一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力过程中超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)等生物酶的研究，具体涉及一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法。

背景技术：

枇杷(eriobotryajaponicalindl.)是蔷薇科、枇杷属植物，是多年生木本常绿小乔木，高可达10米；小枝粗壮，黄褐色，密生锈色或灰棕色绒毛。枇杷起源于我国，已有上千年的栽培历史。它的果实成熟于春末夏初的水果淡季，是我国重要的经济果树。目前，我国枇杷的自主选育品种在市场上的占有率很高，具有极高的市场潜力。

枇杷大多种植在保水能力弱，灌溉条件差的山坡地带，且种植区域在冬季常受到霜冻天气的侵扰。研究表明，从超微结构上讲，枇杷幼苗叶片在-5℃低温胁迫下，12h时就出现细胞质膜破裂，叶绿体完全解体，线粒体膜结构丧失，嵴消失；而枇杷幼苗根系在0℃胁迫下，原生质膜已经受到破坏，变得模糊不清，液泡膜结构皱缩；在-5℃低温胁迫下，根系原生质膜、液胞膜均受到严重破坏，原生质体浓缩为一团，很难再恢复到细胞正常结构状态。从生理代谢上看，枇杷幼苗叶片在-5℃胁迫的mda含量大幅度增加，保护酶活性受到严重的抑制，说明地上部的光合作用受低温胁迫下降，消耗增多；枇杷幼苗根系在-5℃胁迫下mda含量呈现一直增大，保护酶活性受到抑制，脯氨酸、蛋白质含量一直升高；表明地上部光合作用降低，根部受低温胁迫，向上运输n源功能受阻(参见张玉荣，低温胁迫对枇杷幼苗地下部与地上部生长发育的影响，福建农林大学硕士论文，2008年)。可见，枇杷幼苗叶片在-5℃低温胁迫下会受到较为严重的冻害，是不可逆的，很难再恢复到正常状态。

此外，干旱对枇杷的生长也有很大的影响。枇杷幼苗叶片遭受干旱胁迫，叶片机体膜脂过氧化作用加剧，细胞膜系统受到破坏。而且，干旱还会引起活性氧的产生，同时增强植物抗氧化酶系统。该系统是植物抗逆境胁迫的生理基础，其活性的高低可以反映今后植物对不良环境的抵抗能力，酶活性越大，植物的抗逆能力越强。其中，sod是膜脂过氧化防御系统的主要保护酶，较高的sod活性是植物抵抗逆境胁迫的生理基础；而apx被认为是叶绿体中清除h2o2的关键酶。枇杷叶片在轻、中度干旱胁迫下通过减少地上生物量，抑制蒸腾作用，提高抗氧化酶的活性和增加渗透调节物质的含量等措施保护自身免遭干旱胁迫的伤害，表现出了一定的耐旱性和适应性。但重度胁迫下枇杷叶片光合作用受到严重抑制，细胞结构和功能受到损害难以恢复，超出了枇杷的耐性阈值(参见王丹等，干旱胁迫对枇杷生理特性及生长的影响，西北植物学报，2016，36(7)：1399-1407)。

在枇杷幼苗的种植过程中，通常采用设施栽培的方式进行防冻和抗旱。虽然，通过这些设施栽培的方式可以提高枇杷幼苗的成活率，但是投入成本极高。因此，开发低投入且高效的方式提高枇杷幼苗的抗逆能力，进而提高新品种推广过程中幼苗栽培成活率，提高新品种推广的速度和效率以及提高杂交育种过程中的后代的成活率，加速育成新品种的进程和效率，对我国枇杷产业的发展具有重要战略意义。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法，其特征在于：枇杷幼苗在遭受干旱或/和寒冷胁迫前采用褪黑素溶液进行浇灌处理；所述褪黑素溶液是浓度为50-200μmol/l的褪黑素溶液。

根据本发明的一个实施方案，所述枇杷幼苗为“华白1号”嫁接苗，砧木2年生，接穗1年生。

根据本发明的一个实施方案，所述褪黑素溶液的制备方法为：先将褪黑素粉末用无水乙醇溶解，再用纯净水稀释成褪黑素溶液。

根据本发明的一个实施方案，所述浇灌处理为褪黑素溶液对枇杷幼苗进行根部浇灌处理，每次浇灌300ml，每隔2天浇灌一次，处理时间为2周。

根据本发明的一个实施方案，所述干旱为持续缺水处理14天以上；所述寒冷为-5℃寒冷条件下持续7天以上。

根据本发明的一个实施方案，本发明提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法，其特征在于，采用如下步骤：对生长健壮且长势一致的2年生“华白1号”嫁接苗，分别采用0μmol/l(对照组)、50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l和200μmol/l褪黑素对枇杷幼苗进行根部浇灌处理；所述浇灌处理为在地面距离枇杷幼苗茎部的3cm左右圆周范围处，进行浇灌，每棵幼苗每次浇灌300ml，每间隔2天浇灌一次(期间进行正常的水肥管理)，处理2周；所述褪黑素溶液的制备步骤为先将褪黑素粉末溶解在无水乙醇，再用纯净水稀释成褪黑素溶液；再对褪黑素处理后的枇杷幼苗分别进行干旱或/和寒冷胁迫和形态观察，通过对胁迫过程中的枇杷幼苗叶片内源褪黑素含量、荧光参数和抗逆相关生理指标的测定结果和细胞组织结构的完整性观察结果，来评判枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫的能力；所述干旱为持续缺水处理14天以上；所述寒冷为-5℃寒冷条件下持续7天以上；所述抗逆相关生理指标包括叶片内的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)和丙二醛(mda)含量；所述细胞组织结构包括叶片栅栏组织和海绵组织。

根据本发明的一个实施方案，所述褪黑素溶液优选150μmol/l的褪黑素溶液。

根据本发明的第二方面，本发明提供褪黑素在提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力中的应用。进一步，褪黑素在制备预防枇杷幼苗在遭受干旱或/和寒冷胁迫药物(农药或生物刺激剂)中的应用。

有益效果：

本发明提供一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法，在枇杷幼苗遭受干旱或/和寒冷胁迫前采用特定浓度的褪黑素溶液浇灌处理，结果表明：褪黑素处理显著提高了枇杷幼苗叶片中的内源褪黑素含量和荧光参数；显著增强了枇杷幼苗叶片内的sod、pod、cat、apx含量，同时降低了mda含量，以及维持叶片组织结构的完整性。寒冷胁迫后，经褪黑素处理后的枇杷幼苗叶片下垂的程度要明显低于无褪黑素处理幼苗，同时将幼苗放在室温后，处理组的幼苗恢复程度和速度均显著高于无褪黑素处理幼苗。根据胁迫后和恢复后的表型观察得出：150μmol/l褪黑素处理的枇杷幼苗显著提高了枇杷幼苗叶片内的褪黑素含量和荧光参数，同时显著增强了胁迫过程中幼苗叶片的抗逆相关生理指标测定和维持了叶片组织结构完整性，抵抗干旱和寒冷胁迫的能力最强。发明人在研究中发现，特定浓度的褪黑素溶液不仅可以提高枇杷幼苗抵抗干旱胁迫能力，还可以提高枇杷幼苗抵抗寒冷胁迫能力，种植过程投入成本低，幼苗的成活率高，从而有助于提高新品种推广的速度和效率以及提高杂交育种过程中的后代的成活率，加速育成新品种的进程和效率，对我国枇杷产业的发展具有重要战略意义。

附图说明

图1是外施不同浓度褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态观察图：其中a-d:无褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片在第7天时最先下垂且13天时完全下垂：ia-id:50μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片在第7天时开始略微下垂且13天时严重下垂：iia-iid:100μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片在第10天时开始略微下垂且13天时略微下垂：iiia-iiid:150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片在第13天时开始略微下垂：iva-ivd:200μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片在第10天时开始略微下垂且13天时略微下垂。

图2是外施不同浓度褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态观察：其中a-d:无褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片完全下垂且发黄：ia-id:50μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且发黄：iia-iid:100μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄。iiia-iiid:150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片略微下垂且不发黄：iva-ivd:200μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄。

图3是外施不同浓度褪黑素处理的枇杷幼苗经寒冷胁迫后，放置正常温度后的恢复情况。

图4是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的褪黑素含量变化：其中a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的褪黑素含量变化：b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的褪黑素含量变化。

图5是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中荧光参数的变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中荧光参数的变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中荧光参数的变化。

图6是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的sod含量变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的sod含量变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的sod含量变化。

图7是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的pod含量变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的pod含量变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的pod含量变化。

图8是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的cat含量变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的cat含量变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的cat含量变化。

图9是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的apx含量变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的apx含量变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的apx含量变化。

图10是褪黑素处理枇杷幼苗在干旱和寒冷胁迫过程中的mda含量变化：a.褪黑素处理枇杷幼苗在干旱胁迫过程中的mda含量变化；b.褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫过程中的mda含量变化。

图11是不同褪黑素处理枇杷幼苗在寒冷胁迫后的叶片切片图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。

实施例

本发明提供的外施褪黑素提高枇杷幼苗抵抗干旱和寒冷胁迫能力的方法，包括：

(1)外施褪黑素对枇杷幼苗进行根部浇灌处理；

(2)褪黑素处理后的幼苗置于干旱条件下，进行干旱胁迫处理。

(3)褪黑素处理后的幼苗置于寒冷条件下，进行寒冷胁迫处理。

(4)筛选出抵抗能力最强的枇杷幼苗对应的褪黑素处理浓度。

(5)胁迫过程中幼苗的抗逆相关光合指标、生理指标测定和细胞结构观察。

上述外施褪黑素对枇杷幼苗进行根部浇灌处理中：所选的枇杷幼苗为“华白1号”嫁接苗(砧木2年生，接穗1年生)，生长在圆柱形的育苗钵中，生长健壮，长势和高度一致，共计200株；整个褪黑素溶液浇灌处理过程在温室中进行，相同基因型的枇杷株系和处理环境，为褪黑素处理枇杷幼苗提高抗逆性的表型观察和理论研究奠定了基础。接着，先将褪黑素粉末溶解在无水乙醇，再用纯净水分别稀释成工作液为50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l和200μmol/l褪黑素溶液。分别用0μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l和200μmol/l褪黑素溶液对枇杷幼苗进行根部浇灌处理，即用(1)对照组：0μmol/l对40棵枇杷幼苗进行根部浇灌处理；(2)用50μmol/l对40棵枇杷幼苗进行根部浇灌处理；(3)用100μmol/l对40棵枇杷幼苗进行根部浇灌处理；(4)用150μmol/l对40棵枇杷幼苗进行根部浇灌处理；(5)用200μmol/l对40棵枇杷幼苗进行根部浇灌处理。5种处理每次浇灌300ml，每隔2天浇灌一次，处理2周，即第1天浇灌，第4天浇灌，第7天浇灌，第10天浇灌，第13天浇灌，其余时间各处理均进行相同且正常的肥水管理，第15天开始，褪黑素处理的枇杷幼苗进入干旱或者寒冷胁迫处理。

上述褪黑素处理后的幼苗置于干旱条件下进行干旱胁迫处理：分别将以上5种褪黑素溶液处理后的幼苗各20棵，即0μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、50μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、100μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、150μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵和200μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵，分别置于温室中，持续干旱缺水处理14天以上。胁迫过程中，枇杷幼苗的形态变化；胁迫处理结束后，观察幼苗的恢复情况。无褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片完全下垂；50μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片部分下垂；100μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在干旱胁迫下的形态，叶片部分下垂；150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片略微下垂，下垂程度最弱；200μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂(图1)。胁迫处理结束后，再次将幼苗置于室温，150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗恢复的速度最快。

上述褪黑素处理后的幼苗置于寒冷条件下，进行寒冷胁迫处理：分别将以上5种褪黑素溶液处理后的幼苗各20棵，即0μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、50μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、100μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵、150μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵和200μmol/l褪黑素处理的幼苗20棵，分别置于-5℃寒冷条件下中，持续低温处理5天以上；胁迫处理结束后，再次将幼苗置于室温，观察幼苗的恢复情况。无褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片完全下垂且发黄；50μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且发黄；100μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄；150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片略微下垂且不发黄；200μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄(图2)。胁迫处理结束后，再次将幼苗置于室温，150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗恢复的速度最快，且恢复程度最高。

上述筛选出抵抗能力最强的枇杷幼苗对应的褪黑素处理浓度。根据幼苗在干旱或者寒冷胁迫处理过程和胁迫结束后的恢复情况，判断褪黑素溶液处理枇杷幼苗的最佳浓度。无褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片完全下垂且发黄；50μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且发黄；100μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄；150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片略微下垂且不发黄；200μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗在寒冷胁迫下的形态，叶片部分下垂且不发黄。胁迫处理结束后，再次将幼苗置于室温，150μmol/l褪黑素处理后的枇杷幼苗恢复的速度最快，且恢复的程度最高。因此，150μmol/l褪黑素溶液对枇杷幼苗进行根部浇灌处理，获得的枇杷幼苗的抗干旱或寒冷的能力最强(图3)。

以对照组和150μmol/l处理组的幼苗为例，进行抗旱和抗冻相关的生理指标测定。上述胁迫过程中幼苗的抗逆相关的生理指标测定和细胞结构观察：枇杷幼苗叶片中的内源褪黑素的含量(图4)，同时显著提高了叶片的荧光参数(图5)；显著增强枇杷幼苗叶片内sod、pod、cat和apx含量(图6、7、8和9)，同时降低mda含量(图10)和维持细胞组织结构完整性(图11)。

具体包括：(1)收集对照组和150μmol/l处理组的幼苗叶片，迅速用液氮冷冻后，放置-80℃待用。取储存于-80℃冰箱中的0.1g样品，用磨样机在液氮条件下磨碎，于冰上(全程低温避光条件)加入1ml80％甲醇(-20℃预冷)和30mg/ml抗氧化剂二乙基二硫代氨基甲酸钠15μl，放入超声清洗机中震荡20min使浸提液与样品充分混匀，使浸提更充分，避光放入4℃冰箱，浸提12h。将离心管取出后放入离心机中，10000rpm，4℃，离心15min，上清液转入棕色旋转蒸馏瓶中，遮光置于冰上；沉淀加入1ml80％甲醇(-20℃预冷)，用超声清洗机震荡20min混匀后放入离心机中，10000rpm，4℃，离心15min，上清转入之前的棕色旋转蒸馏瓶中，重复上述步骤；将棕色旋转蒸发圆底瓶中三次合并的上清液于旋转蒸发器上40℃减压蒸干，至溶液体积约为原体积三分之一时停止；用3ml0.1m磷酸缓冲液(ph＝8.0)和3ml石油醚(30～60)混合液分两次冲洗旋转蒸馏瓶，将冲洗液置于分液漏斗中进行萃取脱色，弃去上层石油醚酯相，分离得到水相；重复上述步骤两次；水相用等体积的乙酸乙酯溶液萃取3次，再将水相调ph为3.0，用等体积乙酸乙酯萃取3次，将两次萃取液合并后于旋转蒸发器上40℃旋转蒸干；加入1ml100％甲醇(分析纯)溶解，得到的有机溶液通过0.22μm有机滤头后，注入棕色液相上样瓶内-20℃保存备用。

取适量的褪黑素标准品用100％色谱甲醇溶解后，在紫外分光光度计200-300nm处进行全波段扫描，结果发现在250-260nm处，褪黑素均有较大吸收波峰。因此，褪黑素选用250-260nm区域波长254nm作为检测波长。将褪黑素标准品溶液进样，通过对不同流动相成分筛选和比例摸索，最终确定出液相色谱检测的条件；进样量：10μl；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测时间：20min。

准确称取褪黑素标准品25mg分别溶于50ml色谱甲醇，定溶于50ml容量瓶中，作为母液(初始浓度：褪黑素500ng/μl)，然后将此母液依次稀释成不同浓度(m：500ng/μl、250ng/μl、125ng/μl、62.5ng/μl、31.25ng/μl、15.625ng/μl)的梯度溶液，以备后用。

精准量取标准母液10ml后，用1.5ml注射器经0.22μm有机滤头过滤后注入棕色高效液相进样瓶中，在相同的液相检测条件下，连续进样6次，记录褪黑素的峰面积和出峰时间。褪黑素的回收率试验：精确称取0.1g待测材料两份用磨样机磨碎，一份中加入标准母液200μl，另一份不加母液作为对照，两份样品分别按照上述褪黑素提取方法进行褪黑素提取，最后进行液相检测。回收率＝加标回收率＝(加标样品峰面积-未加标峰面积)÷加标量峰面积×100％，生物学重复试验三次。数据分析将不同的标样浓度对应的峰面积大小，按照对应关系列入excel软件中，做出标准曲线和线性回归方程，根据待测样品在出峰时间对应的峰面积计算出各样品鲜重的褪黑素含量，然后进行分析比较。分析结果显示，在干旱和寒冷胁迫整个过程中，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的褪黑素含量均显著高于对照组(图4)。

(2)荧光参数的测定方法：采用捷克psi公司生产的handyfluorcam便携式荧光成像系统进行叶绿素荧光参数测定，将完整的枇杷叶暗适应30min后，测定荧光诱导动力学参数。激发光强为0.1μe，作用光强为200μe，其脉冲光强为800μe，闪光时间为0.4s，闪光间隔10s。测定初始荧光产量(f0)和最大稳态荧光产量(fm)，重复3次。测定结果显示，在干旱胁迫7天后和寒冷胁迫72小时后，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的荧光参数均显著高于对照组(图5)。

(3)酶液粗提取液的制备：取出储存于-80℃冰箱中的0.1g样品用磨样机磨碎，加入0.8ml的50mmol/l预冷的磷酸缓冲液(ph＝7.8)震荡摇匀，避光低温条件下用超声清洗机震荡20min使酶液充分浸提后放入离心机中4℃，12000rpm，离心20min，上清夜即为酶液粗提液。

(4)超氧化物歧化酶(sod)的测定方法：sod酶试剂的配制、测定方法及计算公式参照叶尚红实验方法[叶尚红主编.植物生理生化实验教程[m].昆明:云南科学技术出版社,2004]。操作注意事项：[1]酶液提取、及测定须在低温、避光环境下进行，尽快进行测定；[2]植物中的酚类物质对测定有干扰，因此，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。[3]nbt反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。测定结果显示，在干旱胁迫7天后和寒冷胁迫72小时后，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的sod酶均显著高于对照组(图6)。

(5)过氧化物酶(pod)的测定方法：在过氧化物酶催化下，h2o2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。pod酶试剂的配制、测定方法及计算公式参照王学奎实验方法[王学奎主编.植物生理生化实验原理和技术[m].北京:高等教育出版社,2006]。操作注意事项：(1)反应液配制时，由于愈创木酚难溶，应加热一段时间(不宜超过82℃)。冷却后加入h2o2前注意溶液，防止h2o2的挥发。(2)该反应迅速，加入酶液要快速测定吸光值。分析结果显示，在干旱和寒冷胁迫过程中，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的pod含量均显著高于对照组(图7)。

(6)过氧化氢酶(cat)的测定方法：cat酶试剂配制、测定方法及计算公式参照李合生实验方法[李合生主编.植物生理生化实验原理和技术[m].北京:高等教育出版社,2000]。本部分操作注意事项：h2o2易分解，应现用现配。分析结果显示，在干旱和寒冷胁迫整个过程中，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的cat含量均显著高于对照组(图8)。

(7)抗坏血酸(apx)的测定方法：apx酶试剂配制、测定方法及计算公式参考王文斌实验方法[王文斌主编.植物活性氧代谢及其利用[m].北京:中国农业科学技术出版社,2011]。注意事项：加入h2o2后应混匀反应液然后快速进行比色测定，以防止h2o2分解。分析结果显示，在干旱和寒冷胁迫后，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的apx含量均显著高于对照组(图9)。

(8)mda含量的测定：(1)取0.1g样品(叶片或根系)放入2ml离心管冷冻条件下用磨样机磨成粉末状，加入1ml的5％tca，避光低温条件下用超声清洗机震荡20min在3000r/min下离心20min；(2)取上清液1ml于离心管中，加入等体积的0.67％tba(硫代巴比妥酸)混和后在100℃沸水浴中煮30min，用冷水迅速冷却后在3000r/min下离心10min；(3)取上清液分别在450nm、532nm、600nm下测od值(用去离子水调零)。计算组织中mda含量：mda浓度(μmol/l)＝6.45(od532-od600)-0.56od450；mda含量(μmol/gfw)＝c×v/w，公式中v为提取液体积，w为样品鲜重。分析结果显示，在干旱胁迫7天后和寒冷胁迫12小时后，褪黑素处理的枇杷幼苗叶片内的mda含量均显著低于对照组(图10)。

(9)枇杷幼苗在寒冷胁迫后的叶片切片观察，石蜡切片方法参照李和平的方法[李和平.植物显微技术[m].北京:科学出版社(第二版),2009.]，并加以改进，具体操作步骤如下：[1]固定：将枇杷叶片拍照、清洗去绒毛，加入faa固定液固定，每隔12h，换一次固定液到无色，转移至装有70％酒精的离心管中，保存备用。→[2]脱水：将材料依次换入30％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇，每个梯度处理2h。→[3]透明：将彻底脱水的材料分别转入二甲苯与无水乙醇3种比例(1:2、1:1、2:1)的混合溶液中，进行逐级透明，每次透明约2h。再用纯二甲苯进行透明，每次约30min，共2次。→[4]浸蜡：透明后的材料置于饱和石蜡的二甲苯溶液中，放入37℃烘箱中24h，让石蜡慢慢渗入材料中。24h后将烘箱温度升至60℃，打开离心管的管盖，使二甲苯逐渐挥发。将二甲苯和石蜡混合液倒出，更换已经熔化成液体的纯石蜡溶液3次，每次约6h，使石蜡逐渐完全浸入材料中。→[5]包埋：待熔化后的石蜡冷却片刻，倒入准备好的纸船中，用镊子将材料转移到模型中，令切面接触底部，调整好材料的位置和方向，待其完全凝固后，即得到包埋好的蜡块。→[6]修蜡：用小刀将包埋的蜡块修整成适当大小的长方体。→[7]切片：用切片机切割封好的蜡块，厚度为10μm。→[8]粘片：将切片放在涂有粘片剂的载玻片上，随后将载玻片放在展片台上烘烤。→[9]脱蜡和染色：纯二甲苯→1/2二甲苯+1/2无水乙醇(v：v)→无水乙醇→95％乙醇→85％乙醇→70％乙醇→50％乙醇→30％乙醇，以上每步均处理10min左右。将经过脱蜡的玻片置于1％的番红水溶液中，室温下过夜，取出玻片在50％乙醇中清洗5s，再用双蒸水清洗；接下来在0.5％的固绿乙醇溶液中处理约5s，之后在50％乙醇中清洗5s，再用双蒸水清洗。在显微镜下观察和拍照。结果显示，褪黑素处理能维持枇杷幼苗的栅栏组织和海绵组织的完整性(图11)。