一种截形苜蓿水培扦插扩繁方法与流程

本发明涉及截形苜蓿无性扩繁技术领域，具体涉及一种截形苜蓿水培扦插扩繁方法。

背景技术：

截形苜蓿为豆科苜蓿属一年生草本植物，是豆科模式植物。由于截形苜蓿具有高的遗传转化效率、倍性小(2n＝16)、基因组小(～5*108bp)、自花授粉、固氮等特点，使其成为豆科生物学和基因组学研究的模式植物。截形苜蓿的植株再生时间较短，有大量的突变体和多种生态型，具有较高的生物多样性。截形苜蓿与大部分豆科植物遗传相似性很高，从截形苜蓿获得的信息可以用于其它豆科植物的研究。因此，截形苜蓿成为继拟南芥和水稻基因组测序完成后又一个大规模基因组测序的植物，并建立了tnt1逆转座子插入突变体库。目前，利用截形苜蓿突变体对基因功能研究已成为重要的手段。另外，对截形苜蓿的研究不仅可用于豆科植物生物学的研究，也将推动其它诸如人类营养、植物的病原反应、根系发育、共生互作、植物中碳、氮和磷的新陈代谢以及植物发育的激素控制和信号转导等方面的研究。因此，截形苜蓿特别是截形苜蓿突变体作为重要的研究载体，其株系的扩繁就显得尤为重要。尽管截形苜蓿可通过自交结种繁殖保持植株的遗传特性，但由于截形苜蓿生长易受环境影响，特别是突变体种子产量普遍偏低，所以影响后期试验的开展，而无性系的扦插扩繁可以将一株母株扩繁成多株，即可用于后续试验也可收种子，因此截形苜蓿的扦插扩繁技术是非常有必要的。

目前国内外截形苜蓿的扦插扩繁技术并未见报道，主要以传统的种子进行扩繁，在实际科研工作中，经常出现因种子少而不得不用3-5个月的时间先进行种子扩繁，这严重影响了试验进度。所以，需要发明一种方便高效且产生的无性系具有一致性高的扦插方法，技能满足截形苜蓿分子生物学研究，也能满足截形苜蓿的常规扩繁和保育。

水培扦插是以水或营养液为介质代替常用基质，具有快捷方便、洁净无污染、低碳环保、易管养、成本低廉等优点，同时也可对植物的营养成分进行精确控制，有利于了解植物的生长状况，受自然条件限制小，能够在多季节大量育苗，同时还兼具可方便观察根系生长的全过程。因此，本发明拟通过水培扦插进行截形苜蓿的扩繁。

技术实现要素：

本发明的目的是针对截形苜蓿扦插扩繁方法的缺失，提供一种原创的生根率较高，可短时间获得大量截形苜蓿水培扦插育苗的方法。本发明是首次发明截形苜蓿扦插扩繁技术，为截形苜蓿常规保种及分子水平研究提供重要扩繁技术。

本发明提供一种截形苜蓿水培扦插扩繁方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

1)扦插苗的制备：以土培28-32天的截形苜蓿为扦插苗，选取茎基直径为1.5～1.8mm的第一节茎节为插穗；

2)扦插：向培养容器内倒入500-1000ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成40-50°角斜切，插穗长5～8cm，留1-2个叶片，带有1-2个叶芽，用0.5-2cm厚的海棉条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住；然后将其插入培养板的孔内，然后放置在培养容器中进行水培扦插；

3)扦插后管理：水培扦插的第一周光照强度为160-220μmol/m²·s，光照12h(24℃)/黑暗12h(20℃)，相对湿度70-80％，一周后，光照强度变为250-300μmol/m²·s，光照16h(24℃)/黑暗8h(20℃)，相对湿度70-80％，每6-8天更换同样配方的营养液至培养24-26天；其中所述扦插营养液用改良的fahraeus营养液和/或hb-101天然植物活力液配制；

4)定植：培养到生根后，将生根的截形苜蓿水培苗在改良的1/2hoagland液中壮苗，壮苗后即可用于定植。

其中，所述以土培28-32天的截形苜蓿为扦插苗，是通过土培培养30天。

其中，所述扦插，方法如下：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长5～8cm，留一个叶片，带有1个叶芽，用长5～6cm，宽1.5～1.8cm，1cm厚的海棉条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中。

其中，所述水培扦插，方法如下：以fahraeus营养液为水培基液，加入1/1000的hb-101天然植物活力液，生根后转入改良的1/2hoagland液中培养一周后定植。

其中，所述水培扦插以塑料盆作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长，培养容器放置厚度为0.4-0.6cm，上有10-20个直径为1-1.5cm的圆孔pvc板。

其中，所述定植，方法如下：生根20天后，将生根的截形苜蓿水培苗在改良的1/2hoagland液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。

本发明最优选的方法，步骤如下：

(1)扦插苗的准备

截形苜蓿种子在培养箱中催芽7天后进行土培培养，培养基质为混合的营养土(营养土：蛭石：珍珠岩为1:1:1)；培养条件为：光照16h(24℃)/黑暗8h(20℃)，光照强度为280μmol/m²·s，相对湿度75％。

(2)扦插装置的设计

以白色塑料盆作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长。厚度为0.5cm的pvc板按照培养盆的大小切割后，均匀打成15个圆孔，消毒后备用。

(3)扦插营养液配制：扦插营养液以其中水培培养采用改良的fahraeus营养液，并加入1/1000的天然植物活力液，室温保存备用。其中，fahraeus液配方同上，天然植物活力液为淘宝电商上所购买，如(日本hb-101品牌)。fahraeus营养液的配方及配制方法如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，分别加入100ml大量、1ml微量、4ml柠檬酸铁、1mlcacl2母液定容于1l蒸馏水中，ph调至6.8备用。

(4)插穗选择：以(1)中所述，培养30天的截形苜蓿用于扦插，选取茎基直径为1.5～1.8mm的枝条第一节茎节为插穗；

(5)扦插：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长6～8cm，不留叶片，带有1个叶芽，用剪好的海面条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中；

(6)扦插后管理：水培的第一周光照强度为180μmol/m²·s，光照12h(24℃)/黑暗12h(20℃)，相对湿度75％。一周后光照强度变为280μmol/m²·s，光照16h(24℃)/黑暗8h(20℃)，相对湿度75％，每7天更换同样配方的营养液至培养20天。

(7)定植：培养7天后陆续生根，生根20天后，生根率达到97.43％，将生根的截形苜蓿水培苗在改良的1/2hoagland液中所述的营养液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。改良1/2的hoagland液配方如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释400倍，c液稀释2000倍，d液铁盐稀释400倍，混合后得到的是改良的1/2hoagland营养液。

以上步骤(2)所述的培养盆的规格为长17.5cm，宽11.5cm，高5cm，容积为800ml；所述的pvc板的规格为长17.5cm，宽11.5cm，厚0.5cm，板上的圆孔直径为1.2cm；以上步骤(5)所述海绵为厚度1cm，长5～6cm，宽1.5～1.8cm。采用75％酒精擦拭pvc板和培养盆表面，剪好的海绵条用自来水清洗1-2遍，后用蒸馏水清洗1遍。表面消毒的培养盆、pvc板和洗好的海绵放于超净台中紫外杀毒4h后备用。

以上步骤(3)与(7)所述的营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。

本发明有关的名称术语的解释如下：

截形苜蓿拉丁名：medicagotruncatula。被子植物门豆科一年生草本植物，是豆科模式植物。原产热带，亚热带。植株匍匐生长，产草量低，为放牧型牧草。生长期150天左右。荚果球形，外生刺状毛，形状如蒺藜，又称蒺藜苜蓿。

第一节茎节

茎基直径为1.5～1.8mm的截形苜蓿茎的最底端带有茎节的茎段为第一节茎节，也称下节。

培养容器

将培养盆(长17.5cm，宽11.5cm，高5cm，容积为800ml)外部用黑色胶带覆盖为根部制造黑暗环境且以免透光生长绿苔；顶部用规格为长17.5cm，宽11.5cm，厚0.5cm的pvc板，板上均匀打孔15个，圆孔直径为1.2cm。

改良的fahraeus营养液由fahraeus无氮营养液进行微调，形成改良的fahraeus营养液，具体以本发明的配方为准。

hb-101天然植物活力液

happybio101％是hb-101的名称由来。hb-101是一种来自日本的天然植物活力液，是从雪松、柏树、洋车前子、松树等中提取出的纯天然植物元素，hb-101能促进植物营养生长和伤口修复。

改良的1/2hoagland营养液由最原初生物hoagland’s(霍格兰氏)营养液进行微调，并将所有组分浓度稀释一倍，就是改良的1/2hoagland营养液

本发明的上述方法，其中部分步骤以及相关的技术参数是经过筛选获得的，筛选过程如下：

营养液的筛选：在确定本发明之前，我们尝试了改良的hoagland营养液、改良的1/2hoagland营养液、改良的fahraeus营养液、改良的1/2fahraeus营养液，改良的hoagland营养液+1/1000的hb-101、改良的1/2hoagland营养液+1/1000的hb-101、改良的fahraeus营养液+1/1000的hb-101、改良的1/2fahraeus营养液+1/1000的hb-101，发现截形苜蓿插穗在改良的1/2fahraeus营养液+1/1000的hb-101中生根最好，而且长势较好，在改良的hoagland营养液中最差，不易生根，可能过高的营养不利于截形苜蓿生根。

插穗部位的选择：因土培截形苜蓿可以产生更多的枝条，所以本发明选用土培截形苜蓿作为扦插的母株，并选用开花期前的枝条用于扦插，并选取下节(枝条底部第一节)、中节(第4茎节)、上节(最顶端茎节)进行扦插，下节扦插生根率最高且植株长势最好，其次是中节，上节生根率很长势均最差，且易进入生殖生长阶段，在植株较小阶段就开始开花，影响后期利用和种子的产量。

本发明具有的优点及有益效果如下：

1.本发明是截形苜蓿首次尝试的扦插扩繁技术。具有方便管理和省时省力的优点，而且扦插的无性系生长一致性较好，特别是可用于分子育种研究以及种子扩繁当中。

2.本发明以培养盆作为培养容器，采用酒精表面消毒和紫外消毒，有效的避免了因培养容器带菌导致水培过程中发霉的现象，而且占用空间小，对工作空间要求小，适宜广泛推广。

3.本发明使用土培苗枝条进行扦插，插穗一年四季均容易获得，且本方法一年四季都可进行无性苗的扦插扩繁，不受季节和气温限制，延长了有效扦插时间。

4.本发明配制的营养液营养均衡合理，使得扦插苗生长健壮一致，操作简单，管理简便，经济实用高效，杜绝了病虫害，而且节省了传统土壤扦插时所需的浇水、除草、喷雾等管理措施所耗费的人力，节约了大量成本；扦插7天后开始生根，15天后上中下节生根率均可达65％以上，扦插20天后生根率达到97.43％，根系健壮发达、生根率高且稳定，大大缩短了育苗周期。

5.本发明紧密结合生产实际，其实用性和可操作性强，成本低廉，可广泛应用于截形苜蓿扩繁及研究中，亦可对其他植物扦插扩繁提供参考，具有广阔的应用前景和技术成果转化潜力。

附图说明

图1为实施例中的操作流程图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

选用r108截形苜蓿材料进行试验，种子在培养箱中催芽7天后进行土培培养，培养基质为混合的营养土(营养土：蛭石：珍珠岩为1:1:1)；培养条件为：光照16h(24℃)/黑暗8h(22℃)，光照强度为280μmol/m²·s，相对湿度75％。

以白色塑料盆(长17.5cm，宽11.5cm，高5cm)作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长。厚度为0.5cm的pvc板按照盆的大小切割后，均匀打15个(3×5)直径1.2cm的圆孔。剪好的海绵条(厚1cm，长5～6cm，宽1.5～1.8cm))用自来水清洗1-2遍，后用蒸馏水清洗1遍。采用75％酒精擦表面消毒的培养盆、pvc板和洗好的海绵放于超净台中紫外杀毒4h后备用。

扦插营养液配制：扦插营养液以其中水培培养采用改良的fahraeus营养液，并加入1/1000的天然植物活力液，室温保存备用。其中，fahraeus液配方同上，天然植物活力液为淘宝电商上所购买，如(日本hb-101品牌)。fahraeus营养液的配方及配制方法如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，分别加入100ml大量、1ml微量、4ml柠檬酸铁、1mlcacl2母液定容于1l蒸馏水中，ph调至6.8备用。

插穗的选择：土培培养30天的r108截形苜蓿用于扦插，选取茎基部直径为1.5～1.8mm的健壮枝条，下节为第一茎节，中节为第4茎节，上节为枝条的最顶端。扦插：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长6～8cm，不留叶片，带有1个叶芽，用海面条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中。

扦插后管理：水培的第一周光照强度为180μmol/m²·s，光照12(24℃)/黑暗12h(22℃)，相对湿度75％。一周后换取营养液，光照强度变为280μmol/m2·s，光照16h(24℃)/黑暗8h(22℃)，相对湿度75％，每7天更换同样配方的营养液。15天后，上中下节生根率分别可达65.4％、76.9％和67.7％。培养20天后生根率不再改变，上节生根率为79.8％，中节生根率为85.6％，下节生根率可达到97.4％。定植：将生根的截形苜蓿水培苗在(7)中所述的营养液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。改良的1/2hoagland营养液配方如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释400倍，c液稀释2000倍配制，d液铁盐稀释400倍。

按照上述实施例的方法，水培扦插20天后观察统计生根率，生根率＝(生根单株数/该组插穗总数)×100％，具体结果如表1。

下表为按照实施例1-6的方法进行截形苜蓿水培扦插育苗20天所得到的生根率及生长指标。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。