一种提高籼稻成熟胚愈伤组织诱导的前处理方法与流程

[0001]
本发明属于转基因技术领域，具体提供了一种提高籼稻成熟胚愈伤组织诱导的前处理方法。


背景技术：

[0002]
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，维持着世界一半以上人口的生存。近年来，随着世界人口的增加和可耕种面积的减少，提高水稻产量和质量对于解决世界性的粮食危机具有重要意义。分子生物学和分子遗传学的进一步发展，使得转基因技术成为水稻产量提高和质量提升的一个重要工具。组织培养技术是转基因技术的重要组成部分，在水稻遗传转化和品种改良中被广泛应用。水稻遗传转化采用最多的体系为愈伤组织再生系统。粳稻品种愈伤诱导率较高，已经建立了高效的遗传转化体系，转基因育种在粳稻中已取得了可喜的成果；但占水稻品种80％以上的籼稻，由于愈伤组织诱导率低，造成籼稻遗传转化困难，严重制约了转基因技术在籼稻中的应用。
[0003]
水稻体细胞组织培养是水稻遗传转化的基础技术，在水稻遗传改良中具有重要的作用，因此，建立一个高效再生体系是实现基因遗传转化的先决条件。由于水稻成熟胚具有来源广、取材不受季节和地理环境限制、操作方便、不易污染等优点，水稻成熟胚是进行遗传操作的理想材料，但不同品种水稻的愈伤诱导率差别却很大；即使在理论最优的条件下，许多性状优良的籼稻品种的成熟胚的愈伤组织诱导率依然很低。传统方法上，对水稻成熟胚愈伤组织诱导的改良，往往是通过对培养基改良以及组培的其他方面采取措施来对愈伤组织进行诱导，例如，试用不同培养基、不同激素类型及浓度，在诱导培养基中添加少量激动素以提高愈伤组织的分化质量；加入有机附加物(如水解酪蛋白)以便改善某些品种的愈伤组织质量。然而，前人的研究结果表明，水稻的遗传背景决定了组培中诱导过程，影响水稻愈伤组织诱导的主要因素是水稻品种的基因型。水稻品种资源丰富，具有高水平的遗传多样性，利用传统方法，通过试用不同培养基、不同激素类型及浓度、对培养基改良以及组培的其他方面采取措施来对不同籼稻成熟胚愈伤组织诱导进行改良，不仅费时费力，而且还不一定获得理想结果。
[0004]
基于此，一种可以广适于籼稻材料的愈伤诱导前处理方法是本领域急需的。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的技术问题在于，本发明提供了一种可以广适于籼稻材料的愈伤诱导前处理方法。通过本发明的前处理后，可以在不调整传统方法使用的诱导培养基配方、激素类型及浓度条件下，提高籼稻的愈伤组织诱导率。利用本发明的前处理方法，不仅省时省力，而且加快籼稻遗传转化进度。
[0006]
本发明是通过如下手段实现的：
[0007]
一种提高籼稻成熟胚愈伤组织诱导的前处理方法，包括：
[0008]
(1)籼稻成熟胚去壳
[0009]
选取饱满、无霉变、成熟的籼稻种子。手工或微型脱壳机脱壳，注意保持胚完整。
[0010]
(2)前处理试剂配制
[0011]
30％的三氯异氰尿酸复合物和灭菌水，按照质量比配制质量浓度0.5％-1％的三氯异氰尿酸溶液，现配现用。
[0012]
(3)成熟胚前处理
[0013]
去壳的水稻种子用清水冲洗干净，无菌水漂洗3-5次。质量浓度0.5％-1％的三氯异氰尿酸溶液于25℃至37℃下浸泡去壳的水稻种子8-12h；无菌水漂洗3-5次，使用无菌滤纸吸干种子。
[0014]
(4)成熟胚消毒
[0015]
75％酒精处理三氯异氰尿酸溶液浸泡过的水稻种子2min，无菌水漂洗2-3次；5-10％的次氯酸钠消毒15-20min，或0.15％的氯化汞消毒12min，无菌水漂洗2-3次；无菌滤纸吸干种子；随后接种至愈伤组织诱导培养基。
[0016]
所述愈伤组织诱导培养基配方为：nb基本培养基+2,4-d(4mg/l)+蔗糖(30g/l)+植物凝胶phytagel(2.7g/l)，ph＝5.8。
[0017]
本发明的有益效果在于：
[0018]
本发明以去壳的籼稻种子，利用质量浓度0.5％-1％的30％三氯异氰尿酸溶液浸泡8-12h，而后按照传统方法进行种子消毒和接种于传统的诱导培养基，可以显著提高籼稻种子的出愈率和显著增加愈伤组织的质量，避免了传统方法中为提高愈伤组织诱导率而尝试调整诱导培养基配方、激素类型及浓度条件等繁琐工作，为解决籼稻诱导率比较低提供新的途径；本发明简便易行，不仅节省大量时间和精力，而且也促进遗传转化进程。
附图说明
[0019]
图1为使用1％的30％三氯异氰尿酸水溶液，浸泡93-11籼稻种子4-72h的愈伤组织诱导情况；a、b、c、d、e、f和g的处理时间分别为4h、8h、12h、24h、36h、48h和72h。
[0020]
图2为使用质量浓度1％的30％三氯异氰尿酸水溶液和水处理籼稻种子12h的愈伤组织诱导情况；a、b分别为水、1％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子12h。
具体实施方式
[0021]
实施例1
[0022]
一种提高籼稻成熟胚愈伤组织诱导的前处理方法，包括：
[0023]
(1)籼稻成熟胚去壳
[0024]
选取饱满、无霉变、成熟的籼稻种子。手工或微型脱壳机脱壳，注意保持胚完整。
[0025]
(2)前处理试剂配制
[0026]
30％的三氯异氰尿酸复合物和灭菌水，按照质量比配制质量浓度0.5％-1％的三氯异氰尿酸溶液，现配现用。
[0027]
(3)成熟胚前处理
[0028]
去壳的水稻种子用清水冲洗干净，无菌水漂洗3-5次。质量浓度0.5％-1％的三氯异氰尿酸溶液于25℃至37℃下浸泡去壳的水稻种子8-12h；无菌水漂洗3-5次。无菌滤纸吸干种子。
[0029]
(4)成熟胚消毒
[0030]
75％酒精处理三氯异氰尿酸溶液浸泡过的水稻种子2min，无菌水漂洗2-3次；5-10％的次氯酸钠消毒15-20min，或0.15％的氯化汞消毒12min，无菌水漂洗2-3次；无菌滤纸吸干种子。接种至愈伤组织诱导培养基。
[0031]
所述愈伤组织诱导培养基配方为：nb基本培养基+2,4-d(4mg/l)+蔗糖(30g/l)+植物凝胶phytagel(2.7g/l)，ph＝5.8。
[0032]
其中关键步骤(2)和(3)的具体实施过程为：
[0033]
1％的30％三氯异氰尿酸水溶液有效促进种子的发芽。使用1％的30％三氯异氰尿酸水溶液，浸泡93-11、mudgo等籼稻种子0-72h，前处理结束后，成熟胚消毒，每诱导培养基平皿接种10-12粒种子，每处理接种3皿。以水浸泡或没用水浸泡为对照，接种21天后，统计不同浓度浸泡不同时间成熟胚的出愈率。结果表明，处理12h的出愈率较高，具体结果如表1和图1所示。
[0034]
岀愈率计算方法试验结果按以下公式统计：
[0035]
岀愈率(％)＝长出愈伤组织的种子数/接种种子数
×
100％
[0036]
表1质量浓度1％三氯异氰尿酸溶液前处理12h时的出愈率
[0037][0038][0039]
根据表1结果可知，采用质量浓度为1％的三氯异氰尿酸溶液前处理，在前4h时，随着时间的增长，出芽率与出愈率也随之增长，但是到第8h时刻点时，出芽率与出愈率发生下降，达到12h时的出芽率与出愈率最高，随后开始逐渐下降。且达到12h时的出芽率与出愈率明显高于第1h、4h、8h、24h、36h、48h、72h各个时刻点，且差异有统计学意义(p＜0.05)。
[0040]
以1％为基点，配制质量浓度0.5％和1.5％的30％三氯异氰尿酸水溶液，分别浸泡93-11、mudgo等籼稻种子8h、12h和24h。前处理结束后，成熟胚消毒，每诱导培养基平皿接种10-12粒种子，每处理接种3皿。接种21天后，统计不同浓度浸泡不同时间成熟胚的出愈率。结果表明，质量浓度1.5％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理8h、12h和24h时均没有获得愈伤；质量浓度0.5％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理8h、12h和24h时均获得愈伤，以处理12h的出愈率较高，具体结果如表2所示。
[0041]
表2质量浓度0.5％和1.5％三氯异氰尿酸溶液前处理8、12和24h时的出愈率
[0042][0043]
以0.1％为递差，配制质量浓度0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％的30％三氯异氰尿酸水溶液。分别浸泡93-11、mudgo等籼稻种子8、12和24h。前处理结束后，成熟胚消毒，每诱导培养基平皿接种10-12粒种子，每处理接种3皿。接种21天后，统计不同浓度浸泡不同时间成熟胚的出愈率。结果表明，0.6％-0.9％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理8-12h能够获得较高的出愈率，具体结果如表3所示。
[0044]
表3使用质量浓度0.5％-1.5％三氯异氰尿酸溶液前处理8、12和24h时的出愈率
[0045][0046]
根据以上浓度梯度的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子0-72h的出愈率比较结果可知，0.5％-1％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子8-12h能够获得较高的出愈率。
[0047]
以质量浓度1％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子12h。前处理结束后，成熟胚消毒，每诱导培养基平皿接种10-12粒种子，每处理接种3皿。以水浸泡或没用水浸泡为对照，接种21天后，称量愈伤组织的质量，分析1％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子12h与以水浸泡之间是否具有显著差异。结果表明，质量浓度1％的30％三氯异氰尿酸水溶液处理籼稻种子12h与以水浸泡的愈伤质量之间具有显著差异，具体如表4和图2所示。
[0048]
表4使用和未使用三氯异氰尿酸溶液前处理12h的愈伤重量
[0049]
类别使用三氯异氰尿酸未使用三氯异氰尿酸重量(g)0.4667
±
0.1413
**
0.1191
±
0.0505
[0050]
注：**，p<0.01。
[0051]
以上结果表明，对于大多数籼稻种子，以质量浓度0.5％-1％的30％三氯异氰尿酸溶液浸泡8-12h，籼稻种子的出愈率较用水浸泡的显著提高，愈伤组织的质量也较用水浸泡的显著增加。
[0052]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术
方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。