一种劳损性膝骨关节炎动物模型的构建方法与流程

[0001]
本发明涉及膝关节炎研究领域，尤其涉及一种膝骨关节炎动物模型的构建方法。


背景技术：

[0002]
膝骨关节炎是一种包括遗传、代谢、发育、应力失衡、创伤、内分泌等生物性和机械性因素相互作用，最终导致膝关节软骨变性、软骨下骨硬化、软骨下骨囊肿和骨赘形成的慢性、进行性骨关节病。相关数据表明其发病率呈逐年上升趋势，并趋于年轻化。适宜的运动可以改善膝骨关节炎的发生发展，但高强度运动则可以造成小鼠创伤性膝关节炎。近年来，创伤性膝骨关节炎处于高发状态，对其机制的研究，病情的防治备受人们瞩目，其中理想的造模方式对其复杂的发病机制研究起着至关重要的作用。
[0003]
膝骨关节炎动物模型：宏观上可分为两大类：人为诱发性的动物模型和实验动物自发模型。目前，自然自发和基因敲除是最常见的自发性动物模型；诱发性动物模型有药物诱发、寒冷诱发、机械诱发、手术诱发等，其中手术方法中最为常见的是经典的前交叉韧带切断术、半月板失稳术、hulth法、半月板切除术、膝关节刻痕法、血液循环阻断法、应力改变等。为加快创伤性膝骨关节炎的研究进展，需要摸索建立一种高效、便捷、贴近临床实际的创伤性膝骨关节炎动物模型。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种膝骨关节炎动物模型的构建方法。
[0005]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006]
一种劳损性膝骨关节炎动物模型的构建方法，包括以下方法步骤：s1实验原料准备；配置实验用到的主要试剂，包括4％多聚甲醛、10
×
pbs、麻醉剂、各比例的乙醇、1％盐酸酒精、1％冰醋酸、引物；饲养实验将要用到的小鼠多只并在一周之后将spf级别8周龄和20周龄雄性c57bl/6小鼠分别按体重随机分为对照组、运动组、假手术组和手术组；准备跑台实验相关的实验器具；s2跑台运动培养；将8周龄和20周龄的运动组小鼠进行为期5周的跑台运动，每天下午进行跑台运动；周一到周五为训练日，周六周天休息，常规饲养；a1：第一周小鼠的运动适应周，每次60分钟，速度从0米/分钟开始以每天增加3米/分钟的速度逐渐递增到16米/分钟；a2：第二周到第五周为运动周，每次总运动时间为80分钟；让小鼠依次进行准备活动、匀速运动、放松运动；s3手术造模；对手术组和假手术组的小鼠在相同环境条件下进行手术，其中手术组小鼠利用手术将其膝关节处的半月板剪断，而假手术组的小鼠在同样的手术位置剪出1cm的口子再缝合；将经过手术的两组小鼠在同样的条件下进行术后恢复培养；s4生化指标检测；对四组小鼠分别进行病理检测；a1：血清检测；小鼠按体重腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血的方式收集血液，在室温环境下放置30分钟，之后使用常温离心机，以3000g的速度离心15min，吸取上层血清到新的无菌ep管中，得到小鼠血清样本(gag)；a2：膝关节软骨组织病理检测；迅速剃掉小鼠腿部肌肉及韧带，暴露小鼠的双侧膝关
节，清除膝关节周围的软组织及韧带等，获取左侧膝关节关节上下各1cm截断，进行固定，脱钙，石蜡包埋并切片；相对应的右膝将胫骨和股骨分离，用纱布包裹pbs浸湿放-80℃冰箱保存，一周内取胫骨平台、股骨内外侧髁部软骨总rna进行rt-pcr检测(collagen2 mrna、mmp9 mrna、tnf-αmrna和il-6mrna)；切片常规脱蜡脱水，自来水洗后进行不同组织化学染色；在100倍光镜下由两位独立观察者按oarsi评分标准和mankin’s评分标准进行评分，取两组均值作为最终得分；s5模型构建和数据分析；实验中所有数据结果均采用均数
±
标准差(x
±
sd)来进行表示，然后使用spss20.0软件进行分析处理；组内采用单因素方差分析，用bonferrori法进行组间两两比较；以p＜0.05表示结果具有显著差异；再对实验数据结果做图总结。
[0007]
优选的，在s2跑台运动培养中，共5周。第一周为适应周，速度0-16米/分钟，持续时间为60分钟，坡度5
°
，周六周日休息。第二至五周正式训练，方案如下。准备活动：持续十分钟，速度从0米/分钟逐渐递增到16米/分钟；匀速运动：持续60分钟，速度为16米/分钟；放松运动：持续十分钟，速度从16米/分钟逐渐递减到0米/分钟。坡度5
°
，周六周日休息。
[0008]
优选的，在s3手术造模中，所有手术组的小鼠按体重3ml/kg的量将小鼠进行腹腔内注射阿弗丁麻醉，然后用动物专用剃毛机剃净两侧膝关节周围的鼠毛并用75％乙醇脱脂棉球消毒；然后将小鼠仰卧固定在操作台上，用眼科镊夹起双侧膝关节内侧的皮肤，然后用普通的眼科剪轻轻的纵向剪开不长于1cm的切口；然后轻轻剪开皮肤与肌肉组织之间的黏膜，尽量避免剪断附着于黏膜上的血管造成出血，暴露内侧副韧带在手术视野的中央，使髌骨错位；用眼科剪横向剪断位于关节连接处的内侧副韧带并形成一个大小约5μm的切口，用眼科镊在内侧副韧带切口处轻轻划断半月板上下缘的关节囊，直至露出半透明状的半月板，用自制的牙周探针将内侧半月板勾出，用眼科剪剪断，切口处留下剪断的半月板以及内侧副韧带。
[0009]
优选的，在s4生化指标检测中，对切片分别进行he染色和番红固绿染色；he染色：切片在苏木精中浸染5min，水洗脱色(注意不要让水流直接冲刷切片以防组织脱落)，然后放入1％盐酸酒精中分化3秒，再放到伊红染液中染色3min，之后酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；在100倍光镜下由两位独立观察者按mankin’s评分标准进行评分，取两组均值作为最终得分；番红固绿染色：将切片浸入固绿浸染5min，水洗至软骨绿色较浅，再媒染剂染30秒，之后水洗3min，再放入番红o染液中30秒，酒精逐级脱水；二甲苯透明；中性树胶封片；在100倍光镜下由两位独立观察者按oarsi进行评分，取两组均值作为最终得分。
[0010]
优选的，在s4生化指标检测中，膝关节标本固定，脱钙后，逐级乙醇脱水(浓度70％、0％、90％、95％、100％乙醇)、二甲苯透明、浸蜡后腓骨一侧关节紧贴包埋盒底部包埋，切片机先切除多余组织，达软骨负重区，连续切片厚6.0μm，再对切片进行he和番红固绿染色处理。
[0011]
优选的，在s4生化指标检测中，real-time pcr检测包括以下步骤：a1组织rna提取：将膝关节软骨放入2ml的ep管中，加入1ml trizol，剪碎，再通过提取技术得到出其溶解rna沉淀物；a2提取rna的浓度和纯度鉴定；每孔2μl depc水清洗检测板后，检测本底值，每孔加入2μl待测样本在260nm处检测od值，浓度在200-300ng/μl之间最为适宜；rna纯度＝od260/od280，比值在1.8-2.0之间，符合实验要求；a3逆转录合成cdna；a4rt-pcr扩增，测collagen2 mrna、mmp9 mrna、tnf-α mrna和il-6 mrna表达水平。。
[0012]
优选的，在s4生化指标检测中，小鼠按体重腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血的方式收集血液，在室温环境下放置30分钟，之后使用常温离心机，以3000g的速度离心15min，吸取上层血清到新的无菌ep管中，得到小鼠血清样本(gag)。
[0013]
优选的，对实验中得到的小鼠数据进行总结分析，总结出其跑台运动和dmm手术对小鼠膝关节造成的影响。
[0014]
本发明的有益效果为：本发明中，通过实验构建动物模型，根据小鼠周龄与生理阶段分期，8周龄小鼠处于青春期阶段，20周龄小鼠处于中老年时期。本实验通过对spf级别8周龄和20周龄雄性c57bl/6小鼠进行运动干预，目的在于证明处于青春期的膝关节在收到大强度机械力作用的情况是否会产生软骨损伤，形成膝骨关节炎。本实验研究结果表明，8周龄小鼠在dmm手术和跑台运动的干预下出现oa程度的软骨损伤，尽管较20周龄各组损伤程度轻，但是各炎症指标和病理评分均显示有显著装差异。因此，实验证明青春期阶段虽然较中老年时期软骨形态规则，不易引发koa，但是在大强度外力作用下依然可以导致软骨损伤。提示8周龄小鼠可用于解释外力作用导致koa的机制研究模型。同时提醒处于青春期的人们不宜采用大强度的体育锻炼方式。
[0015]
最后，本实验证明跑台运动可以广泛应用于oa发病机制和治疗的研究。单纯高强度跑台运动能够成功诱导早期oa，符合人类原发性oa致病机理。同时关节腔手术或药物注射结合跑台运动可加速关节软骨退变，缩短oa造模时间。跑台运动方案包含诸如时间、强度、频率以及跑台坡度等多方面因素，后续研究可以尝试研究其中单个或多个指标对oa的影响以便为临床oa康复运动处方的制定提供借鉴。
附图说明
[0016]
图1为本发明的小鼠实验流程图；
[0017]
图2为8周龄小鼠体重的变化；
[0018]
图3为20周龄小鼠体重的变化；
[0019]
图4为不同造模方式对不同周龄小鼠膝关节he染色；
[0020]
图5为不同造模方式对不同周龄小鼠膝关节番红固绿染色；
[0021]
图6为不同造模方式对不同周龄小鼠膝关节软骨结构和软骨细胞的影响；
[0022]
图7为不同造模方式对不同周龄小鼠膝关节软骨钙化的影响；
[0023]
图8为不同造模方式对不同周龄小鼠膝关节collagen2 mrna、mmp9 mrna、tnf-α mrna和il-6 mrna表达水平影响；
[0024]
图9为不同造模方式对不同周龄小鼠血液gag影响。
具体实施方式
[0025]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0026]
参照图1-图9，一种劳损性膝骨关节炎动物模型的构建方法，包括以下方法步骤：s1实验原料准备；配置实验用到的主要试剂，包括4％多聚甲醛、10
×
pbs、麻醉剂、各比例的乙醇、1％盐酸酒精、1％冰醋酸、引物；饲养实验将要用到的小鼠多只并在一周之后将8周龄和20周龄小鼠分别按体重随机分为对照组、运动组、假手术组和手术组(dmm)；准备跑台实
验相关的实验器具；s2跑台运动培养；将spf级别8周龄和20周龄雄性c57bl/6的运动组小鼠进行为期5周的跑台运动，每天下午进行跑台运动；周一到周五为训练日，周六周天休息，常规饲养；a1：第一周小鼠的运动适应周，每次60分钟，速度从0米/分钟开始以每天增加3米/分钟的速度逐渐递增到16米/分钟；a2：第二周到第五周为运动周，每次总运动时间为80分钟；让小鼠依次进行准备活动、匀速运动、放松运动；s3手术造模；对手术组和假手术组的小鼠在相同环境条件下进行手术，其中手术组小鼠利用手术将其膝关节处的半月板剪断，而假手术组的小鼠在同样的手术位置剪出1cm的口子再缝合；将经过手术的两组小鼠在同样的条件下进行术后恢复培养；s4生化指标检测；对四组小鼠分别进行病理检测；a1：血清检测；小鼠按体重腹腔麻醉之后，通过摘眼球取血的方式收集血液，在室温环境下放置30分钟，之后使用常温离心机，以3000g的速度离心15min，吸取上层血清到新的无菌ep管中，得到小鼠血清样本(gag)；a2：膝关节软骨组织病理检测；迅速剃掉小鼠腿部肌肉及韧带，暴露小鼠的双侧膝关节，清除膝关节周围的软组织及韧带等，获取左侧膝关节关节上下各1cm截断，进行固定，脱钙，石蜡包埋并切片；相对应的右膝将胫骨和股骨分离，用纱布包裹pbs浸湿放-80℃冰箱保存，一周内取胫骨平台、股骨内外侧髁部软骨总rna进行rt-pcr检测，rt-pcr检测内容包括collagen2 mrna、mmp9 mrna、tnf-α mrna和il-6 mrna；切片常规脱蜡脱水，自来水洗后进行不同组织化学染色(he和番红固绿)；在100倍光镜下由两位独立观察者按oarsi评分标准和mankin’s评分标准进行评分，取两组均值作为最终得分；s5模型构建和数据分析；实验中所有数据结果均采用均数
±
标准差(x
±
sd)来进行表示，然后使用spss20.0软件进行分析处理；组内采用单因素方差分析，用bonferrori法进行组间两两比较；以p＜0.05表示结果具有显著差异；再对实验数据结果做图总结。
[0027]
在本实施例中，在s2跑台运动培养中，共5周。第一周为适应周，速度0-16米/分钟，持续时间为60分钟，坡度5
°
，周六周日休息；第二至五周正式训练，方案如下。准备活动：持续十分钟，速度从0米/分钟逐渐递增到16米/分钟；匀速运动：持续60分钟，速度为16米/分钟；放松运动：持续十分钟，速度从16米/分钟逐渐递减到0米/分钟。坡度5
°
，周六周日休息。
[0028]
在本实施例中，在s3手术造模中，所有手术组的小鼠按体重3ml/kg的量将小鼠进行腹腔内注射阿弗丁麻醉，然后用动物专用剃毛机剃净两侧膝关节周围的鼠毛并用75％乙醇脱脂棉球消毒；然后将小鼠仰卧固定在操作台上，用眼科镊夹起双侧膝关节内侧的皮肤，然后用普通的眼科剪轻轻的纵向剪开不长于1cm的切口；然后轻轻剪开皮肤与肌肉组织之间的黏膜，尽量避免剪断附着于黏膜上的血管造成出血，暴露内侧副韧带在手术视野的中央，使髌骨错位；用眼科剪横向剪断位于关节连接处的内侧副韧带并形成一个大小约5μm的切口，用眼科镊在内侧副韧带切口处轻轻划断半月板上下缘的关节囊，直至露出半透明状的半月板，用自制的牙周探针将内侧半月板勾出，用眼科剪剪断，切口处留下剪断的半月板以及内侧副韧带。
[0029]
在本实施例中，在s4生化指标检测中，对切片分别进行he染色和番红固绿染色；he染色：切片在苏木精中浸染5min，水洗脱色(注意不要让水流直接冲刷切片以防组织脱落)，然后放入1％盐酸酒精中分化3秒，再放到伊红染液中染色3min，之后酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；在100倍光镜下由两位独立观察者按mankin’s评分标准进行评分，取两组均值作为最终得分；番红固绿染色：将切片浸入固绿浸染5min，水洗至软骨绿色较浅，再媒染剂染30秒，之后水洗3min，再放入番红o染液中30秒，酒精逐级脱水；二甲苯透明；中
性树胶封片；在100倍光镜下由两位独立观察者按oarsi进行评分，取两组均值作为最终得分。
[0030]
在本实施例中，在s4生化指标检测中，膝关节标本固定，脱钙后，逐级乙醇脱水(浓度70％、0％、90％、95％、100％乙醇)、二甲苯透明、浸蜡后腓骨一侧关节紧贴包埋盒底部包埋，切片机先切除多余组织，达软骨负重区，连续切片厚6.0μm，再对切片进行染色处理。
[0031]
在本实施例中，在s4生化指标检测中，real-time pcr检测包括以下步骤：a1组织rna提取：将膝关节软骨放入2ml的ep管中，加入1ml trizol，剪碎，再通过提取技术得到出其溶解rna沉淀物；a2提取rna的浓度和纯度鉴定；每孔2μl depc水清洗检测板后，检测本底值，每孔加入2μl待测样本在260nm处检测od值，浓度在200-300ng/μl之间最为适宜；rna纯度＝od260/od280，比值在1.8-2.0之间，符合实验要求；a3逆转录合成cdna；a4rt-pcr扩增。
[0032]
在本实施例中，对实验中得到的小鼠数据进行总结分析，总结出其跑台运动和dmm手术对小鼠膝关节造成的影响。
[0033]
正常的膝关节关节面光滑，有光泽，无裂隙，潮线完整，软骨细胞排列规则且紧密。通过对小鼠膝关节进行he染色，运用mankin’s评分标准评价关节软骨表面和软骨细胞变化情况。跑台运动和dmm手术均造成小鼠膝关节软骨表面有不规则的裂隙,软骨细胞排列紊乱且数量减少。与正常组相比，run组软骨表面损伤严重，软骨细胞数量减少并排列不规则；与sham组相比，dmm软骨表面有裂隙，软骨细胞出现簇集，有显著性差异。其中8周龄小鼠run组与dmm组相比损伤程度较严重，且有显著性差异，20周龄小鼠dmm组和run组软骨细胞均出现细胞数量减少，排列不规则现象，但不存在显著性差异。
[0034]
关节软骨放射层与钙化软骨之间有一种特殊的染色线，称之为潮线，通过番红固绿染色和oarsi评分可以明显地观察到潮线是够完整，软骨是否出现钙化，且能够判断是否有血管从软骨下骨穿过钙化软骨到达潮线并作出比较。番红主要染软骨组织为红色，固绿主要染骨组织为浅绿色。与正常组相比，跑台运动造成潮线破坏，软骨钙化现象；与sham组相比，dmm手术也出现潮线破坏，软骨钙化的现象，且dmm组较run组更为严重，且有显著性差异。
[0035]
小鼠跑台运动干预结束后，提取各组小鼠右膝关节，去除附着的肌肉韧带组织，摘取各组膝关节软骨提取总rna，运用荧光定量pcr检测小鼠右膝关节软骨中促炎性细胞因子tnf-α，il-6，mmp9和collagen2 mrna水平。dmm手术和跑台干预加剧了关节软骨中二型胶原纤维的损伤，20周龄小鼠collagen2 mrna的水平较8周龄低但无显著性差异；促炎性细胞因子tnf-αmrna水平，跑台运动较正常组，dmm手术较sham组均出现显著上调，且有显著性差异；促炎性细胞因子mmp9mrna水平，跑台运动较正常组，dmm手术较sham组均出现显著上调，并且8周龄组的小鼠，run组与dmm组相比明显升高，均有显著性差异；促炎性细胞因子il-6mrna水平，跑台运动相较正常组，dmm手术相较于sham组均出现显著上调，并且8周龄和20周龄小鼠run组较dmm组明显升高，均有显著性差异。
[0036]
跑台运动与dmm手术两种造模方式均可造成c57bl/6小鼠膝关节软骨损伤，诱发koa，证明跑台运动可作为koa机制研究的小鼠模型构建方法；跑台运动均可造成青壮年和中老年期小鼠koa，从而为低周龄小鼠koa机制研究提供了运动模型构建方案。
[0037]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时
针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0038]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0039]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。