银环蛇咬伤猪模型的制备及用途的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种银环蛇咬伤猪模型的制备及用途。
背景技术：
：毒蛇咬伤（蛇伤）是被世界卫生组织列为一个易忽视的重要的热带/亚热带疾病之一，全球每年约有500万蛇伤事件发生，造成约2.5万—12.5万人死亡。我国每年蛇伤的患者达30万人之多，死亡率为5%—10%，致残或丧失劳动能力者占25%—30%，给家庭和社会带来了极大的负担。据流行病学调查显示，我国银环蛇咬伤占各类毒蛇咬伤的8.12%，但死亡人数却居蛇伤事件的首位。银环蛇咬伤属于急重症，主要表现为嗜睡、运动神经失调、瞳孔散大、局部无力、垂涎、恶心、呕吐、昏迷、呼吸困难等症状，2-4小时内可出现眼睑下垂、吞咽苦难、肌无力等神经麻痹症状，严重危及患者的生命安全。银环蛇毒以神经毒素为主，并且有神经肌肉阻断作用，引起横纹肌迟缓性瘫痪，可导致外周型呼吸麻痹，是临床上主蛇伤要致死原因。为准确诊断、科学评价银环蛇蛇伤的发展进程及生理病理变化，需要建立一种与银环蛇咬伤病症相似的动物模型，方能使研究更符合临床实际情况，但目前尚未发现有关于银环蛇咬伤动物模型制作的文献。因此，亟待发明一种成熟稳定的银环蛇咬伤动物模型，为该疾病的防治研究提供直接、精准的体内证据。技术实现要素：本发明提供了一种银环蛇咬伤猪模型的制备及用途，弥补银环蛇咬伤没有实验动物模型的不足。有助于动态分析银环蛇咬伤的发生发展进程，更贴近人类被银环蛇咬伤的病理生理的动态过程，为研究银环蛇咬伤的临床表征、病理生理机制、精准化治疗、抗毒蛇咬伤药物的筛选及抗蛇毒血清疗效的评价等研究提供创新技术方法支撑。银环蛇咬伤猪模型的制作具体分为两个步骤，1）探索猪肌肉注射银环蛇蛇毒的mld；（2）制备银环蛇咬伤的猪模型。优选的，所述猪肌肉注射银环蛇蛇毒的mld为50-70μg/kg，优选为60μg/kg。优选的，所述制备银环蛇咬伤的猪模型注射银环蛇蛇毒的剂量为10-50μg/kg，优选剂量为30μg/kg。优选的，所述制备银环蛇咬伤的猪模型是将银环蛇蛇毒冻干粉注射入猪腿部肌肉，72h不间断观察猪精神状态、运动状态、呼吸表现、口腔分泌物、眼睑情况等生物学行为状态，并结合白细胞计数（wbc）、超敏c反应蛋白（hs—crp）、钾离子（k+）、二氧化碳（co2）等血液指标水平，再根据心脏、大脑的he染色等病理检查结果制备银环蛇咬伤的猪模型。本发明显著两个优点：1.本发明首次建立了一种银环蛇咬伤动物模型方法，该模型具有成功率高、重复性强、病理改变稳定等优势，且该模型与银环蛇咬伤病症极其相似，更贴近人类被银环蛇咬伤的生理病理动态过程，能够最大程度的符合临床实际情况。2.模型在研究银环蛇咬伤的临床表征、病理生理机制、精准化治疗、抗毒蛇咬伤药物的筛选及抗蛇毒血清疗效的评价研究等方面具有极大的应用价值。附图说明图1：本发明实施例猪生理盐水注射前后状态对比图。a1：猪生理盐水注射前状态；a2：猪生理盐水注射后状态。图2：本发明实施例猪银环蛇毒注射前后状态对比图。b1：猪银环蛇毒注射前状态；b2：猪银环蛇毒注射2h和后状态。图3：本发明实施例生理盐水组和银环蛇毒组大脑he染色结果。c1为注射生理盐水猪的大脑he染色病理图片；c2为注射银环蛇毒猪的大脑he染色病理图片。图4：本发明实施例生理盐水组和银环蛇毒组心脏he染色结果。d1为注射生理盐水猪的心脏he染色病理图片；d2为注射银环蛇毒猪的心脏he染色病理图片。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说，但并不局限于此。实施例1：银环蛇咬伤猪模型的制备1．探索猪肌肉注射银环蛇蛇毒的mld：从广西大学动物科学院购买18只小猪，雌雄不限，体重在10kg左右，分为5组不同浓度的银环蛇毒组和1组对照组。在小猪左腿外侧肌肉处以0.2ml/kg注射银环蛇蛇毒，浓度根据理论半数致死量数值设计，按照2倍间距设置银环蛇蛇毒的浓度梯度，银环蛇蛇毒的浓度梯度为240、120、60、30、15μg/kg，每组浓度重复三个个体，对照组3只小猪注射等量的生理盐水，观察猪的存活状况及生物学行为状态变化，探索小猪肌肉注射银环蛇蛇毒的最小致死量。动物实验经过学校动物伦理学委员会批准，许可证号：scxk桂2018-0003。2．制备银环蛇咬伤的猪模型：从广西大学动物科学院购买6只小猪，雌雄不限，体重在10kg左右，分为银环蛇毒组和生理盐水组。银环蛇毒组选30μg/kg作为应用剂量，按照猪重量0.2ml/kg于猪左腿外侧处肌肉注射银环蛇毒；生理盐水组按照猪重量0.2ml/kg剂量于猪左腿外侧肌肉处注射生理盐水。建模期间时刻观察猪的生物学行为状态如精神状态、运动状态、呼吸表现、口腔分泌物、眼睑情况等，定时检测猪的相关血液指标与病理检测，血液学指标主要包括白细胞计数（wbc）、超敏c反应蛋白（hs—crp）、钾离子（k+）、二氧化碳（co2）等；病理检查主要为心脏、大脑的he染色情况检验银环蛇咬伤猪模型是否建立。3．数据处理。数据采用均值±标准差表示，运用spss22.0进行单因素方差分析（anova）和t检验分析，p值小于0.05或小于0.01认为有显著性差异。4．实验结果：（1）注射银环蛇毒后，小猪死亡情况如下表1，得出小猪的最小致死量约为60μg/kg，根据文献拟采用最小致死量的1/2作为造模计量。（2）生物学行为状态：银环蛇蛇毒组猪在2h内出现嗜睡、运动神经失调、站立不稳、刺激反应减弱、瞳孔散大、鼻翼煽动、呼吸加快、口腔分泌物变多、角膜有不明分泌物、恶心、呕吐、垂涎等明显的银环蛇蛇伤中毒症状；4h后出现眼睑下垂、卧地不起、肌无力、吞咽困难、呼吸困难等症状，见图1。生理盐水组猪无明显变化，没有出现中毒症状，见图2。（3）血液指标：银环蛇蛇毒组猪白细胞计数在注射蛇毒后6h内白细胞（wbc）显著降低；钾离子（k+）在注射蛇毒后6h内显著降低；二氧化碳（co2）在注射蛇毒后6h内显著升高；超敏c反应蛋白（hs—crp）在注射蛇毒72h内显著升高。表明在中毒情况下，猪的神经系统和血液系统已经发生紊乱。表1小猪肌肉注射银环蛇蛇毒7天内各剂量组死亡情况组别剂量/（mg/kg）动物数/只死亡数/只死亡百分率/%10.243310020.123310030.063133.3340.00330050.00153006生理盐水300表2.模型组与正常对照组注射银环蛇毒后猪血液各项生理生化指标的变化情况。(x±s，n=3)注：与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01（3）he染色结果：通过生理盐水组和银环蛇蛇毒组对比可知，银环蛇蛇毒组组织细胞呈现明显的中毒形态，大脑中的神经细胞发生肿胀，部分尼氏小体发生溶解，个别细胞发生空泡变性坏死，详见图3。心肌细胞明显排列紊乱，细胞多呈浑浊肿胀，部分发生点状坏死，详见图4。在实验中发现，于猪腿部肌肉注射一定剂量的银环蛇蛇毒，4-12小时内即可获得目标动物模型，符合临床实际情况。本实施例中，生物学行为状态作为评价模型成功与否的主要指标。此外，为更好的评估建立的动物模型，本实施例中还利用相关血液学指标和病理检测，作为评定模型的辅助指标，以便获得更准确的动物模型。实施例2：银环蛇咬伤猪模型的应用用本发明建立的银环蛇咬伤猪模型，弥补银环蛇咬伤没有实验动物模型的不足。模型贴近人类被银环蛇咬伤的病程较长特点，可以模拟银环蛇咬伤的过程，可用于研究其发病的临床表征、病理生理机制、精准化治疗，并可最终评价抗蛇毒血清和抗毒蛇咬伤药物的疗效。以上说明仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。当前第1页12