一种肝组织保存液及其保存方法和应用与流程

文档序号:30348639发布日期:2022-06-08 10:02阅读:153来源:国知局

1.本发明涉及生物学试剂技术领域,具体涉及一种肝组织保存液及其保存方法和应用。


背景技术:

2.研究显示,ii期和iii期新药临床试验在安全性上的失败率分别达到25%和14%[harrison rk. phase ii and phase iii failures: 2013

2015. nat rev drug discov. 2016; 15(12):817

8]。另一研究显示1950-2014年上市后撤市的首要原因为不良反应,其中肝毒性居首位,其次为免疫相关反应,再次为心肌毒性[onakpoya ij, heneghan cj,aronson jk. post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. bmc med. 2016; 14:10.]。因此,在新药开发的早期阶段更快速的发现药物开发可能的失败风险能够提高药物研发成功率并节约药物开发成本。
[0003]
新药进行非临床安全性评价前使用原代肝细胞进行候选化合物肝毒性评价可对化合物进一步筛选,可能降低非临床安全性评价和临床研究中失败的风险。
[0004]
目前小鼠、大鼠等原代肝细胞分离采用整肝灌流法。然而由于种属差异,使用来源于人肝组织的原代肝细胞进行的肝毒性评价更能预测后续研究的风险。
[0005]
目前临床上能获取的用于原代肝细胞分离人体肝组织多为碎肝组织,肝组织相溶酶体等含量较为丰富,离体后碎肝组织中凋亡或坏死的细胞释放的各种酶易引发其他细胞的损伤,经储存和运输后进行原代肝细胞的分离成功率极低,分离的肝细胞不能贴壁并很快死亡。离体后应立即进行细胞分离才能获得成活率和纯度可用于试验的原代肝细胞。这无疑限制了原代肝细胞的获取和应用。


技术实现要素:

[0006]
本发明的目的在于提供一种肝脏组织保存液,其能够减缓肝组织离体后细胞的损伤,进而能够储存和运输,提高原代肝细胞分离的成功率。
[0007]
为实现上述目的,本发明提供了一种肝组织保存液,包括半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)抑制剂、还原型谷胱甘肽、受体作用蛋白激酶3(rip3)抑制剂、胎牛血清、青链霉素双抗的高糖dmem培养基。
[0008]
所述caspase-9抑制剂为z-lehd-fmk或z-lehd-fmktfa,z-lehd-fmk或z-lehd-fmktfa的浓度为1um-5um。
[0009]
所述还原型谷胱甘肽的浓度为60-120mg/l。
[0010]
rip3抑制剂为gsk840、gsk843、gsk2593074a、gsk872和hs1371中的任意一种,gsk840浓度为0.5-1um, gsk843浓度为1-3um, gsk2593074a浓度为1-3nm, gsk872浓度为1-3um,hs1371浓度为5-15um。
[0011]
所述胎牛血清浓度为10-20%。
[0012]
所述青链霉素双抗浓度为1-2%。
[0013]
本发明所述肝组织保存液用于肝组织的运输和保存。
[0014]
肝组织的保存方法为将离体的肝组织置于权利要求1-7所述肝组织保存液中降温保存。
[0015]
所述肝组织保存液和肝组织的体积比不小于5:4。
[0016]
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:目前尚无专用的人肝脏组织保存液。通用组织保存液的组织保存液对于肝脏组织并不适用。本发明征对肝脏组织的特点,在dmem中添加了凋亡和坏死相关因子抑制剂以及抗氧化剂还原型谷胱甘肽,从而消除或降低肝组织保存和运送过程中的损伤,使人肝组织原代细胞的分离实现异地取材,并提高原代肝细胞分离的成功率。
[0017]
使用本发明所述的肝组织保存液保存碎肝组织24小时,成功分离获得原代肝细胞,成活率达90%以上,纯度96%以上。
具体实施方式
[0018]
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0019]
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0020]
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可以从商业途径得到。
[0021]
实施例1:肝组织保存液的配制z-lehd-fmk溶于dmso配制成1mm的溶液,还原型谷胱甘肽溶于去离子水配制成10mg/ml的溶液,gsk843溶于dmso配制成3mm的溶液。
[0022]
准备100ml容量瓶,加入60ml的dmem, 然后加入胎牛血清10ml,混匀;接着加入青链霉素双抗1ml,混匀。加入10mg/ml的还原型谷胱甘肽1ml,混匀。加入1mm的z-lehd-fmk溶液100ul,混匀。最后加入3mm的gsk843溶液100ul,混匀。
[0023]
用dmem培养基定容至100ml,颠倒混匀,即得肝组织保存液。
[0024]
表1.肝组织保存液的配方试剂用量最终浓度gsk843(3mm)100ul3umz-lehd-fmk(1mmm)100ul1um还原型谷胱甘肽(10mg/ml)1ml100mg/lfbs10ml10%青链霉素双抗1ml1%dmem87.8ml88.8%实施例2:肝组织保存液的配制z-lehd-fmktfa溶于dmso配制成2.5mm的溶液,还原型谷胱甘肽溶于去离子水配制成10mg/ml的溶液,hs1371溶于dmso配制成10mm的溶液。
[0025]
准备100ml容量瓶,加入50ml的dmem, 然后加入胎牛血清20ml,混匀;接着加入青链霉素双抗2ml,混匀。加入10mg/ml的还原型谷胱甘肽1.2ml,混匀。加入2.5mm的z-lehd-fmktfa溶液100ul,混匀。最后加入10mm的hs1371溶液100ul,混匀。
[0026]
用dmem培养基定容至100ml,颠倒混匀,即得肝组织保存液。
[0027]
表2.肝组织保存液的配方试剂用量最终浓度hs1371(10mm)100ul10umz-lehd-fmktfa(2.5mm)100ul2.5um还原型谷胱甘肽(10mg/ml)1.2ml120mg/lfbs20ml20%青链霉素双抗2ml2%dmem76.6ml76.6%实施例3:肝组织保存液保存的人碎肝组织分离提取原代肝细胞分别使用表1和表2制备的肝组织保存液保存临床获得的碎肝组织24小时,同时用含10%fbs和1%青链霉素双抗的dmem作为对照。
[0028]
肝组织保存液保存24小时的碎肝组织使用申请公布号为cn 108070551 a中所提供的方法进行分离培养。
[0029]
三种保存液保存24小时候进行原代肝细胞分离提取和培养,所得原代肝细胞的成活率和纯度见表3。
[0030]
表3. 配方肝组织保存液、配方肝组织保存液、对照保存液保存人碎肝组织后分离提取培养的原代肝细胞成活率和纯度保存液成活率纯度配方肝组织保存液90.2%97.4%配方肝组织保存液92.5%96.1%对照保存液分离的肝细胞接种后未能贴壁未成功分离培养细胞以上所述,仅为本发明较佳的实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内做出任何修改,等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围内。
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