一种苦参碱和渐狭蜡蚧菌相容性研究及其联用的杀虫药

本发明属于生物防治技术领域。具体涉及普通大蓟马防治的生物防治，更具体地，涉及一种苦参碱和渐狭蜡蚧菌相容性研究以及对普通大蓟马防治的协同作用。

背景技术：

渐狭蜡蚧菌(akanthomycesattenuatum)是一种重要的昆虫病原真菌，隶属于子囊菌纲，肉座菌目，蜡蚧菌属，寄主和分布广泛，是重要的生防菌种，作为活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的作用机理、对环境无污染、无残留的特点，可以作为某些对杀虫剂产生抗药性的昆虫的防治替代品。针对这一农业生产的重要需求而研发，筛选到一株对蓟马效果好的生防真菌。

蓟马是缨翅目(thysanoptera)蓟马科(thripida)昆虫的统称。蓟马广泛分布于世界各地，寄主范围广，为害严重，防治困难，经济损失巨大。世界上已报道蓟马主要分布在中国、日本、菲律宾、印度、巴基斯坦等国家(dialokesa,bosahbo.efficacyofdifferentratesofformulatedneemseedoilandfrequencyofapplicationonthecontrolofflowerthripsinfestingearlymaturingpigeonpeacultivarinowerri,imostate,nigeria[j].revistabrasileiradecirurgiaplástica,2015,26(4)：602-607.)，中国境内出现的区域有台湾、海南、贵州、陕西、湖北、云南、浙江等地(郑建武.中国蓟马族的分类研究(缨翅目：蓟马科)[d].西北农林科技大学,2010.)。蓟马类害虫体型微小，容易隐藏，且繁殖力强，生长周期短，世代重叠严重，为防治增加了难度(范咏梅,童晓立,高良举,etal.普通大蓟马在海南豇豆上的空间分布型[j].环境昆虫学报,2013,35(6):737-743.)。目前，该类害虫防治主要依赖于化学防治，由大量化学药剂的不合理使用，2010年发生的“毒豇豆”事件引人深思(付步礼,曾东强,刘奎,谢艺贤,邱海燕,唐良德.蓟马类害虫抗药性研究进展[j].农学学报,2014,4(03):28-34.)。

长期以来，对蓟马的防治都是以化学农药为主，随着化学农药长期大量的使用，带来的“3r”问题即害虫抗药性(resistance)、农药残留(residue)和害虫再猖厥(resurgence)以及环境污染问题越来越严重。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义(杨运华,杜开书,石明旺.虫生真菌的生物防治研究进展[j].河南科技学院学报,2011,39(1):34-37)。

采用农药复配技术或混合施用技术是克服或延缓病虫害抗药性的重要方法之一。目前，有以多种杀虫剂轮流使用、混合使用防治蓟马的方法，但该防治方法存在着化学药剂使用量较高、农药残留量较大、病害易产生交互抗药性、防治效果较差等问题，而且由于复配剂中复配组分存在着较严格的相互制约，因此，在防治普通大蓟马时如何做到高效、无污染、无残留的防治，是当前解决实际问题的关键，也是研制农药复配剂的关键。

技术实现要素：

本发明基于渐狭蜡蚧菌菌株对普通大蓟马具有一定生物防治效果的基础上，为了进一步寻求更好的防治效果，经过大量探究和探索实验发现，苦参碱和渐狭蜡蚧菌菌株scaudcl-53具有较好的相容性，并且联用能够产生显著的协同增效作用，对蓟马类害虫具有显著的防治效果，最终完成本发明的。因此，本发明要解决的技术问题是克服现有普通大蓟马防治技术的缺陷和不足，提供一种高效、无污染、无残留的具有协同增效作用的苦参碱和渐狭蜡蚧菌联用的杀虫药，因而提高了防治效果，并可明显减低化学农药单剂的使用剂量、减少环境污染，有效解决现有农药易产生抗性、药效不明显等问题。

因此，本发明首先提供一种用于蓟马类害虫防治的含有苦参碱和渐狭蜡蚧菌联用的杀虫药，即该杀虫药以苦参碱和渐狭蜡蚧菌为活性成分。其中，该渐狭蜡蚧菌菌株已于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno:60586，保藏地址为中国广州。该菌株scaudcl-53，最初在土壤中分离而来，为中国本土菌株，能很好地适应本地的自然环境。该菌株的筛选和鉴定等内容已记载之前的专利申请201910275459.5的说明书中。

相应地，本发明提供由苦参碱和渐狭蜡蚧菌联用的杀虫药在防治蓟马类害虫方面的应用，尤其是在防治普通大蓟马中的应用。

优选地，上述杀虫药中，所述渐狭蜡蚧菌为渐狭蜡蚧菌孢子，可以是悬浮液，也可以是孢子粉。

更优选地，所述苦参碱和渐狭蜡蚧菌的用量比按照如下标准进行：渐狭蜡蚧菌的终浓度为1×10⁴～1×10⁸分生孢子/ml，优选为1×10⁴～1×10⁷分生孢子/ml，苦参碱的终浓度为0.125～0.5mg/ml，优选为0.125～0.45mg/ml；更优选为渐狭蜡蚧菌和苦参碱的比例为1×10⁴～1×10⁷分生孢子/ml：0.25～0.45mg/ml，进一步优选为渐狭蜡蚧菌和苦参碱的比例为1×10⁵～1×10⁷分生孢子/ml：0.25～0.45mg/ml。最优选，所述渐狭蜡蚧菌和苦参碱的比例为1×10⁶分生孢子/ml：0.25mg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的杀虫剂中的苦参碱和渐狭蜡蚧菌scaudcl-53具有很好的相容性，并且联用产生了显著的协同增效作用，，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，两者联合使用对普通大蓟马有很好的防治效果，因此在蓟马类害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。由于本发明的杀虫药防治效果好，因而可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，适应了有机食品生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓蓟马类害虫抗药性的发生和发展。

附图说明

图1：不同浓度苦参碱对菌株scaudcl-53菌落生长的影响。

图2：不同浓度苦参碱对菌株scaudcl-53孢子萌发率的影响。其中，图中数据为平均值±标准误。经tukey检验，不同小写字母表示同一菌株不同浓度苦参碱对菌株萌发率差异显著(p＜0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1苦参碱和渐狭蜡蚧菌相容性研究

1材料与方法

1.1供试菌株

渐狭蜡蚧菌scaudcl-53。

1.2供试培养基

沙式培养基(sabourauddextroseagar,sda)：蛋白胨10g、琼脂20g、葡萄糖40g，加入蒸馏水定容至1000ml，121℃，30min高压蒸汽灭菌。

1.3不同浓度孢子悬浮液的配制

将渐狭蜡蚧菌scaudcl-53菌株接种于pda培养基上，置于生化培养箱内26℃下活化10d，挑选活性强的分生孢子再次接种于pda平板并在生化培养箱内扩繁培养7d，待大量产孢后，用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，磁力搅拌器搅拌，灭菌后的双层脱脂纱布过滤，在生物显微镜下镜检，血球计数板计数，配制浓度为1×10⁸孢子/ml的母液孢子悬浮液，再依次稀释成1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴孢子/ml的悬浮液备用。

1.4苦参碱对高毒力菌株菌落生长的影响

将配制好的pda培养基中加入植物源农药苦参碱，倒完平板后置于超净工作台紫外照射2h，配制成浓度为0.05、0.125、0.25、0.5和1.0mg/ml的含药pda培养基平板。取活化后菌丝生长均匀的高毒力菌株一皿，打孔器打制成5mm的菌饼并置于含药pda培养基平板中间进行接种，在生化培养箱内26℃条件下培养，每天用十字交叉法测定菌落直径，共测定7天。每个处理设置10个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.5苦参碱对高毒力菌株孢子萌发率的影响

将配制好的sda液体培养基中加入植物源农药苦参碱并置于超净工作台紫外照射2h，配制成浓度为0.05、0.125、0.25、0.5和1.0mg/ml的含药sda液体培养基。将活化后的高毒力菌株配制成1.0×10⁴孢子/ml的孢子悬浮液，并加入2ml于50ml不同浓度的含药sda液体培养基中，置于摇床180rpm25℃振荡培养7d，每天于超净工作台内取样，在血球计数板上镜检菌株孢子萌发情况，计算其孢子萌发率。每个处理设置3个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.6数据统计与分析

利用spss19.0软件进行试验数据分析，并运用tukey检验差异显著性。用graphpadprism6和excel绘制图表。

2结果与分析

2.1苦参碱对高毒力菌株菌落生长的影响

结果显示，不同浓度苦参碱处理渐狭蜡蚧菌scaudcl-53后，菌株直径随着浓度的增加而减小，且差异显著(图1)。在处理3d后，不同浓度药剂处理后菌株菌落直径均小于空白对照(16.0mm)，0.05、0.125、0.25、0.5、1.0mg/ml浓度的苦参碱处理的渐狭蜡蚧菌scaudcl-53，菌落直径分别为12.1、11.1、9.9、8.1、7.0mm。在处理7d后，0.05、0.125、0.25、0.5、1.0mg/ml浓度的苦参碱处理的渐狭蜡蚧菌scaudcl-53，菌落直径分别为19.3、15.2、13.4、10.1、7.8mm，低于空白对照(25.4mm)。

2.2苦参碱对高毒力菌株孢子萌发率的影响

试验结果表明，低浓度苦参碱处理渐狭蜡蚧菌scaudcl-53后对菌株孢子萌发率的较小，与空白对照无显著差异，高浓度反之(图2)。处理3天后，0.05、0.125、0.25、0.5、1.0mg/ml浓度的苦参碱处理的渐狭蜡蚧菌scaudcl-53，菌株孢子萌发率分别为98.07％、96.09％、86.17％、57.33％、24.10％；处理7天后，0.05、0.125、0.25、0.5、1.0mg/ml浓度的苦参碱处理的渐狭蜡蚧菌scaudcl-53，菌株孢子萌发率分别为100％、100％、100％、95.27％、70.27％。

综上所述：苦参碱对菌株的影响相对较小。在本试验中，处理7d后，低浓度(0.05、0.125、0.25、0.5ml)苦参碱对渐狭蜡蚧菌scaudcl-53的孢子萌发与空白对照相比没有显著差异，其中浓度为0.05、0.125、0.25ml时，萌发率可达到100％，在浓度为0.5ml，该菌株萌发率也可达到95.27％；各浓度苦参碱对菌株scaudcl-53的菌落生长影响与空白对照相比差异显著，但与余昕彤(余昕彤.白僵菌和苦参碱对斜纹夜蛾的协同控害及生理生化影响[d].华南农业大学,2018.)研究结果相似，可用于后续试验。

实施例2苦参碱和渐狭蜡蚧菌对普通大蓟马防治的协同作用

1、材料与方法

(1)供试虫源

普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田，采回后在rxz-500c型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)内用豇豆豆荚饲养，饲养条件为温度(26±5)℃，光照周期12l:12d，相对湿度(70±5)％。室内饲养多代后，选取发育一致的雌成虫进行室内试验。

(2)供试菌株

scaudcl-53。

(3)菌株和药剂对普通大蓟马的毒力测定

将15mm×75mm的平底试管用配制好的浓度药剂或孢子悬浮液浸泡2h，自然风干后备用，同时将新鲜豇豆切成两端无孔的1cm的小段，置于药剂浓度中浸泡10s后取出，晾干后放入上述平底试管中，接入成熟的普通大蓟马雌成虫，棉花封口，置于26±6℃和12l:12d的光照培养箱内饲养。以无菌水浸泡过的平底试管和豇豆作为空白对照。每个处理设3个重复，每个重复20头幼虫。连续5d检查普通大蓟马死亡数，计算其校正死亡率。

(4)菌株与药剂两者复配剂对普通大蓟马的毒力测定方法

分别配制0.125、0.25、0.5mg/ml的苦参碱与1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸孢子/ml的高毒力菌株孢子悬浮液备用，在把配制的各浓度苦参碱分别与各浓度菌株两两组合，进行毒力测定。毒力测定方法同上。

(5)数据统计与分析

利用spss19.0软件进行试验数据处理分析，采用单因素方差分析对普通大蓟马死亡率进行结果分析，并运用tukey检验差异显著性。数据计算公式参照huangetal.(2013)，具体公式如下：

me＝ma+mb×(1-ma)

公式中，各项含义如下：

ma：苦参碱单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

mb：高毒力菌株单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

mab：菌药复配剂对普通大蓟马的实际校正死亡率；

me：菌药复配剂对普通大蓟马的期望死亡率；

根据公式，分别计算出菌药复配剂的χ2值，在χ2表格中查找df＝1对应的p值为3.841。

当计算得的χ2＜3.841，则表示菌株和苦参碱复配表现出拮抗作用；

当计算得的χ2＞3.841，则表示菌株和苦参碱复配表现出协同增效作用。

(6)实验结果

渐狭蜡蚧菌scaudcl-53与苦参碱协同作用对普通大蓟马的毒力结果：单独使用不同浓度的苦参碱(0.125、0.25、0.5mg/ml)处理普通大蓟马，第5d的校正死亡率分别为18.33％、20％、25％；单独使用不同浓度的渐狭蜡蚧菌(1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸孢子/ml)处理普通大蓟马，第5d的校正死亡率分别为15％、25％、46.67％、61.67％、91.67％。

从表1可以看出，渐狭蜡蚧菌scaudcl-53与苦参碱复配剂对普通大蓟马的致死率显著高于各单剂。在处理5天后，大部分浓度苦参碱与浓度(1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴孢子/ml)渐狭蜡蚧菌scaudcl-53复配剂表现出协同增效作用，除0.125mg/ml的苦参碱与1×10⁴孢子/ml的菌株scaudcl-53外，其他菌药各组合浓度对普通大蓟马的校正死亡率均高于60％，其中0.5mg/ml苦参碱与1×10⁷孢子/ml菌株scaudcl-53复配剂对试虫的致死率最高，为89.67％。

虽然单独用1×10⁸孢子/ml比联合使用的0.5mg/ml苦参碱与1×10⁷孢子/ml菌株scaudcl-53复配剂死亡率高，但是单独使用菌株杀虫效果慢，一般都3-4天才有效果。菌株与药剂联合毒力具有显著的增效作用，见效快。比如单独用1×10⁸孢子/ml，3d死亡率为40％,而0.5mg/ml苦参碱与1×10⁸孢子/ml联用，3d死亡率为72％，效果好，见效快。综合药剂、菌株用量、死亡率以及增效作用选取合适的配比，据此并结合实验结果，推荐使用0.25mg/ml苦参碱与1×10⁶孢子/ml菌株scaudcl-53复配剂，致死率为85％。

表1渐狭蜡蚧菌scaudcl-53与苦参碱协同作用对普通大蓟马的毒力

注：表中数据为平均值±标准误，经tukey检验，不同小写字母表示同一时间不同组合浓度间差异显著(p＜0.05)，括号内的数值分别表示预期死亡率和计算得到卡方值χ²，*表示具有协同增效作用的组合。