一种采前低硫处理预防果实灰霉病的方法与流程

本发明涉及农业栽培科技领域，尤其涉及一种采前低硫处理预防果实灰霉病的方法。

背景技术：

灰霉菌(botrytiscinerea)可以侵染200多种植物，如草莓、番茄和葡萄等果实，在全球10大真菌病害中排名第二，对园艺作物影响之广泛，在果实的采前和采后阶段都造成巨大经济损失。灰霉菌是一种典型的致死型病原菌，它侵入宿主体内后通过引发宿主细胞程序性死亡，被灰霉菌侵染的果实出现明显的腐烂。灰霉菌对双子叶植物寄主成熟或衰老组织的破坏性最大。当宿主的生理发生变化且环境不利于灰霉菌萌发生长时，这种真菌在腐烂组织之前可以保持相当长时间的静止。因此，农作物从苗期到产品成熟，灰霉菌的侵染都有可能发生，在收获看似健康的作物后，在采后贮藏阶段仍然可能会发生严重腐败损害。采收后的果实在零售链中，包括储存、运输到遥远的市场或在零售商展示期间都会爆发灰霉病。

由于寄主范围广，灰霉病侵染各类果实所产生的产业损失很难全面地计算，目前还没有可靠的数据显示灰霉菌在作物栽培过程中的危害，但其中的经济损失一定是巨大的。在防治灰霉病的措施中，尽管生物防治在某些作物上的应用越来越有效(参考文献：moser，r.″farmers′attitudestowardtheuseofbiocontrolagentsinipmstrawberryproductioninthreecountries.″biologicalcontrol.2008.47(2)：125～132.)，使用杀菌剂仍然是控制灰霉菌的最常用方法。目前采用化学药剂控制灰霉病在全球的平均成本约为40欧元/公顷。

元素硫是生命所必需的，存在于多种生物分子中，包括氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸、氧化还原调节剂谷胱甘肽、甲基化供体s～腺苷蛋氨酸和辅助因子生物素、辅酶a、脂肪酸和硫胺素。因此，所有有机体都必须从其环境中获取硫，以实现适当的细胞功能。在农作物培养当中，s是作为必须的营养元素，是植物体内氨基酸、蛋白质、酶和辅酶、以及一些生理活性物质的重要组成成分，但相比于n、p、k，植物对s的需求量是较少的。以番茄为例，以生产鲜果75000kg/hm²计算，每公顷大约需要n225kg、p2o575kg、k2o390kg、s52.5kg。然而，果实作物在栽培过程中，如番茄和草莓的栽培中，硫酸铵、硫酸钾为常用肥料，为作物提供必须的n源和k源，与此同时也带入大量的硫酸根。此外，在草莓种植中，硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁等被广泛应用到草莓影响培养液中。因此，在一般的栽培过程中硫酸根的施加基本都为过量施加，有大量的硫酸根进入到土壤中。果实在种植过程中势必会从土壤及肥料当中吸收硫酸根等离子，贮藏在果实当中，施加的硫肥量也直接影响果实中硫酸根离子的积累。

真菌以其代谢多样性而闻名，无论是复杂有机基质的降解还是复杂次生代谢产物的生物合成，硫也是真菌生长发育的必要的，其获得硫的途径有两种，一个是含硫氨基酸包括蛋氨酸和半胱氨酸直接转运和利用，另一个重要的途径是对无机硫(如硫酸盐、亚硫酸盐和硫化物)的同化(参考文献：marzlufga.moleculargeneticsofsulfurassimilationinfilamentousfungiandyeast.annurevmicrobiol.1997.51：73-96)。然而，目前并没有报道阐明灰霉菌在侵染园艺作物时，果实组织中的硫含量会影响灰霉菌的定植和侵染程度，灰霉菌是否会利用果实当中的硫用于自身侵染过程还未被研究。

技术实现要素：

本发明提供了一种采前低硫处理预防果实灰霉病的方法，该方法通过在果实的种植过程中控制含硫肥料的施加，降低果实中硫的含量，从而降低果实对灰霉菌的易感染程度，减少果实的灰霉病的发病率。

具体技术方案如下：

一种采前低硫处理预防果实灰霉病的方法，包括：

在果实作物的种植期间，降低含硫肥料的施加量以预防果实灰霉病；

含硫肥料的施加量以硫酸根的施加量计，在果实作物种植期间，含硫肥料的施加量为0～100kg/hm²；表层土壤中硫酸根的含量为5～100mg/kg。

本发明通过控制硫酸铵、硫酸钾等含有硫酸根的肥料的施加量，采用尿素、氯化钾等不含硫的肥料来作为替代提供作物所需的n源和k源，降低果实中硫的含量，从而降低果实对灰霉菌的易感染程度，减少果实的灰霉病的发病率。

优选的，替换前后，所施加的肥料中总的n源、k源的质量数相同。

所述的果实作物为番茄或草莓。

针对草莓果实，当土壤中硫含量过低会导致草莓植株根部发黑现象，同时还会造成由于草莓果实中含硫量不足从而影响草莓果实含硫蛋白的合成；当土壤中硫含量过高时会导致土壤酸化与草莓植株的根系腐烂，同时还会造成草莓果实中含硫量过高，进而使得草莓容易受到灰霉菌的感染。在现有栽培技术中，硫肥的施加量(以硫酸根的施加量计)为2.5～6.6kg/hm²。本发明中优选的，含硫肥料的施加量以硫酸根的施加量计，含硫肥料的施加量为0～2kg/hm²；表层土壤中硫酸根的含量控制在5～35mg/kg。

为了降低灰霉菌对于草莓的感染，同时保证草莓果实含硫蛋白的合成，进一步优选的，含硫肥料的施加量以硫酸根的施加量计，含硫肥料的施加量为0～1.8kg/hm²；表层土壤中硫酸根的含量为5～15mg/kg。

针对番茄果实，当土壤硫含量过低时会造成番茄果实含硫量降低，使得番茄果实总干物质重量、可滴定酸、抗坏血酸含量以及含钾量等品质指标降低；当土壤硫含量过高时，会使番茄果实在采收后在长期储藏中容易发生番茄果实霉烂。在现有的栽培技术中，硫肥的施加量(以硫酸根的施加量计)约为83～497kg/hm²。本发明中优选的，含硫肥料的施加量以硫酸根的施加量计，含硫肥料的施加量为20～100kg/hm²；表层土壤中硫酸根的含量为10～100mg/kg。

为了番茄果实的正常生长，同时确保番茄果实在采收后不易发生霉变腐烂，进一步优选的，含硫肥料的施加量以硫酸根的施加量计，含硫肥料的施加量为20～70kg/hm²；表层土壤中硫酸根的含量为20～30mg/kg。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中选取易被灰霉菌侵染的果实，采用番茄作为呼吸跃变型果实的代表；草莓作为非呼吸跃变型果实代表，通过改变草莓或番茄种植过程中含硫肥料的施加，降低了成熟果实中硫含量，明显降低了果实灰霉病的发病情况；

(2)本发明的方法首次提出果实中硫含量与果实灰霉菌易感染程度的关系，通过控制成熟果实中硫的含量可以降低灰霉菌的侵染，对易感染灰霉菌果实的栽培具有重要意义，本发明所提供的低硫肥栽培方式具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为对比例1、实施例1以及实施例2中肥料施加组合下草莓田土壤中硫的含量图；

图2为对比例1、实施例1以及实施例2中肥料施加组合下草莓田中种植的草莓果实中硫的含量图；

图3为对比例2、实施例3中肥料施加组合下番茄田土壤中硫的含量图；

图4为对比例2、实施例3中肥料施加组合下番茄田中种植的番茄果实中硫的含量图；

图5为番茄和草莓果实经过采后浸泡后硫酸根含量统计图；其中，a图为番茄果实中硫酸根含量统计图；b图为草莓果实中硫酸根含量统计图；

图6为不同溶液浸泡后草莓果实灰霉病发病情况统计图；

图7为不同溶液浸泡后番茄果实灰霉病发病情况统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在以下实施例中，涉及的草莓品种为章姬草莓(fragoriaanammacv.akihime)；涉及的番茄品种为樱桃番茄“新太阳”(solanumlycopersicuml.cvxintaiyang)。

对比例1

将草莓栽培于大田中，在草莓栽培期间施加硫酸铵6.8kg/hm²，硫酸钾3.0kg/hm²，该剂量所施加的各营养元素的剂量为目前草莓栽培中常用剂量(赖涛等，2006(06)，植物营养与肥料学报)。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素。

实施例1

将草莓栽培于大田中，在草莓栽培期间施加尿素3.1kg/hm²，硫酸钾3.0kg/hm²。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素，施加量同对比例1。

实施例2

将草莓栽培于大田中，在草莓栽培期间施加尿素3.1kg/hm²，氯化钾1.3kg/hm²。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素，施加量同对比例1。

对比例1、实施例1以及实施例2中，各肥料施加方案下由自变量所带入的总的n源、k源的质量数是相同的，均为n源1.5kg/hm²，k源1.3kg/hm²。然而，对比例1中肥料组合所带入的硫酸根施加量为6.9kg/hm²，实施例1中肥料组合所带入的硫酸根施加量为1.7kg/hm²，实施例2中肥料组合无硫酸根带入。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素，且各处理组一致。

现有生产中采用的草莓施肥方案中，硫肥的施加(以硫酸钾为例)的范围大约在4.5～12kg/hm²。具体常用施肥方案有：硫酸钾12kg/hm²，温室栽培，土壤ph7.2，有机质1.2％，碱解氮90.5mg.kg^-1，速效磷36.8mg.kg^-1，速效钾185.2mg.kg^-1，配以猪圈粪450kg/hm²，过磷酸钙30kg/hm²(张青，2005，山东农业大学)；硫酸钾4.5kg/hm²，温室栽培，土壤ph7.2有机质0.98％，nh4⁺-n5.8mg/kg，no3^-n20.4mg/kg，速效磷21.7mg/kg，速效钾56.6mg/kg，配以猪圈粪450kg/hm²，过磷酸钙4.5kg/hm²(刘荣宁，2010，27(2)，果树学报)；硫酸钾9kg/hm²，大棚栽培，ph值7.5，有机质含量低，碱解氮115mg/kg，速效磷11.3mgkg，速效钾127mgkg。配以鸡粪225kg/hm²，豆饼15kg/hm²，尿素7.5kg/hm²，磷酸二铵7.5kg/hm²(邢尚军，2000(02)，落叶果树)。

对比例2

将番茄栽培于大田中，在番茄栽培期间施加尿素1383kg/hm²，硫酸钾900.0kg/hm²，该剂量所施加的各营养元素的剂量为目前番茄栽培中常用剂量(郑新娟等，2019，47(21)，安徽农业科学)。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素。

实施例3

将番茄栽培于大田中，在番茄栽培期间施加尿素1383kg/hm²，硫酸钾120.0kg/hm²，氯化钾333.7kg/hm²。在整个栽培期间，其余施加的肥料中不含有硫元素，施加量同对比例2。

由于番茄生长所需要的硫酸根含量较草莓多，因此实施例3中番茄中的肥料组合仍然保留一定的硫酸根含量以维持作物的正常生长。其中，对比例2和实施例3中各肥料施加方案下总的n源、k源的质量数是相同的，均为n源785.1kg/hm²，k源403.8kg/hm²。然而对比例2中肥料组合所带入的硫酸根施加量为495.9kg/hm²，实施例3中因肥料组合所带入的硫酸根施加量为66.1kg/hm²。其余施加的肥料中不含有硫元素，且各处理组一致。

现有生产中采用的番茄施肥方案中，硫肥的施加(以硫酸钾为例)的范围大约在150～900kg/hm²，换算为硫酸根其施加范围为83～497kg/hm²。具体有：硫酸钾318kg/hm²，大棚栽培，土壤ph6.9，有机质26.2g/kg，全硫0.4g/kg，碱解氮63.0mg/kg，有效磷171.4mg/kg，速效钾287.0mg/kg，有效硫58.41mg/kg，配以n(尿素)240kg/hm²、p2o5(钙镁磷肥)120kg/hm²(王少先，2012，24(11)，江西农业学报)；硫酸钾225.0～900kg/hm²，大田栽培，土壤ph6.8，有机质27.9g/kg，速效氮124.9mg/kg，有效磷92.9mg/kg，速效钾189.1mg/kg，配以复合肥80.0kg/hm²(潘可可，2010，南京农业大学)；硫酸钾150～600kg/hm²，大田栽培，土壤ph7.4，有机质19.0g/kg，碱解氮67.0mg/kg，速效磷36.0mg/kg，速效钾103.0mg/kg，配以尿素150kg/hm²，磷酸二铵225kg/hm²(吴国喜，2007，安徽农业大学)。

1.1果实与土壤采集

1.1.1草莓果实与相应土壤采样

选取不同地区的不同大田作为采样地点，每一块大田选取三个相隔直线距离5m以上的0.3m×0.3m的区域采取草莓样品与土壤样品，采得的样品在2h内马上送回实验室进行硫酸根含量的测定与灰霉菌的侵染实验。

1.1.2番茄果实与相应土壤采样

选取不同地区的不同大田作为采样地点，每一块大田选取三个相隔直线距离5m以上的0.3m×0.3m的区域采取番茄样品与土壤样品，采得的样品在2h内马上送回实验室进行硫酸根含量的测定与灰霉菌的侵染实验。

1.2硫酸根含量测定

分别称取5g上述草莓果实与番茄果实、土壤样品于150ml锥形瓶中，加入80ml蒸馏水匀浆。匀浆后加入1ml1mol/l氢氧化钾溶液，超声提取30min，每隔5min振摇一次，保持固相分散均匀，结束后将其至于75℃水浴放置5min，冷却至室温，转移至100ml容量瓶中定容，将定容后的溶液用滤纸过滤，取15ml于10000rpm离心15min，取上清液，依次通过0.22μm水性滤膜，c18柱，收集洗脱液，用离子色谱进行测定。

离子色谱条件：热电aquion离子色谱仪，保护柱ag11～hc(4mm×50mm)，分析柱as11～hc(4mm×250mm，4μm)，进样体积25μl，抑制电导方式检测，以koh溶液为淋洗液，流速1.0ml·min^-1，淋洗梯度：0～5min，5mm；0～5min，5mm；5～20min，5～30mm；20～23min，30mm；23～31min，5mm：

对于草莓而言，如图1和图2所示，对比例1的肥料施加方式下，土壤中硫酸根含量为45.77mg/kg，而实施例1土壤的硫酸根含量为33.74mg/kg，与对比例1相比下降了26.28％；实施例2中土壤中硫酸根含量最低，为13.58mg/kg，与对比例1相比下降了70.33％。

对比例1的草莓果实中硫酸根含量为10.24mg/kg，实施例1的草莓果实中硫酸根含量为7.66mg/kg，与对比例1的草莓果实相比下降了25.20％；实施例2的草莓果实中硫酸根含量为6.94mg/kg，与对比例1的草莓果实相比下降了32.23％。

对于番茄而言，如图3和图4所示，对比例2的肥料施加方式下，土壤中的硫酸根含量为197.28mg/kg，而实施例3的土壤中硫酸根含量为25.08mg/kg，与对比例2相比下降了87.29％。

对比例1的番茄果实中硫酸根含量为14.79mg/kg，实施例3的番茄果实中硫酸根含量为8.75mg/kg，与对比例2的番茄果实相比下降了40.84％。

结果表明通过降低土壤中含硫肥料的施加，能够显著控制成熟草莓果实和番茄果实中硫的含量。

1.3果实抗病性评价

1.3.1果实接种前处理

将准备进行侵染实验的草莓果实和番茄果实分别用0.5％次氯酸钠浸泡4min进行表面杀菌，再用清水浸泡2min清洗2次，自然风晾干后备用。

1.3.2孢子悬液制备

野生型灰霉菌b05.10(wt)用pda培养基培养12～15天，产生孢子，刮取灰霉菌孢子，用0.01％的triton水溶液洗脱并过滤菌丝得到孢子悬浮液，采用血球计数板计数灰霉菌孢子，调整孢子悬浮液浓度为4×10⁵cfu/ml。

1.3.3果实接种

采用果实接种法，评价果实不同硫含量的抗病力变化情况。选取1.3.1处理后的对比例1、实施例1与实施例2的草莓果实；以及对比例2与实施例3的番茄果实。将采摘到的果实去除果梗，在无菌条件下，于超净台中先将果实进行伤口处理，用注射器针头在果实赤道部位打2×2×2mm的小孔，接种5μl孢子悬液置伤口处，放置30min晾干。将果实放置于1安杯中，并将装有果实的1安杯均匀放置在灭菌的托盘上。将装有果实的托盘放置于23℃湿度90％培养箱培养(草莓培养5d，番茄培养8d)，用游标卡尺，采用十字交叉法测量果实表面病菌生长的直径，每组20个果实，试验重复3次。用菌斑直径大小来评价灰霉菌对不同硫含量果实的致病能力。

表1不同肥料施加组合下草莓果实被灰霉菌侵染情况分析

如表1所示，实验结果表明，随着贮藏天数的增加，草莓果实上灰霉病病斑开始逐步增大，然而，对比例1中的果实病斑大于实施例1大于实施例2。在接种后第2天，对比例1果实表面的菌斑直径平均为21.97mm显著(p＜0.05)大于实施例1(17.54mm)与实施例2(16.68mm)，而实施例1和实施例2之间无明显差异。随着贮藏的进行，对比例1与实施例1、实施例2两组之间的差异逐步明显，在接种后第4天，对比例1草莓果实病斑大小为41.92mm，实施例1为39.67mm，均显著大于(p＜0.05)实施例2(35.5mm)。在贮藏结束时，实施例1和实施例2的果实病斑大小依然显著小于(p＜0.05)对比例1，分别比对比例1降低了5.9％和5.6％。

表2不同肥料施加组合下番茄果实被灰霉菌侵染情况分析

注：不同字母表示组间差异显著

如表2所示，番茄果实抗灰霉菌侵染结果，随着贮藏天数的增加，番茄果实上灰霉病病斑逐步增大，其中，对比例2中的果实病斑始终大于实施例3的果实病斑。在接种后的第3至第5天内，对比例2果实表面的病斑直径始终为实施例3果实病斑直径的大约两倍。其中第4天，对比例2果实表面的菌斑直径平均为10.52mm显著大于(p＜0.05)实施例3(5.38mm)的病斑。随着贮藏的进行，对比例2、实施例3之间的差异始终十分明显，在接种后第7天，对比例3番茄果实病斑大小为25.12mm，显著大于(p＜0.05)实施例3(18.47mm)。在贮藏结束时，实施例3的果实病斑大小依然保持显著小于对比例2果实病斑的状态(p＜0.05)。

综上所述，降低果实硫含量有效抑制灰霉菌侵染果实，果实硫含量越低，灰霉病的发病程度越小。

采后改变果实中硫含量探究硫含量对灰霉菌侵染的影响

为了进一步表明成熟果实中硫含量与灰霉菌侵染程度之间的关系，本发明对采后果实分别采用硫酸盐水溶液和清水浸泡的方法，模拟肥料中硫酸根向果实内部的转运，直观的改变果实中的硫含量，然后接种灰霉菌，观察发病情况。

2.1实验材料

草莓果实，章姬草莓(fragoriaanammacv.akihime)，于本地田间新鲜采摘，70％成熟度，采摘后3h内运送到实验室。

番茄果实，樱桃番茄“新太阳”(solanumlycopersicuml.cvxintaiyang)，于本地田间新鲜采摘，80％成熟度，采摘后3h内运送到实验室。

灰霉菌菌株(botrytiscinerea，b05.10)由本实验室保存使用，采用pda进行培养。

2.2改变果实硫含量

2.2.1果实前处理

将采后草莓果实和番茄果实分别用0.5％次氯酸钠浸泡4min进行表面杀菌，再用清水浸泡2min清洗2次，自然风晾干，挑选大小相同、形状相似的果实，将果梗修剪成斜口，备用。

2.2.2果实浸泡处理

取1安杯，在其中加入5ml浓度为2g/l的硫酸钾溶液，将2.2.1中处理后的果实放置在1安杯内，将其果梗插入2g/l的硫酸钾溶液中作为对照浸泡组，用相同体积的水作为处理组，浸泡24小时，取出擦干；硫酸钾溶液浸泡过的果实组用k表示，用水浸泡过的果实用w表示。

2.3硫酸根含量测定

称取5g2.2中所述果实样品，参照1.2中描述的方法测定果实中硫酸根含量。

如图5所示，实验结果，草莓果实与番茄果实经过k2so4浸泡处理均能使得果实中的硫酸根含量相比于对照组得到显著上升(p＜0.05)，其中，a图中番茄果实浸泡处理后其中的硫酸根含量得到了28％的提升；b图中草莓果实浸泡处理后其中的硫酸根含量得到了40％的提升。

结果表明通过浸泡处理能够显著提高草莓和番茄硫酸根含量，该方法较好地模拟含硫肥料施加后会显著改变果实硫含量。

2.4果实抗病性评价

2.4.1孢子悬液制备

孢子悬液的制备参照1.3.2中所述的方法。

2.4.2果实接种

采用果实接种法，评价果实不同硫含量的抗病力变化情况。将本测试例2.2处理后的草莓果实和番茄果实分为两组，一组是用硫酸根浸泡过的(k表示)，另一组用水浸泡过的(w表示)，如图5中a图所示，处理后k组番茄果实中硫含量显著高于w组；如图5中b图所示，处理后k组草莓果实中硫含量显著高于w组。

将浸泡后的番茄果实与草莓果实，在无菌条件下，于超净台中先将果实进行伤口处理。用注射器针头在果实赤道部位打2×2×2mm的小孔，接种5μl孢子悬液置伤口处，放置30min晾干。将果实放置于1安杯中，并将装有果实的1安杯均匀放置在灭菌的托盘上。将装有果实的托盘放置于23℃湿度90％培养箱培养(草莓培养5d，番茄培养8d)，用游标卡尺，采用十字交叉法测量果实表面病菌生长的直径，每组20个果实，试验重复3次。用菌斑直径大小来评价灰霉菌对不同硫含量果实的致病能力。

如图6所示，草莓果实灰霉病发病情况，随着贮藏天数的增加，各种草莓果实中灰霉病病斑都在上升，然而采用灰霉菌接种的水处理组(w组)的菌斑面积均显著小于(p＜0.05)经过硫酸钾浸泡的草莓果实(k组)。在接种的第2、3、4、5天，w组果实菌斑直径低于k组分别降低了5％、15％、7％与6％。

如图7所示，番茄果实灰霉病发病情况，随着贮藏天数的增加，经过硫酸钾浸泡的番茄果实(k组)首先在接种后第3天出现菌斑，而此时经过水处理的果实(w组)还未发病。在接种后第6、7、8天，w组番茄果实菌斑大小显著小于(p＜0.05)k组，分别降低了33％、38％与24％。

以上结果表明对照浸泡组结果表明采后贮藏中果实硫含量越高，灰霉病发病情况越严重，降低果实中硫含量可以显著降低灰霉菌对果实的侵染。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。