一种花叶玉簪试管苗保存方法与流程

本发明属于植物组织培养
技术领域：
，具体地说，涉及一种花叶玉簪试管苗保存方法。
背景技术：
：花叶玉簪(hostaplantaginea)为百合科玉簪属多年生宿根草本植物，是著名观叶植物玉簪的变种，对吸光花卉有极强的互补性，是园林绿化的优良品种。花叶玉簪株丛紧密，叶卵形至心形，有黄色条斑，栽培品种非常多，叶形、叶色和株型差异很大,绿者青翠、蓝者幽幽，似雾似纱、俊秀典雅，绚丽多彩的叶片呈现出魔幻般的渐变色彩。在世界玉簪属新品种的培育热潮中，花叶玉簪因其叶色独特而在一众玉簪品种中脱颖而出。因而，花叶玉簪已经成为极具科研价值和开发前景的野生花卉和药用植物。野生玉簪属植物常常会面临病原菌的侵害，导致其叶枯、基烂甚至全株死亡，还会遭受病毒的侵袭。因此，基于品种优培、资源利用以及推进我国花卉经济产业发展的长远目的，玉簪属植物种质资源的保存则至关重要。花叶玉簪种质资源目前主要采用非原生境保存中的田间圃位保存和试管苗保存。田间圃位保存时，易受环境的影响而导致种质消失。如地下根茎容易受到病毒的侵害，使病毒大量积累，导致品种退化，产量降低；另外，城市土地开发、环境改变也严重威胁花叶玉簪种质资源的安全保存。试管苗保存虽然具有占地面积小、不易受自然灾害和病原菌影响以及人力、财力投入少、便于种质资源交换及运输等优点，但需要频繁继代更新，且经过多次继代培养后面临发生退化现象或产生变异等威胁。技术实现要素：本发明的目的是提供一种保存时间延长，保存后的试管苗表型稳定的花叶玉簪试管苗保存方法。本发明的保存方法是针对现有技术中出现的保存期短，需要频繁继代更新，而多次继代培养又容易导致试管苗退化或发生变异的问题提出的一种能弥补现有技术不足的花叶玉簪试管苗保存方法。本发明针对花叶玉簪试管苗的生理特点和生长特性，研发了一种特别适于保存花叶玉簪试管苗的培养基，该培养基的配方是：ms培养基中添加甘露醇、脱落酸和矮壮素。进一步地，该培养基还含有蔗糖。具体来说，本发明的培养基为：ms+(50±2.5)g/l蔗糖+(10±0.5)g/l甘露醇+(0.5±0.025)mg/l脱落酸+(10±0.5)mg/l矮壮素+0.7％琼脂，ph5.8。优选地，所述培养基为ms+(50±2)g/l蔗糖+(10±0.25)g/l甘露醇+(0.5±0.02)mg/l脱落酸+(10±0.3)mg/l矮壮素+0.7％琼脂。更优选地，所述培养基为ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸+10mg/l矮壮素+0.7％琼脂，ph5.8。在原生质体的再生培养过程中，需要加甘露醇，维持细胞膜内外渗透压平衡，提高渗透压，防止水分渗入细胞内部造成细胞破裂。甘露醇在培养基中主要用于调节培养基的渗透压，和发挥自由基清除剂的作用。有资料表明：在培养基中添加一些高渗化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等，是一种常用的缓慢生长保存手段，常规保存培养基中推荐的甘露醇适宜浓度为2％-3％。本发明发现在本发明的培养基中，甘露醇用量为0.95％-1.05％的情况下，特别是1％的甘露醇能将花叶玉簪的保存期延长至6个月，且保存后材料存活率为100％，且植株恢复培养后表型稳定，不发生退化和变异。脱落酸(abscisicacid，aba)是一种抑制生长的植物激素，因能促使叶子脱落而得名。除促使叶子脱落外尚有其他作用，如使芽进入休眠状态、促使马铃薯形成块茎等。对细胞的延长也有抑制作用。它可以提高植物的抗旱和耐盐力，对开发利用中低产田以及植树造林、绿化沙漠等有极高的价值。aba还是抑制种子萌发的有效抑制剂，因此可以用于种子贮藏，保证种子、果实的贮藏质量。此外，aba还能引起叶片气孔的迅速关闭，可用于花的保鲜、调节花期、促进生根等。脱落酸在控制核酸和蛋白质合成中起作用。有报道脱落酸抑制大麦粒中α-淀粉酶的合成，并在这一过程中与赤霉素发生拮抗。对酶合成的抑制作用与rna合成的抑制剂8-氮鸟嘌呤和6-甲嘌呤所产生的作用类似，表明脱落酸的作用可能是抑制对决定α-淀粉酶结构的rna的合成，或者阻止rna结合到有活性的酶单位中去。在蒲公英的叶子中脱落酸抑制rna的合成，而在品藻中则抑制dna的合成。脱落酸对光敏感，属强光分解化合物。矮壮素(ccc)是一种季铵盐类植物生长调节剂，可以控制植株的营养生长(即根茎叶的生长)，促进植株的生殖生长(即花和果实的生长)，提高植株的坐果率。矮壮素对作物生长有调控作用，可以促进分蘖、增穗增产，使用后叶绿素含量增加，使叶色浓绿，光合作用加强，叶片加厚，根系发达。矮壮素阻碍内源赤霉素的生物合成，从而延缓细胞伸长，使植株矮化、茎秆粗壮、节间缩短，能防止植物徒长和倒伏。(矮壮素对节间伸长的抑制作用可被外施赤霉素解除。)矮壮素能提高根系的吸水能力，明显地影响植物体内脯氨酸(对细胞膜起稳定作用)的积累，有利于提高植物抗逆性，如抗旱、抗寒、抗盐碱及抗病等能力。矮壮素处理后叶片气孔数减少，降低蒸腾速率，可增加抗旱能力。可见矮壮素既有促进植株生长的能力，又有延缓细胞伸长的能力，因此在使用矮壮素时，必须要找到其最合适的用量，且要恰到好处地发挥其调节植株生长的功能，若用量不妥，或与其他组分的配方搭配不妥，则无法预期矮壮素发挥何种功能。本发明发现在ms培养基中，添加特定用量的甘露醇、脱落酸、矮壮素、蔗糖，能够很好地保存花叶玉簪试管苗，并将其保存期延长至6个月100％存活，植株恢复培养后表型稳定，不发生退化和变异，而即使采用添加了甘露醇、脱落酸、矮壮素、蔗糖的ms培养基，若用量未采用本申请的用量，则无法实现较好的保存效果。因此本发明提供了本发明上述的培养基在保存花叶玉簪试管苗中的应用，以及在延缓花叶玉簪试管苗生长速度中的应用。另一方面，本发明提供了一种花叶玉簪试管苗保存方法，包括将花叶玉簪试管苗接入保存培养基中，所述保存培养基为含有甘露醇、脱落酸和矮壮素的ms培养基。所述花叶玉簪试管苗为生长健壮、长势一致的试管苗。本发明实施例中选择生长健壮、长势一致4叶1心试管苗。所述花叶玉簪试管苗是通过以下方法扩繁得到：将花叶玉簪无菌试管苗在培养温度20～25℃、光照强度2000～3000lx、光照时间12～14h/d条件下，接入ms+3％蔗糖+0.7％琼脂，ph5.8培养基中培养30～45天。本发明提供的花叶玉簪试管苗保存方法中，所述培养基为ms+(50±2.5)g/l蔗糖+(10±0.5)g/l甘露醇+(0.5±0.025)mg/l脱落酸+(10±0.5)mg/l矮壮素+0.7％琼脂，ph5.8。优选地，所述培养基为ms+(50±2)g/l蔗糖+(10±0.25)g/l甘露醇+(0.5±0.02)mg/l脱落酸+(10±0.3)mg/l矮壮素+0.7％琼脂。更优选地，本发明的保存方法中，所采用的培养基为ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸+10mg/l矮壮素+0.7％琼脂，ph5.8。本发明在保存过程中，保存条件为培养温度20-25℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12-14h/d。优选地，保存条件为培养温度25℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d。本发明的有益效果在于：本发明通过大量研究发现，将蔗糖、甘露醇、脱落酸、矮壮素按照一定的用量比例添加入ms培养基中，能够用于保存花叶玉簪试管苗，可以将花叶玉簪试管苗保存6个月，保存方法操作简单、成本低廉，克服了现有技术报道的保存方法最多保存3个月，保存时间短、需频繁继代导致植株变异和退化的缺陷，本发明方法避免了田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭，又减少了继代频次，极大地降低了花叶玉簪试管苗的保存成本，是一种安全、可靠、简单有效的保存花叶玉簪种质资源的方法，将本发明方法应用于生产实际将会取得良好的经济效益。附图说明图1为实施例3保存的对照花叶玉簪试管苗生长状态。其中，a为保存1个月后的生长状态；b为保存2个月后的生长状态；c为保存3个月的生长状态。图2为实施例3延缓生长保存的花叶玉簪试管苗生长状态。其中，a为保存2个月后的生长状态；b为保存4个月的生长状态；c为保存6个月后的生长状态。图3为实施例4花叶玉簪试管苗延缓生长保存6个月后恢复培养1个月生长状态。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1花叶玉簪试管苗保存方法实验材料：花叶玉簪试管苗来自国家作物种质库试管苗库。实验方法具体步骤如下：(1)试管苗扩繁后的生长方法如下：将增殖扩繁出的花叶玉簪无菌试管苗，在培养温度20～25℃、光照强度2000～3000lx、光照时间12～14h/d条件下，接入ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)培养基中培养30～45天。(2)延缓生长保存方法如下：选择步骤(1)中生长健壮且长势一致的4叶1心(高度为5±0.5cm)的花叶玉簪无菌试管苗接入延缓生长保存培养基ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸(aba)+10mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂(ph5.8)，在培养温度20～25℃、光照强度2000～3000lx、光照时间12～14h/d条件下培养6个月。(3)恢复培养方法如下：将步骤(2)中保存的材料接种到恢复培养基ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)上，在培养温度20～25℃、光照强度2000～3000lx、光照时间12～14h/d条件下培养30～60天。实施例2花叶玉簪试管苗保存6个月后的存活率以在ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)培养基上培养30～45天后生长健壮且长势一致(4叶1心，高度为5±0.5cm)的花叶玉簪无菌苗为材料，分别接入10种保存方案的培养基中，培养条件同实施例1，研究不同保存方案培养基对存活率的影响。结果如表1所示。表1花叶玉簪在各保存方案中保存6个月的存活率从表1可以看出，对照组材料虽在保存3个月时存活率仍为100％，但此时植株已顶瓶盖且培养基所剩无几必需进行继代培养。延缓生长保存方案a，即ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸(aba)+10mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂(ph5.8)保存的材料可以至少连续保存6个月而无需继代，且存活率仍为100％。随着保存时间的延长，延缓生长保存方案b，即ms+50g/l蔗糖+40g/l甘露醇+3.0mg/l脱落酸(aba)+40mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂(ph5.8)的存活率逐渐降低，保存到第5个月时，存活率只有36.7％，第6个月时全部死亡。延缓生长保存方案c，即ms+110g/l蔗糖+20g/l甘露醇+2.0mg/l脱落酸(aba)+40mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂(ph5.8)在保存到第3个月时的存活率就出现骤然下降，只有39.4％，保存到第4个月时，存活率只有6.0％，第5个月时全部死亡。实施例3花叶玉簪试管苗延缓生长保存中株高的变化以在ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)培养基上培养30～45天后生长健壮且长势一致(4叶1心，高度为5±0.5cm)的花叶玉簪无菌苗为材料，分别接入对照培养基(ms+3％蔗糖+0.7％琼脂，ph5.8)和延缓生长保存方案培养基(ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸(aba)+10mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂，ph5.8)即实施例2的a方案中的培养基，培养条件同实施例1，研究实施例2中的方案a培养基对存活植株株高的影响。结果如表2，图1，图2所示。表2花叶玉簪在保存过程中的株高变化从表2可以看出，随着保存时间的延长，对照组材料株高增长明显，第1个月增长23.19％，第2个月增长45.51％，至第3个月最长继代时间时株高增长率为53.39％。而在延缓生长保存方案保存过程中，则随着保存时间的延长，株高逐渐矮于对照组，至保存第3个月时株高相比于对照组株高显著降低，仅为对照组69.32％；至保存6个月时，株高已降低24.25％。与对照组保存的材料相比，延缓生长保存方案能够通过矮化植株高度，以达到延长保存时间的效果。实施例4花叶玉簪试管苗延缓生长保存恢复培养后株高和表型的变化以在ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)培养基上培养30～45天后生长健壮且长势一致(4叶1心，高度为5±0.5cm)的花叶玉簪无菌苗为材料，分别接入对照培养基ms+3％蔗糖+0.7％琼脂(ph5.8)培养基培养60天、接入延缓生长保存方案培养基ms+50g/l蔗糖+10g/l甘露醇+0.5mg/l脱落酸(aba)+10mg/l矮壮素(ccc)+0.7％琼脂(ph5.8)保存6个月后，分别进行恢复培养60天后进行表型检测，培养条件同实施例1，研究各保存方案培养基对保存后恢复培养植株株高、紧密度和冠层色素分布等表型指标的影响。结果如表3，图3所示。从表3可以看出，花叶玉簪试管苗延缓生长保存6个月后经过恢复培养60天，其株高比对照矮，延缓生长效果明显；而株丛紧密度和相对叶绿素含量与对照组无显著变化，表型稳定。表3花叶玉簪试管苗延缓生长保存恢复培养后株高和表型的变化方案株高(cm)紧密度相对叶绿素含量(％)对照6.65±0.4000.405±0.02996.63±1.806方案a3.58±0.5720.424±0.01995.93±1.225虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12