一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体涉及一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法。

背景技术：

柔毛淫羊藿(epimediumpubescens)为小檗科(berberidaceae)淫羊藿(epimediuml.)多年生草本植物。作为滋补类中药，中药材淫羊藿始载于《神农本草经》，是我国应用最广泛、最悠久的中草药之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等传统功效。现代药理学表明，淫羊藿还具有改善心血管系统、抗衰老、抗骨质疏松、抑制肿瘤等功效，因而也是最具开发潜力的中药材之一。柔毛淫羊藿为淫羊藿药材4个基原植物之一，分布于四川、陕西、甘肃，属于较为优异的药材。但是，目前淫羊藿原药材大部分来自野生资源，随着对淫羊藿药材需求量逐年增加和野生淫羊藿药材的大量采挖，包括柔毛淫羊藿在内的淫羊藿野生资源逐渐趋于枯竭。

淫羊藿规模化种植是促进我国淫羊藿资源可持续利用最为有效的方法，而植物组织培养技术是目前最常用的一种高效的无性繁殖技术，可以为淫羊藿规模化种植快速提供质优稳定的种苗。植物组织培养技术利用植物细胞的全能性，以植物的器官、组织、原生质体等作为组织培养的外植体，在适宜的环境下，经过诱导脱分化形成愈伤组织，再分化成完整植株。随着植物组织培养技术的日益成熟，现已广泛用于作物育种、园林园艺及药用植物。目前，柔毛淫羊藿组培技术报道相对较少，利用柔毛淫羊藿未成熟胚作为外植体进行植物组织培养更是鲜有报道。

本发明提供了一套完善的柔毛淫羊藿未成熟胚组培技术体系，具有操作简单，繁殖周期短，繁殖率高，成本低，幼苗田间存活率高等优点，便于大规模工厂化生产，对柔毛淫羊藿野生资源的保护和产业化种植将具有重要的促进作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法，操作简单，繁殖周期短，繁殖率高，成本低，幼苗田间存活率高等优点，便于大规模工厂化生产，对柔毛淫羊藿野生资源的保护和产业化种植将具有重要的促进作用。

为进一步实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种完善的柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法，其构思是：以柔毛淫羊藿种子为外植体，通过新鲜种荚低温冷藏培养、种荚消毒、诱导未成熟胚生成愈伤组织、诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽、诱导芽体形成须根、炼苗、育苗等过程获得柔毛淫羊藿再生苗，建立了柔毛淫羊藿植物组织培养快速繁殖体系。具有操作简单，繁殖周期短，繁殖率高，成本低，幼苗田间存活率高等优点，便于大规模工厂化生产，对柔毛淫羊藿野生资源的保护和产业化种植将具有重要的促进作用。

一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)新鲜种荚低温冷藏培养：从采自于四川省雅安市的柔毛淫羊藿植株上摘取新鲜饱满未成熟裂开的绿色果序，将果序放入4℃恒温冰箱中冷藏培养3周。

(2)种荚消毒：将冷藏后的果序用84消毒液以1：200浓度清洗，置于震荡箱中，120rpm震荡0.5h，去除其表面附着的灰尘，清水冲洗除去消毒液；移入超净工作台，然后用75％的酒精溶液震荡消毒30s，无菌水冲洗2遍，将种荚置于0.1％质量浓度的hgcl2溶液中，120rpm震荡消毒10min，取出用无菌水漂洗3-4次除去残留的hgcl2溶液；最后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(3)诱导未成熟胚生成愈伤组织：在超净工作台上将消毒后的种荚用已灭菌的镊子与解剖针轻轻撕开，取出种子，撕去种子白色种膜，配合解剖刀取出种子未成熟胚，将取出的未成熟胚沿长轴方向用解剖刀轻轻划伤1-2道，形成创口，将创口向下轻贴于愈伤组织诱导培养基a上；在光强1000-1500lux，14h/天光照进行培养，培养温度24-25℃条件下；每三周(21天)更换一次培养基，所换培养基配方与原培养基一致，诱导生成愈伤组织；待初步生成愈伤组织后(以肉眼可见在创口处形成团簇状淡绿色愈伤组织为准)，转接愈伤组织诱导培养基b上，同等光照和温度条件，促进愈伤组织加速形成，42天后统计愈伤组织增长率。

(4)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：诱导产生的愈伤组织转接到芽分化培养基上，在光强1500-2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度24-25℃条件下，诱导不定芽的形成，30天后统计不定芽诱导率。

芽的增殖培养：将1-3个芽体接种到芽增殖培养基，进行继代培养，在光强1500-2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度24-25℃条件下，诱导形成丛生芽，30天后统计增殖系数。

(5)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，在光强1500-2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度24-25℃条件下，形成白色须根，30天后统计生根率。

(6)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室取下组培瓶的盖子，在光强1500-2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度24-25℃，空气湿度60％-80％条件下，炼苗2-3天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝2：1：2：1混合后的基质中，荫棚炼苗30-60天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤喷洒百菌清按1：1000进行消毒，施适量的有机肥后耙平，以每株距12～16cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％-70％的遮阳网，并注意防虫、防旱涝，60天后统计成活率。

在本发明中，选择柔毛淫羊藿未成熟胚组培，因其在果荚时期便具有较高的生理活性，本发明意在利用植物组织细胞全能性为原理对柔毛淫羊藿实施快繁技术，未成熟胚作为植物组织中最为幼嫩部分更易诱导，成功率更高。

在本发明中，步骤(1)采用冰箱中冷藏培养3周，是为了促进种胚在低温环境下萌动，在冰箱培养皿内即为无菌环境，若沙藏则耗时耗力且不易观察。

在本发明中，步骤(2)所采用的消毒过程更为严谨、完善，在充分消毒的情况下又不致使种荚内种子因消毒过程活性发生变化，为种子生长提供良好的无菌环境。

在本发明中，步骤(6)基质中所述蛭石用于土壤疏松透气，防止土壤板结；由于淫羊藿的生长环境为土壤肥沃，疏松透气的林下腐殖土，本发明所用田园土量多是为保证水分不过多流失；本发明采用的基质关键在于保持一定的湿度、营养性的情况下又不致使土壤粘结，最大程度的模仿淫羊藿在自然环境下的生长情况。

在本发明中，步骤(6)采用荫棚炼苗30-60天，是基于完全无菌的组培苗到下地移栽需要有一个缓冲过程，适当增加炼苗天数能够使组培苗生长更加健壮，提高组培苗的下地移栽成活率。

在本发明中，步骤(6)移栽前给苗圃施适量的有机肥，基于有机肥营养成分较高，用量不宜过多，过多则易导致“烧苗”，应与传统复合肥合理搭配使用。

在本发明中，步骤(6)中防虫、防旱涝指的是，定期除草并喷洒1:2000百菌清药液，夏季多日未雨时采用人工喷灌，使其湿度达到65％-80％，并注意定期排水。

在本发明中，步骤(6)所述遮阳网为了模拟柔毛淫羊藿在自然状态下生于林下等遮阴较高的地方，防止晒伤。

上述步骤中(1)、(2)、(3)、(4)为本发明关键，因其所采用的外植体的处理方式与其他不同，成熟未开裂的果荚消毒处理并经过与传统沙藏不同的冰箱冷藏方式更为直观，且大大缩短了冷藏时间，取得显著的效果；其培养基配方经过不断优化改良，使操作步骤也更为简便，降低成本，提高了愈伤组织的诱导率及增殖率，解决目前人工种植时间长，费时费力等问题，更好的验证了细胞的全能性，保持优良性状，适宜于工厂化生产，也为组培快繁技术奠定了良好的基础。

上述步骤(3)所述的愈伤组织诱导培养基a为：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0-2.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.05-0.1ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.1-0.2ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5；

愈伤组织诱导培养基b为：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5-2.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.05-0.2ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.2-0.4ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。

在本发明中，步骤(3)所采用愈伤组织培养基a为利用植物细胞的全能性诱导种胚创口处形成愈伤组织，愈伤组织培养基b为增殖培养基，为加速愈伤组织量的生成，能有效提高愈伤组织的诱导率及愈伤组织的增殖系数。

上述步骤(4)所述的芽分化培养基为：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0-2.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.0-2.0ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。

所述的芽增殖培养基为：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5-2.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.5-2.0ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。

上述步骤(5)所述的生根培养基为：1/2ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0-2.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.0-2.0ml/l+活性炭0.1-0.2g/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。

本发明在生根培养基添加一定浓度的6-ba与naa能够有效地促进苗生根，组合后加以调整其生根效率效果更好。

在本发明中，ms指的是组织培养一般作物用培养基的基本配方。

在本发明中，6-ba指的是6-苄氨基腺嘌呤。

在本发明中，naa指的是α-萘乙酸。

在本发明中，tdz指的是噻苯隆。

在本发明中，愈伤组织增长率＝(统计时愈伤组织的鲜质量-接种时愈伤组织的鲜质量)/接种时愈伤组织的鲜质量×100％。

在本发明中，不定芽诱导率＝分化成不定芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数×100％。

在本发明中，丛生芽增殖系数＝增殖的芽数量/接种时芽的数量。

在本发明中，生根率＝生根苗数/接种苗数×100％。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：本发明诱导柔毛淫羊藿未成熟胚形成愈伤组织进而分化出不定芽，在诱导形成愈伤组织过程中采用不同配比的愈伤组织诱导培养基，提高了愈伤组织诱导率，降低了愈伤组织诱导的难度，简化了操作。本发明大大缩短繁殖年限、操作简便、成本低、不受时间和环境的限制，出苗量大，适宜于工厂生产应用。

附图说明

图1显示本发明实施例1未成熟胚诱导产生的愈伤组织；

图2显示本发明实施例2由愈伤组织形成的丛生苗；

图3显示本发明实施例1诱导丛生苗产生根系；

图4显示本发明实施例2组培苗在荫棚炼苗。

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1：一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法，其步骤如下：

(1)新鲜种荚低温冷藏培养：从采自于四川省雅安市的柔毛淫羊藿植株上摘取新鲜饱满未成熟裂开的绿色果序，将果序放入4℃恒温冰箱中冷藏培养3周。

(2)种荚消毒：将冷藏后的果序用84消毒液以1：200浓度清洗，置于震荡箱中，120rpm震荡0.5h，去除其表面附着的灰尘，清水冲洗除去消毒液；移入超净工作台，然后用75％的酒精溶液震荡消毒30s，无菌水冲洗2遍，将种荚置于0.1％质量浓度的hgcl2溶液中，120rpm震荡消毒10min，取出用无菌水漂洗3或4次除去残留的hgcl2溶液；最后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(3)诱导未成熟胚生成愈伤组织：在超净工作台上将消毒后的种荚用已灭菌的镊子与解剖针轻轻撕开，取出种子，撕去种子白色种膜，配合解剖刀取出种子未成熟胚，将取出的未成熟胚沿长轴方向用解剖刀轻轻划伤1或2道，形成创口，将创口向下轻贴于愈伤组织诱导培养基a上，愈伤组织诱导培养基a的配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.05ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.2ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5；在光强1000lux，14h/天光照进行培养，培养温度24℃条件下；每三周(21天)更换一次培养基，所换培养基配方与原培养基(ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.05ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.2ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5)一致，诱导生成愈伤组织；待初步生成愈伤组织后，转接愈伤组织诱导培养基b上，愈伤组织诱导培养基b配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.2ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.2ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5；同等光照和温度条件，促进愈伤组织加速形成，42天后统计愈伤组织增长率，愈伤组织增长率为143.72％。

(4)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：诱导产生的愈伤组织转接到芽分化培养基上，芽分化培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.5ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。在光强2000lux，14h/天光照进行培养，培养温度24℃条件下，诱导不定芽的形成，30天后统计诱导率，不定芽诱导率为86.7％。

芽的增殖培养：将1或2或3个芽体接种到芽增殖培养基上，芽增殖培养基上配方为：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.5ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5，进行继代培养，在光强2000lux，14h/天光照进行培养，培养温度24℃条件下，诱导形成丛生芽，30天后统计增殖系数，增殖系数为5.2。

(5)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，生根培养基配方：1/2ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.0ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.5ml/l+活性炭0.2g/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。在光强2000lux，14h/天光照进行培养，培养温度24℃条件下，形成白色须根，30天后统计生根率，生根率为78.5％。

(6)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室取下组培瓶的盖子，在光强2000lux，14h/天光照进行培养，培养温度24℃，空气湿度70％条件下，炼苗2天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝2：1：2：1混合后的基质中，荫棚炼苗45天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤喷洒百菌清按1：1000进行消毒，施适量的有机肥后耙平(施用量：有机肥400kg/亩，史丹利复合肥按n-p2o5-k2o以15-15-1530kg/亩)，以每株距12或14或16cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％或65％或70％的遮阳网，并注意防虫、防旱涝，60天后统计幼苗成活率，成活率为85％。

实施例2：一种柔毛淫羊藿未成熟胚组培快繁方法，其步骤如下：

(1)新鲜种荚低温冷藏培养：从采自于四川省雅安市的柔毛淫羊藿植株上摘取新鲜饱满未成熟裂开的绿色果序，将果序放入4℃恒温冰箱中冷藏培养3周。

(2)种荚消毒：将冷藏后的果序用84消毒液以1：200浓度清洗，置于震荡箱中，120rpm震荡0.5h，去除其表面附着的灰尘，清水冲洗除去消毒液；移入超净工作台，然后用75％的酒精溶液震荡消毒30s，无菌水冲洗2遍，将种荚置于0.1％质量浓度的hgcl2溶液中，120rpm震荡消毒10min，取出用无菌水漂洗3-4次除去残留的hgcl2溶液；最后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(3)诱导未成熟胚生成愈伤组织：在超净工作台上将种荚用已灭菌的镊子与解剖针轻轻撕开，取出种子，撕去种子白色种膜，配合解剖刀取出种子未成熟胚，将取出的未成熟胚沿长轴方向用解剖刀轻轻划伤1或2道，形成创口，将创口向下轻贴于愈伤组织诱导培养基a上，愈伤组织诱导培养基a的配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.05ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.2ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5；在光强1500lux，14h/天光照进行培养，培养温度25℃条件下；每21天更换一次培养基，所换培养基配方与原培养基一致，诱导生成愈伤组织；待初步生成愈伤组织后，转接愈伤组织诱导培养基b上，愈伤组织诱导培养基b配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)0.1ml/l+tdz(浓度1mg/ml)0.3ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。同等光照和温度条件，促进愈伤组织加速形成，42天后统计愈伤组织增长率，愈伤组织增长率为128.35％。

(4)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：诱导产生的愈伤组织转接到芽分化培养基上，芽分化培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)1.5ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5。在光强2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度25℃条件下，诱导不定芽的形成，30天后统计不定芽诱导率，不定芽诱导率为84.12％。

芽的增殖培养：将1或2或3个芽体接种到芽增殖培养基，芽增殖培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)2.0ml/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph调节至6.5，进行继代培养，在光强2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度25℃条件下，诱导形成丛生芽，30天后统计增殖系数，增殖系数为5.1。

(5)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，生根培养基配方：1/2ms4.74g/l+6-ba(浓度1mg/ml)1.5ml/l+naa(浓度1mg/ml)2.0ml/l+活性炭0.2g/l+蔗糖30g/l+琼脂6.0g/l，ph调节至6.5。在光强2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度25℃条件下，形成白色须根，30天后统计生根率，生根率为76.91％。

(6)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室取下组培瓶的盖子，在光强2500lux，14h/天光照进行培养，培养温度25℃，空气湿度80％条件下，炼苗3天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝2：1：2：1混合后的基质中，荫棚炼苗60天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤喷洒百菌清按1：1000进行消毒，施适量的有机肥后耙平(施用量：有机肥400kg/亩，史丹利复合肥按n-p2o5-k2o以15-15-1530kg/亩)，以每株距12或14或16cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％或65％或70％的遮阳网，并注意防虫、防旱涝，60天后统计幼苗成活率，成活率为85％。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。