚胎移植回母体子宫内妊娠发育成胎儿。在体外受精辅助生殖技术中，男性基于未来优生优育计划的考虑，可将自身精子冷冻于具有相应资质的医疗机构中，以防未来生育风险；各大精子库和辅助生殖医疗机构需要将经检验合格的精子进行冷冻保存用作体外受精辅助生殖需要。同时，一些严重的少精弱精症患者，为了防止日后发展成无精症以致彻底丧失生育能力，也可以预先在治疗少精症的过程中将精子进行冷冻长期保存，在后期需要时用于辅助生殖技术治疗不孕不育，由此顺利实现生育下一代的目的。目前，市面上现有的精子冷冻液主要分为两大类，分别是含卵黄和不含卵黄的，但其均存在一些缺点：一方面，由于卵黄中除含有卵磷脂外，还包括很多复杂成分，利用含卵黄的精子冷冻液进行精子冷冻复苏后会出现颗粒状物质，影响进一步的处理过程，同时因卵黄属于异种源物质，还存在一定的生物风险；另一方面，不含卵黄的精子冷冻液因仅含有基础盐离子、少量氨基酸和单一的精子冷冻保护剂等，对精子的冷冻保护作用有限，存在很大的提升空间。因此，我们亟需一种无杂质、具有生物安全性和功能多样性的精子冷冻液。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种精子冷冻液及其制备方法，以达到降低精子在低温冷冻和冷冻复苏过程中的损伤、提高精子冷冻复苏后活力、延长精子冷冻复苏后存活时间、促进精子获能以及增强精子对卵细胞的穿透受精能力，进而提高卵子的受精成功率和囊胚形成率的效果。本发明的另一目的在于克服现有技术的不足，提供一种冷冻保护剂及其应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种冷冻保护剂，包括紫杉醇、海藻糖、蔗糖和甘油。一种冷冻保护剂的应用，是将所述冷冻保护剂用于生殖细胞的冷冻保护，优选为精子的冷冻保护。一种精子冷冻液，包括基础培养液、冷冻保护剂和组合物，所述冷冻保护剂包括紫杉醇、海藻糖、蔗糖和甘油，所述组合物包括白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂、胆固醇、atp钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸和辅酶q10。所述紫杉醇作为具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。同时，紫杉醇还能作为一种细胞骨架稳定剂，增强α、β-微管蛋白二聚体的紧密联系，增强微管交联，促进微管聚合和稳定，对细胞超微骨架结构微管的结合具有依赖性和可逆性。通过上述技术方案，利用所述紫杉醇的特异性结合方式来降低精子细胞内部微管骨架的解聚，从而对精子细胞的骨架结构、细胞器的定位和功能起着重要的稳定保护作用。所述海藻糖，是一种安全、可靠的天然糖类，是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖。在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，海藻糖在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而对生物体及多种生物活性物质具有重要保护作用。所述白藜芦醇(3-4'-5-trihydroxystilbene)是一种非黄酮类多酚化合物，其化学名称为3,4'，5-三羟基-1,2-二苯基乙烯(3,4',5-芪三酚)。体外实验及动物实验表明，白藜芦醇有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗喘、免疫调节及心血管保护等作用。通过上述技术方案，将所述白藜芦醇用于精子冷冻液中，能够利用其抗氧化作用，去除溶液中的活性氧自由基，达到了减少活性氧自由基对精子细胞产生的氧化损伤的效果。所述还原型谷胱甘肽能参与细胞内部氧化还原过程，清除精子运动过程中产生的活性氧自由基，达到了降低活性氧自由基对精子的氧化损伤的效果。所述卵磷脂具有抗氧化作用，其分子内部的不饱和键通过与活性氧自由基结合来除去精子运动过程中产生的活性氧自由基，保护并修复精子细胞免受氧化损伤，达到提高精子活力的效果；并且，所述卵磷脂还能稳定精子的细胞膜骨架结构，达到防止顶体膜破裂和抵抗“低温休克”的效果。所述肝素可以通过结合精子表面的受体，冷冻受体偶联的信号传导通路，温和有效地提升精子细胞内线粒体的产能功能和促进钙离子内流，从而诱发顶体反应，达到了改善精子的受精活力的效果。所述atp钠盐不仅可以为精子直接提供运动所需的能量物质，还可以有助于精子细胞中段部位中线粒体产能。所述磷脂酰丝氨酸作为普遍存在的磷脂，位于细胞膜内层，是细胞膜结构组分之一，有助于细胞膜冷冻防护及冷冻损伤快速修复。所述辅酶q10具有抗氧化，清除自由基的功能，人类细胞制造能量必须有辅酶q10参与，以驱动人体细胞产生能量；辅酶q10能加速细胞更新、激发细胞活性和维持线粒体形态结构，从而达到了显著促进细胞摄取营养物质的能力的效果。进一步的，所述基础培养液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括水，优选为超纯水；所述溶质包括氯化钠5～12g/l、氯化钾311～433mg/l、氯化钙110～230mg/l、硫酸镁22～36mg/l、磷酸二氢钾46～55mg/l、碳酸氢钠322～396mg/l、葡萄糖0.51～2.34g/l、氨基酸或其盐46～88mg/l、丙氨酰谷氨酰胺204～247mg/l、乳酸钠2.31～2.46mg/l、丙酮酸钠34.1～38.9mg/l、牛磺酸9.82～12.36mg/l、hepes1.8～2.9g/l和mops1.6～2.7g/l。通过上述技术方案，所述超纯水无内毒素和重金属，适用于作为溶剂。所述牛磺酸作为含硫的非蛋白类氨基酸，在体内以游离状态存在，属于自由氨基酸，不参与体内蛋白的生物合成，可调节细胞与溶液间的渗透压，并与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关；同时，所述牛磺酸还可与胰岛素受体蛋白相互作用，促进细胞摄取和利用葡萄糖，并加速糖酵解；另外，其还具有维持精子正常的受精功能的作用。添加所述hepes，达到了有效缓冲溶液ph、支持受精和胚胎发育的效果；添加所述mops，达到了维持所述基础培养液的ph稳定、延长溶液放置时间并降低溶液生产成本的效果。进一步的，所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸；所述必需氨基酸或其盐包括l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸、l-苯丙氨酸、l-色氨酸、l-蛋氨酸、l-赖氨酸和l-苏氨酸中的至少一种；所述非必需氨基酸或其盐包括甘氨酸、l-丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-酪氨酸、l-半胱氨酸、l-天冬酰胺、l-谷氨酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-精氨酸和l-组氨酸中的至少一种。通过上述技术方案，所述必需氨基酸和非必需氨基酸为细胞提供了合成蛋白质和核酸所需的基础物质，进而提供细胞所需的多种能量和氮源，参与细胞信号转导途径，维持细胞内环境稳定，调节溶液的渗透压平衡、酸碱平衡，螯合重金属，达到了为细胞提供综合性保护作用的效果。进一步的，所述冷冻保护剂中各组分的含量如下：紫杉醇0.3～1.1mg/l、海藻糖16～22g/l、蔗糖7～13g/l和甘油80～250ml/l；所述组合物中各组分的含量如下：白藜芦醇12～26mg/l、还原型谷胱甘肽0.2～1.9mg/l、卵磷脂436～775mg/l、胆固醇0.5～1.6mg/l、atp钠盐9～17mg/l、肝素11～28mg/l、磷脂酰丝氨酸93～299mg/l和辅酶q105～24mg/l。进一步的，所述精子冷冻液还包括人血白蛋白5～15g/l和硫酸庆大霉素7～14mg/l。通过上述技术方案，所述人血白蛋白可螯合重金属，达到了避免精子激活液中重金属对精子产生毒性影响的效果；所述硫酸庆大霉素作为一种光谱抗生素，达到了有效抑制细菌生长，从而避免所述精子冷冻液出现细菌污染的效果。一种精子冷冻液的制备方法，包括以下步骤：s1.在百级条件下，按配比称量所述还原型谷胱甘肽、atp钠盐、肝素、海藻糖、蔗糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、氨基酸、丙氨酰谷氨酰胺、乳酸钠、丙酮酸钠、牛磺酸、hepes和mops，并加入水中混合均匀，得到溶液i；s2.按配比称量所述白藜芦醇、辅酶q10、紫杉醇和胆固醇，并加入乙醇中混合均匀，得到溶液ⅱ；s3.按配比称量所述卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油，混合均匀，得到溶液ⅲ；s4.将所述溶液ⅱ搅拌滴加至溶液ⅲ中，得到溶液ⅳ；s5.按配比称量所述碳酸氢钠、人血白蛋白和硫酸庆大霉素；s6.取所述溶液ⅳ、碳酸氢钠、人血白蛋白、硫酸庆大霉素与溶液i混合均匀，得到溶液ⅴ；s7.将溶液ⅴ与ph调节剂混合，得到ph＝7.10～7.20的溶液ⅵ；s8.所述溶液ⅵ经无菌过滤处理后，得到所述精子冷冻液。进一步的，s1～s7中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。通过上述技术方案，对所述环境温度和环境湿度进行限定，达到了有效保证溶液配制过程的顺利进行以及降低溶液生产过程中环境变化差异所带来的风险的效果。进一步的，s2中，所述乙醇为无水乙醇，所述溶液ⅱ中白藜芦醇的浓度为12～26g/l，辅酶q10的浓度为5～24g/l，紫杉醇的浓度为0.3～1.1g/l，胆固醇的浓度为0.5～1.6g/l。通过上述技术方案，由于所述无水乙醇对细胞有毒性作用，对溶液ⅱ中白藜芦醇、辅酶q10、紫杉醇和胆固醇的浓度进行限定，进一步限定了溶液ⅱ中无水乙醇的量，达到了充分溶解组分的同时，保证生物安全性的效果。进一步的，s7中，所述ph调节剂为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/l。进一步的，s8中，所述无菌过滤处理具体为：使用孔径为0.22μm或0.45μm的滤膜对所述溶液ⅵ进行过滤。进一步的，所述滤膜的孔径优选为0.22μm，以达到更好的除菌效果。由于所述紫杉醇、卵磷脂、辅酶q10、胆固醇等在高温、高压、紫外或普通光长期照射条件下容易变性产生过氧化物，对精子细胞造成氧化损伤；所述基础培养液中所含的钙离子、镁离子经高温高压灭菌后容易析出形成难溶性沉淀；同时，在高温高压灭菌过程中，细菌细胞壁裂解，释放内毒素，而内毒素含量过高会对精子细胞造成一定的毒性作用，并进一步影响后续的受精过程。通过上述技术方案，选用无菌过滤处理，能够在达到除菌效果的同时，避免上述情况的发生。本发明的有益效果是：1.本发明的一种精子冷冻液，通过将各组分同时添加于所述精子冷冻液中，能够主动激发精子能量代谢通路促进精子获能，保护精子免受氧化损伤，从而提高精子复苏后的活力以及延长存活时间，并且促进受精作用的发生，进而提高卵子的受精成功率和受精卵发育成可用胚胎的囊胚形成率，最终提高体外受精辅助生殖技术的妊娠成功率，达到了大大提高精子冷冻液的功能多样性的效果。2.本发明的一种精子冷冻液，无生物风险，并且能够对精子细胞结构起冷冻保护作用，防止冷冻形成的冰晶等对精子细胞结构造成的破坏性损伤，进而保护精子的胞膜、线粒体、顶体及dna等超微结构的完整。3.本发明的一种精子冷冻液，有效适用于体外受精辅助生殖技术中的精子低温冷冻保存。具体实施方式下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。采用本发明的精子冷冻液，实施以下3组实施例。1.实施例1～3中精子冷冻液的组分及其含量(溶剂为超纯水和乙醇)，如下表所示：2.实施例1～3中精子冷冻液的制备方法，包括以下步骤：s1.在百级条件下，按配比称量还原型谷胱甘肽、atp钠盐、肝素、海藻糖、蔗糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、氨基酸、丙氨酰谷氨酰胺、乳酸钠、丙酮酸钠、牛磺酸、hepes和mops，并加入水中混合均匀，得到溶液i；s2.按配比称量白藜芦醇、辅酶q10、紫杉醇和胆固醇，并加入乙醇中混合均匀，得到溶液ⅱ；其中，溶液ⅱ中白藜芦醇、辅酶q10、紫杉醇和胆固醇的浓度为最终浓度的1000倍；s3.按配比称量卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油，并混合均匀，得到溶液ⅲ；s4.将溶液ⅱ搅拌滴加至溶液ⅲ中，得到溶液ⅳ；s5.按配比称量碳酸氢钠、人血白蛋白和硫酸庆大霉素；s6.取溶液ⅳ、碳酸氢钠、人血白蛋白、硫酸庆大霉素与溶液i混合均匀，得到溶液ⅴ；s7.将溶液ⅴ与浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液混合，得到ph＝7.10～7.20的溶液ⅵ；s8.使用孔径为0.22μm的滤膜对溶液ⅵ进行过滤，得到精子冷冻液；其中，s1～s7中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。对照例1采用本发明实施例1中的精子冷冻液与对照例1进行对比，对照例1中的组合物为：卵磷脂、胆固醇、atp钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸和辅酶q10，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加白藜芦醇和还原型谷胱甘肽，用于证明本发明的精子冷冻液效果更好)。对照例2采用本发明实施例1中的精子冷冻液与对照例2进行对比，对照例2中的组合物为：白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂、胆固醇和磷脂酰丝氨酸，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加atp钠盐、肝素和辅酶q10，用于证明本发明的精子冷冻液效果更好)。对照例3采用本发明实施例1中的精子冷冻液与对照例3进行对比，对照例3中的组合物为：白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、胆固醇、atp钠盐、肝素和辅酶q10，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和胆固醇，用于证明本发明的精子冷冻液效果更好)。对照例4采用本发明实施例1中的精子冷冻液与对照例4进行对比，对照例4中的冷冻保护剂为：甘油和蔗糖，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，冷冻保护剂中不添加海藻糖和紫杉醇，用于证明本发明的精子冷冻液效果更好)。试验效果1.为了验证本发明的精子冷冻液的效果，对实施例1～3以及对照例1～4所得的精子冷冻液进行了检测，检测项目包括ph值、渗透压、细菌内毒素，检测方法如下：-ph值检测：取一定量成品用血气分析仪进行检测，记录三次的检测值并取平均值作为精子冷冻液的最终ph值，在7.20～7.40范围内为合格；-渗透压检测：取适量精子冷冻液，用注射用水稀释10倍，取25μl稀释后的液体滴入0.5mlep管，放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值；同样方法检测三遍取平均值，即可得到该精子冷冻液的渗透压，在299～348mosm范围内为合格；-细菌内毒素检测：采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判定为<0.2eu/ml合格；结果如下表所示：组别ph渗透压mosm细菌内毒素实施例17.31331<0.005实施例27.26314<0.005实施例37.37346<0.005对照例17.25328<0.005对照例27.27326<0.005对照例37.34329<0.005对照例47.30319<0.005由上表可知，实施例1～3和对照例1～4所得精子冷冻液的ph、渗透压和细菌内毒素数值接近且均为合格。2.为了验证本发明的精子冷冻液对受精和囊胚形成的影响，对实施例1～3以及对照例1～4中的精子冷冻液进行了体外鼠胚试验，方法包括以下步骤：a1.超数排卵/取卵：选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射pmsg10iu/只；48h后，经腹腔注射hcg10iu/只；14h后，对小鼠输卵管壶腹部进行输卵管冲洗，取出成熟的卵子并置于事先平衡过夜的培养液中，剔除异常卵子，得到正常卵子；a2.小鼠取精/精子冷冻/精子复苏，包括以下步骤：a21.通过手术从雄鼠附睾及输精管直接取精，将精子通过上游法得到高活力的精子浓缩液，与事先室温平衡过的精子冷冻液混合(精子浓缩液与精子冷冻液的比例为3:1)，得到混合液；并将混合液转移至冻存管中，直接放入液氮冷冻一定时间；a22.将冷冻后的冻存管取出于37℃水浴中快速解冻复苏，加入事先平衡过的洗精受精液(37℃，6％co2)进行清洗和离心，得到复苏后的精子；a3.体外受精/囊胚培养：将密度为5～10×106/ml的80μl精子与100枚成熟的卵子共培养于400μl的洗精受精液微滴中6～8h，完成受精工作；利用胚胎培养液清洗两次受精卵后，将受精卵清洗转移到事先平衡的新的胚胎培养液微滴中，于37℃、6％co2、5％o2以及饱和湿度的培养箱中培养至96h囊胚期，对胚胎发育情况进行形态观察分析，得出囊胚形成率。结果如下表所示(三组重复实验)：由上表可知，实施例1的囊胚形成率高达88％，而相比于实施例1，对照例1～4中的囊胚形成率显著降低。因此，本发明的精子冷冻液在冷冻精子的过程中，组分白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂、胆固醇、atp钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸、辅酶q10、紫杉醇、海藻糖之间相辅相成，任何一种或多种组分的缺失都会直接影响囊胚形成率，导致囊胚形成率的显著降低。由此可知，白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂、胆固醇、atp钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸、辅酶q10、紫杉醇、海藻糖对冷冻精子复苏后再进行受精的囊胚形成率有明显的提高作用。综上所述，本发明的一种精子冷冻液能够降低精子在低温冷冻和冷冻复苏过程中的损伤、提高精子冷冻复苏后活力、延长精子冷冻复苏后存活时间、促进精子获能以及增强精子对卵细胞的穿透受精能力，进而提高卵子的受精成功率和囊胚形成率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。当前第1页12