本发明属于贝类遗传育种和人工繁殖技术领域，具体涉及一种快速无伤鉴别三角帆蚌卵子成熟度的方法。
背景技术：
三角帆蚌属于软体动物门，双壳纲，真瓣鳃目，蚌科，是我国特有的淡水育种品种之一，主要分布在河北、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北和湖南等地的湖泊及河流内。早在上世纪70年代末，我国就已经初步掌握了三角帆蚌人工繁育技术。目前在生产上，通常采用大型池塘对三角帆蚌雌雄亲本按一定比例进行吊养，让其自然受精，然后从中挑选外鳃丝怀有成熟钩介幼虫的雌蚌进行人工采苗获得稚蚌。但是由于雌雄亲蚌的性腺发育存在不同步性，在实际操作过程中需要从大量亲本中多次挑选才能获得成熟雌蚌，工作量较大且效率较低。
在贝类的人工繁育中，配子的质量直接关系到子代的存活率。在繁殖期内，自然排放的精子只要处于运动状态一般都是处于成熟状态，具有授精能力。因此，卵子的成熟度就成为了决定合子质量的关键因素。但是，三角帆蚌的卵子是分批成熟和分批排放，在雌性三角帆蚌的卵巢内存在不同成熟度的卵子，且卵子成熟与否在三角帆蚌的外观上几乎无显著的表型差异，所以很难直接判断一只三角帆蚌亲蚌性腺内卵子是否成熟。由于目前缺乏三角帆蚌卵子成熟度的鉴定方法，导致三角帆蚌人工繁育的效率较低，而且多倍体育种、雌核发育等现代生物育种技术的研发和应用需要更加精准，掌握配子成熟度和控制受精时间。因此，开发一种几乎无损伤快速鉴别三角帆蚌亲蚌卵子成熟度的方法对提升三角帆蚌人工繁育的效率和进一步进行三角帆蚌生物学研究的操作具有重要实践意义，对三角帆蚌的种质资源保护和遗传育种的研究具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决当前三角帆蚌卵子成熟度的鉴别问题，本发明的目的在于提供一种快速无伤鉴别三角帆蚌卵子成熟度的方法，为三角帆蚌卵子成熟度提供鉴别标准，可提高雌雄三角帆蚌受精的同步性和人工繁育的工作效率。
本发明的快速无伤鉴别三角帆蚌卵子成熟度的方法，包括以下步骤：
(1)初步筛选性腺成熟的雌性三角帆蚌：通过年轮挑选出三龄及以上的三角帆蚌，用开壳器将双壳撑开0.7～0.8cm的间隙，检查内外鳃的鳃丝间距和数量筛选得到雌性三角帆蚌，并挑选出性腺饱满的雌性三角帆蚌进行标记；
(2)卵液采集和稀释：通过注射器从上述标记的雌性三角帆蚌性腺表层组织中吸取卵液，用稀释液稀释至1ml，得到卵子稀释液；
(3)鉴别卵子成熟度：将上述卵子稀释液置于光学显微镜下观察其包含形态、大小和圆度的情况，其中成熟卵子同时满足以下条件：①卵子为近圆形；②卵径大；③卵膜外有厚度均匀的胶质膜；④卵膜内卵黄颗粒均匀分布，且在光学显微镜下整体呈深褐色；
未满足上述①～④任一条件的为未成熟卵子。
根据本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述雌性三角帆蚌的外鳃鳃丝间距密，且鳃丝数量为90～110根，优选接近100根。
根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中，所述注射器选用国家标准规定的6号针头，针头内径为0.34mm，可保证对三角帆蚌造成较小损伤的情况下吸取完整卵细胞。
根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中，所述稀释液为质量浓度0.4％～0.5％的生理盐水，该稀释液浓度与淡水贝类渗透压一致，避免卵子被稀释时产生吸水膨胀造成卵细胞破裂。
根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中，所述成熟卵子为近圆形，且其圆度的直径差百分比x≤20％；其中，x＝[(dmax－dmin)/d]×100，dmax为最大直径，dmin为最小直径，d＝(dmax+dmin)/2。
根据本发明的一些实施方式，所述成熟卵子的卵径≥150μm。
根据本发明的一些实施方式，所述胶质膜为50～100μm，且可将卵子包裹。
根据本发明的一些实施方式，所述成熟卵子的卵膜内卵黄颗粒分布均匀，且在光学显微镜下整体呈深褐色，参照劳尔比色卡标准颜色接近ral8022(blackbrown)。
根据本发明的一些实施方式，所述未成熟卵子的卵膜内卵黄颗粒分布不均匀，且在光学显微镜下整体呈浅黄色，参照劳尔比色卡标准颜色接近ral1001(beige)，同时存在若干白色空泡。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的方法能够快速无伤地鉴别三角帆蚌亲蚌的卵子成熟度，为三角帆蚌全人工繁育提供优质的配子来源，提高雌雄三角帆蚌受精的同步性和人工繁育的工作效率，同时也为三角帆蚌的种质资源保护和遗传育种提供可靠的技术支持。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好理解发明并用以实施，但所述实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
2019年4月，从浙江武义养殖基地选取通过年轮挑选出的三龄及以上的三角帆蚌若干，打开蚌壳通过检查内外鳃的鳃丝间距和数量筛选出雌性三角帆蚌，然后观察挑选出性腺饱满的3只雌蚌并进行标记。
用开壳器微微打开蚌壳，用带0.34mm内径针头注射器通过酒精灯消毒灭菌后进入表层性腺组织吸取卵液100μl，在进入性腺组织时需要注意不能进入过深导致穿刺肾脏或其它重要器官，吸取的卵液保存在1ml离心管中并用质量浓度为0.4％～0.5％的生理盐水稀释至1ml。
将得到的卵子稀释液滴注在载玻片上，置于光学显微镜下观察其形态、大小和圆度。观察得出约有90％以上卵子的卵径≥150μm，卵子外围有一层厚度约为50μm胶质膜，卵子直径差百分比≤20％，卵黄物质在光镜下整体呈现深褐色(参照劳尔比色卡标准颜色接近ral8022(blackbrown))，说明达到成熟卵子的标准。
鉴别后，将亲蚌放置在有雄蚌的池塘中使其自然授精，在外鳃育儿囊中得到受精卵，表明该三角帆蚌卵子的成熟度较高，可用于人工繁育，进一步证实本发明的鉴别标准有效。
实施例2
2019年5月，从上海海洋大学滨海养殖基地选取通过年轮挑选出的三龄及以上的三角帆蚌若干，打开蚌壳通过检查内外鳃的鳃丝间距和数量筛选出雌性三角帆蚌，然后观察挑选出性腺饱满的3只雌蚌并进行标记。
用开壳器微微打开蚌壳，用带0.34mm内径针头注射器通过酒精灯消毒灭菌后进入表层性腺组织吸取卵液150μl，在进入性腺组织时需要注意不能进入过深导致穿刺肾脏或其它重要器官，吸取的卵液保存在1ml离心管中并用质量浓度为0.4％～0.5％的生理盐水稀释至1ml。
将得到的卵子稀释液滴注在载玻片上，置于光学显微镜下观察其形态、大小和圆度。观察得出约有95％以上卵子的卵径≥150μm，卵子外围有一层厚度约为60μm胶质膜，卵子直径差百分比≤20％，卵黄物质在光镜下整体呈现深褐色(参照劳尔比色卡标准颜色接近ral8022(blackbrown))，说明达到成熟卵子的标准。
鉴别后，将亲蚌放置在有雄蚌的池塘中使其自然授精，在外鳃育儿囊中得到了受精卵，表明该三角帆蚌卵子的成熟度较高，可用于人工繁育。
实施例3
2019年6月，从上海海洋大学崇明基地选取通过年轮挑选出的三龄及以上的三角帆蚌若干，打开蚌壳通过检查内外鳃的鳃丝间距和数量筛选出雌性三角帆蚌，然后观察挑选出性腺饱满的3只雌蚌并进行标记。
用开壳器微微打开蚌壳，用带0.34mm内径针头注射器通过酒精灯消毒灭菌后进入表层性腺组织吸取卵液100～200μl，在进入性腺组织时需要注意不能进入过深导致穿刺肾脏或其它重要器官，吸取的卵液保存在1ml离心管中并用质量浓度为0.4％～0.5％的生理盐水稀释至1ml。
将得到的卵子稀释液滴注在载玻片上，置于光学显微镜下观察其形态、大小和圆度。观察得出约有80％以上的卵子的卵径≥150μm，卵子外围有一层厚度约为60μm胶质膜，卵子直径差百分比≤20％，卵黄物质在光镜下整体呈现深褐色(参照劳尔比色卡标准颜色接近ral8022(blackbrown))，说明达到成熟卵子的标准。
鉴别后，将亲蚌放置在有雄蚌的池塘中使其自然授精，在外鳃育儿囊中得到了受精卵，表明该三角帆蚌卵子的成熟度较高，可用于人工繁育。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。