转基因哺乳动物及其使用方法与流程

转基因哺乳动物及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月1日提交的美国临时申请第62/869,415号的优先权，该美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表，所述序列表已经以ascii格式电子地提交并且在此通过引用以其整体并入本文。于2020年6月23日生成的所述ascii副本被命名为0133-0007wo1_sl.txt并且大小为119,740字节。
发明领域
5.本发明涉及免疫球蛋白分子的产生，包括用于产生能够产生用于产生单克隆抗体的牛科动物抗原特异性抗体分泌细胞的转基因哺乳动物的方法。
6.背景
7.在以下讨论中，出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本技术人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的文章和方法不构成现有技术的权利。
8.抗体已经成为重要的生物药物，因为它们(i)表现出可以靶向不同分子形式的抗原的精准结合特性，(ii)是具有使其在治疗的人类和动物中良好耐受的期望药代动力学的生理分子，并且(iii)与天然抵御感染原(infectious agent)的强大免疫特性关联。此外，存在已建立的用于从实验室动物快速分离抗体的技术，所述技术可以容易地针对任何事实上不天然存在于身体中的外来物质产生特异性抗体反应。
9.在抗体的最基本形式中，抗体包括各自与相同的轻(l)链配对的两条相同的重(h)链。h链和l链二者的n-末端包括可变结构域(分别地，vh和v
l
)，所述可变结构域一起为配对的h-l链提供独特的抗原结合特异性。
10.编码抗体vh和v
l
结构域的外显子不存在于种系dna中。而是，每一个vh外显子由存在于免疫球蛋白h链基因座(igh)中的随机选择的vh、d和jh基因区段的重组产生；同样，单独v
l
外显子由轻链基因座中随机选择的v
l
和j
l
基因区段的染色体重排产生。
11.牛科动物基因组包含可以表达h链的两个等位基因(一个等位基因来自各自亲本)、可以表达kappa(κ)l链的两个等位基因和可以表达lambda(λ)l链的两个等位基因。在h链基因座处存在多个vh、d和jh基因区段，以及在免疫球蛋白κ(igk)和免疫球蛋白λ(igl)l链基因座二者处存在多个v
l
和j
l
基因区段(collins和watson(2018)immunoglobulin light chain gene rearrangements,receptor editing and the development of a self-tolerant antibody repertoire.front.immunol.9:2249.(doi:10.3389/fimmu.2018.02249))。
12.在典型的免疫球蛋白重链可变区基因座中，vh基因区段位于jh基因区段的上游(5’)，其中d基因区段位于vh与jh基因区段之间。igh基因座的jh基因区段的下游(3’)是编码抗体恒定区(ch)的外显子簇。每一个ch外显子簇编码不同的抗体类别(同种型)。小鼠中存在
八种抗体类别：igm、igd、igg3、igg1、igg2a(或igg2c)、igg2b、ige和iga(在核酸水平，它们分别被称为：μ、δ、γ3、γ1、γ2a/c、γ2b、ε和α)。在牛科动物中，推定的同种型是igm、igd、igg、ige和iga(图12a)。牛科动物igg和两种igm存在三种亚型。具有两种igm亚型的功能性后果尚不清楚，尽管超长cdr h3抗体似乎表现出专有地使用igm2。(stanfield等人(2018)the unusual genetics and biochemistry of bovine immunoglobulins adv.immunol.137:136-164(doi:10.1016/bs.ai.2017.12.004)。牛科动物igh基因座是小的，为～680kb。
13.是否存在牛科动物igd的问题始终存在争议。早期的研究未发现奶牛中存在cδ基因或igd蛋白的证据(butler，等人(1996)the swine ig heavy chain locus has a single j
h and no identifiable igd.int.immunol.8:1897-1094(doi:10.1093/intimm/8.12.1897)；naessens j(1997)surface ig on b lymphocytes from cattle and sheep.int.immunol.9:349-354(doi:10.1093/intimm/9.3.349)。随后，已经报道了关于以下的证据：牛科动物cδ基因的存在(zhao，等人(2002)j.immunol.artiodactyl igd:the missing link.160:4408-4416(doi:10.4049/jimmunol.169.8.4408)和牛科动物igd的表达(xu，等人(2012)plos one expressional analysis of immunoglobulin din cattle(bos taurus),a large domesticated ungulate.7:e44719.(doi.org/10.1371/journal.pone.0044719)，尽管igd
+
细胞的频率比小鼠中的低得多。目前牛科动物igh基因座的注释列出了5个cδ基因，ighdd1p、ighdd2p、ighdd39和ighd，它们中没有一个是功能性的。存在两个ighd等位基因，一个是由于m1中的移码导致的假基因，并且另一个是由于非典型剪接供体ngc导致的orf而不是ngt导致的orf。xu等人观察到的igd
+
细胞的低频率可能是由于偶然的orf等位基因的漏剪接。
14.在大多数哺乳动物物种的igk基因座处，一簇v
κ
基因区段位于少量j
κ
基因区段的上游，其中j
κ
基因区段簇位于单个c
κ
基因的上游。κ基因座的这种组织可以表示为(v
κ
)a...(j
κ
)b...c
κ
，其中a和b独立地是1或更大的整数。牛科动物igk基因座是小的，为～400kb。
15.大多数物种的igl基因座包括位于可变数量的j-c串联盒5’的一组v
λ
基因区段，每一个串联盒由一个j
λ
基因区段和一个c
λ
基因区段构成(参见图12b中的牛科动物igl基因座的示意图)。λ基因座的组织可以表示为(v
λ
)a...(j
λ-c
λ
)b，其中a和b独立地是1或更大的整数。小鼠igl基因座的不寻常之处在于，它包含两个单元的(v
λ
)a……
(j
λ-c
λ
)b。牛科动物igl基因座是小的，为～580kb。
16.在b细胞发育期间，基因重排首先发生在包含h链可变基因区段的两条同源染色体中的一条上。然后，所得vh外显子在rna水平剪接至c
μ
外显子，用于igm h链表达。随后，v
l-j
l
重排每一次发生在一个l链等位基因上，直到产生功能性l链，之后l链多肽可以与igm h链同源二聚体缔合以形成针对抗原的完全功能性b细胞受体(bcr)。在小鼠和人类中，随着b细胞继续成熟，igd与igm共表达，其中igd以比主要b细胞群体中的igm高10倍的水平表达。
17.本领域的专家普遍认为，在小鼠和人类中，v
l-j
l
重排首先发生在两条染色体上的igk基因座处，然后任一条染色体上的igl轻链基因座变得接受v
l-j
l
重组。这得到了以下观察的支持：在表达κ轻链的小鼠b细胞中，两条染色体上的λ基因座通常因无效重排(non-productive rearrangement)而失活。这可以解释小鼠中》90％κ且《10％λ的主要κl链使用。
18.然而，κ与λ免疫球蛋白的比率因物种而异。许多牲畜和伴侣动物是高度地以λ为主
的，其中牛产生大约91％的λ链。arun等人(1996)immunohistochemical examination of light chain expression(lambda/kappa ratio)in canine,feline,equine,bovine and porcine plasma cells.zentralblatt f
ü
rreihe a.43:573-576.
19.在遇到抗原后，b细胞然后在igh基因座处经历另一轮dna重组，以去除c
μ
和c
δ
外显子，有效地将ch区转换至下游同种型之一(这一过程被称为类别转换)。
20.编码各种牛科动物(例如家养牛)和小鼠免疫球蛋白的基因已经被表征，但是基因组数据库中牛科动物ig基因座的序列和注释尚未完成。例如，sinclair等人在j.immunol.,159(8):3883-89(1997)中将牛科动物igg库描述为以单个多样化的vh基因区段家族为主；lopez等人在immunol.rev.162(1):55-66(1998)中将单个vh家族和长cdr3描述为用于牛科动物igg重链中高频突变的靶；hosseini等人在int.immunol.16(6):355-63(1998)中展示了牛科动物jh基因座的复制拷贝有助于ig库；wang等人在cell,153(6):1379-1393(2013)中描述了，某些牛科动物抗体中的抗原结合位点为超长cdr3环，每个环都具有带有突出旋钮(projecting knob)的柄，该突出旋钮可以通过改变cys残基的数量以及在体细胞上产生的二硫键的模式和连接性进一步在体细胞上多样化。blankenstein和krawinkel在eur.j.immunol.,17:1351-1357(1987)中描述了小鼠可变重链区。
21.转基因动物诸如具有各种免疫球蛋白基因座的小鼠的产生已经允许在各种研究和开发应用中例如在药物发现和对各种生物系统的基础研究中使用这样的转基因动物。例如，携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠的产生描述于国际申请wo 90/10077和wo 90/04036中。wo 90/04036描述了具有整合的人类免疫球蛋白“微(mini)”基因座的转基因小鼠。wo 90/10077描述了用于在产生转基因动物中使用的包含免疫球蛋白显性控制区的载体。
22.已经开发了用于用例如人类免疫球蛋白序列修饰小鼠内源免疫球蛋白可变区基因座以产生用于药物发现目的的部分或完全人类抗体的许多方法。这样的小鼠的实例包括以下中描述的那些：例如，美国专利第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；和第5,591,669号。然而，许多完全人源化免疫球蛋白转基因小鼠表现出次优的抗体产生，因为这些小鼠中的b细胞发育受到低效率的v(d)j重组以及受到完全人类抗体/bcr不能与小鼠信号传导蛋白一起发挥最佳功能的严重阻碍。由于用同线(syntenic)人类对应序列取代单独小鼠外显子的方法，因此其中小鼠编码序列已经与人类序列“交换”的其他人源化免疫球蛋白转基因小鼠是非常耗时且昂贵的。
23.发挥作为药物的功能的抗体的使用不一定限于人类疾病的预防或疗法。现代集约化管理的牲畜作业的高群体密度导致共有共栖菌群和病原体二者，这导致感染原的快速传播。因此，牲畜通常要求积极的感染管理策略，这通常包括使用抗生素。抗生素的大量使用有利于抗性微生物的生长，危及农场动物和食用它们的人类。因此，降低或消除家畜(诸如牛)使用抗生素的压力越来越大。
24.基于前述，对于产生用于治疗家养牛中疾病的牛科动物抗体的有效且有成本效益的方法存在明显需求。更特别地，对于能够产生抗原特异性牛科动物免疫球蛋白的可以用于产生能够大规模产生牛科动物单克隆抗体的杂交瘤的小型、快速繁殖的哺乳动物存在需
求。
25.概述
26.提供本概述是为了以简化的形式介绍概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。本概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从以下撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是明显的。
27.本文描述了具有包含外源引入的部分牛科动物免疫球蛋白基因座的基因组的非牛科动物哺乳动物细胞和非牛科动物哺乳动物，其中引入的基因座包含牛科动物免疫球蛋白可变区基因区段的编码序列和基于非牛科动物哺乳动物宿主的内源免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列。因此，非牛科动物哺乳动物细胞或哺乳动物能够表达嵌合b细胞受体(bcr)或抗体，所述嵌合b细胞受体(bcr)或抗体包含与对非牛科动物哺乳动物宿主细胞或哺乳动物天然的各自恒定区结合的是完全牛科动物的h链和l链可变区。在一方面，转基因细胞和动物具有其中部分或全部内源免疫球蛋白可变区基因座被去除的基因组。
28.至少，在非牛科动物哺乳动物宿主中产生嵌合牛科动物单克隆抗体要求宿主具有表达嵌合牛科动物免疫球蛋白h链或l链的至少一个基因座。在大多数方面，存在分别表达嵌合牛科动物免疫球蛋白h链和l链的一个重链基因座和两个轻链基因座。
29.在一些方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物vh编码序列和存在于非牛科动物哺乳动物宿主的内源vh基因座中的非编码调控或支架序列。在这些方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座还包含与存在于非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源d和jh基因区段邻近处的非编码调控或支架序列结合的牛科动物d和jh基因区段编码序列。
30.在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含在存在于非牛科动物哺乳动物宿主的内源免疫球蛋白重链基因座中的非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物vh、d和jh基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含在存在于啮齿类动物诸如小鼠的内源免疫球蛋白重链基因座中的非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物vh、d和jh基因区段编码序列。在其他方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
l
编码序列和存在于非牛科动物哺乳动物宿主的内源v
l
基因座中的非编码调控或支架序列。在一方面，包含牛科动物v
l
编码序列的外源引入的部分牛科动物免疫球蛋白基因座还包含牛科动物l-链j基因区段编码序列和存在于非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源l-链j基因区段邻近处的非编码调控或支架序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含在存在于非牛科动物哺乳动物宿主细胞的免疫球蛋白轻链基因座中的非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含在存在于非牛科动物哺乳动物宿主的免疫球蛋白基因座中的非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列。在一方面，非牛科动物哺乳动物宿主的内源κ基因座是失活的或被编码牛科动物λ链的序列取代，以相比于牛科动物κ链增加牛科动物λ免疫球蛋白轻链的产生。在一方面，非牛科动物哺乳动物宿主的内源κ基因座是失活的，但未被编码牛科动物λ链的序列取代。
31.在某些方面，非牛科动物哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。
32.在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包括含有一个或更多个牛科动物λ可变区基因区段编码序列的部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座。在一方面，工程化免疫球蛋白基
因座是含有一个或更多个牛科动物κ可变区基因区段编码序列的部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座。
33.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的基因组。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座的基因组。在一方面，啮齿动物或啮齿动物细胞的部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含一个或更多个牛科动物免疫球蛋白λ可变区基因区段编码序列。在一方面，啮齿动物或啮齿动物细胞的部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含一个或更多个牛科动物免疫球蛋白κ可变区基因区段编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座能够表达包含牛科动物可变结构域的免疫球蛋白。
34.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物产生的包含λ轻链的免疫球蛋白比包含κ轻链的免疫球蛋白更多。在一方面，转基因啮齿动物产生至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的λ轻链免疫球蛋白。在一方面，转基因啮齿动物产生至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的包含牛科动物可变结构域的λ轻链免疫球蛋白。在一方面，从转基因啮齿动物分离出产生λ轻链的细胞的可能性比分离出产生κ轻链的细胞更大。在一方面，从转基因啮齿动物分离出产生具有牛科动物可变结构域的λ轻链的细胞的可能性比分离出产生具有牛科动物可变结构域的κ轻链的细胞更大。
35.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物细胞产生包含λ轻链的免疫球蛋白的可能性比产生包含κ轻链的免疫球蛋白更大。在一方面，啮齿动物细胞从本文描述的转基因啮齿动物分离出。在一方面，啮齿动物细胞如本文描述地通过重组产生。在一方面，转基因啮齿动物细胞或其后代具有至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的概率产生λ轻链免疫球蛋白。在一方面，转基因啮齿动物细胞或其后代具有至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的概率产生具有牛科动物可变结构域的λ轻链免疫球蛋白。
36.在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
基因区段编码序列和j
λ
基因区段编码序列以及啮齿动物免疫球蛋白轻链可变区基因座的非编码序列诸如调控或支架序列。
37.在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的非编码调控或支架序列中的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和j
λ
基因区段编码序列以及一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白λ恒定区编码序列。
38.在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j-c单元，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
区编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个
牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j-c单元，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
区编码序列和非编码序列。在一方面，啮齿动物c
λ
区编码序列选自啮齿动物c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
编码序列。在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j-c单元的上游，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
基因区段编码序列。在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j-c单元的上游，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
非编码序列。在一方面，j-c单元包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的非编码调控或支架序列中的牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
区编码序列。
39.在一方面，提供了具有工程化免疫球蛋白基因座的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述工程化免疫球蛋白基因座包含啮齿动物免疫球蛋白κ基因座，其中一个或更多个啮齿动物v
κ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物j
κ
基因区段编码序列已经缺失并且分别被一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j
λ
基因区段编码序列取代，并且其中该基因座中的啮齿动物c
κ
编码序列已经被一个或更多个啮齿动物c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
编码序列取代。
40.在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含位于一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列上游并且与该一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列在相同转录方向的一个或更多个牛科动物v
λ
基因片段编码序列，所述一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
编码序列上游。
41.在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含位于一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列上游并且与该一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列在相对转录方向的一个或更多个牛科动物v
λ
基因片段编码序列，所述一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
编码序列上游。
42.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中内源啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座因以下中的一种或更多种而缺失、失活或成为非功能性的：
43.a.缺失或突变全部内源啮齿动物v
κ
基因区段编码序列；
44.b.缺失或突变全部内源啮齿动物j
κ
基因区段编码序列；
45.c.缺失或突变内源啮齿动物c
κ
编码序列；
46.d.缺失或突变j
κ
基因区段与c
κ
外显子之间的内含子中的剪接供体位点、嘧啶区(pyrimidine tract)或剪接受体位点；和
47.e.缺失、突变或破坏内源内含子κ增强子(intronicκenhancer,ie
κ
)、3’增强子序列(3’e
κ
)或其组合。
48.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中内源啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变结构域的表达因以下中的一种或更多种而受抑制或失活：
49.a.缺失或突变全部内源啮齿动物v
λ
基因区段；
50.b.缺失或突变全部内源啮齿动物j
λ
基因区段；
51.c.缺失或突变全部内源啮齿动物c
λ
编码序列；和
52.d.缺失或突变j
λ
基因区段与c
λ
外显子之间的内含子中的剪接供体位点、嘧啶区或剪接受体位点，或其组合。
53.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的免疫球蛋白轻链。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物λ可变结构域和啮齿动物λ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物κ可变结构域和啮齿动物κ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。
54.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的基因组包含工程化免疫球蛋白基因座，该工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列。在一方面，牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列插入到啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在一方面，牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中。在一方面，牛科动物v
κ
和j
κ
编码序列插入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区编码序列的上游。
55.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的基因组包含工程化免疫球蛋白基因座，该工程化免疫球蛋白基因座包含插入到啮齿动物免疫球蛋白λ轻链基因座中的牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列。在一方面，牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列嵌入啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中。在一方面，转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的基因组包含插入在牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列下游的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区编码序列。在一方面，啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区插入在内源啮齿动物c
λ
编码序列的上游。在一方面，啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区插入内源啮齿动物c
λ2
编码序列的上游。在一方面，内源啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变结构域的表达因以下中的一种或更多种而受抑制或失活：
56.a.缺失或突变全部内源啮齿动物v
λ
基因区段编码序列；
57.b.缺失或突变全部内源啮齿动物j
λ
基因区段编码序列；
58.c.缺失或突变全部内源c
λ
编码序列；和
59.d.缺失或突变j
λ
基因区段与c
λ
外显子之间的内含子中的剪接供体位点、嘧啶区或剪接受体位点。
60.在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含啮齿动物内含子κ增强子(ie
κ
)和3’κ增强子(3’e
κ
)调控序列。
61.在一方面，转基因啮齿动物或啮齿动物细胞还包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物免疫球蛋白重链可变区基因区段编码序列和啮齿动物免疫球蛋白重链基因座的非编码调控和支架序列。在一方面，工程化牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物vh、d和jh基因区段编码序列。在一方面，每个牛科动物/啮齿动物嵌合vh、d或jh基因区段包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白重链基因座的非编码调控和支架序列中的vh、d或jh编码序列。在一方面，重链支架序列被一个或两个功能性adam6基因间隔开。
62.在一方面，啮齿动物调控和支架序列包含一个或更多个增强子、启动子、剪接位点、内含子、重组信号序列或其组合。
63.在一方面，转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的内源啮齿动物免疫球蛋白基因座已
经失活。在一方面，转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的内源啮齿动物免疫球蛋白基因座已经缺失，并且被工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代。
64.在一方面，啮齿动物是小鼠或大鼠。在一方面，啮齿动物细胞是胚胎干(es)细胞或早期胚胎的细胞。在一方面，啮齿动物细胞是小鼠或大鼠胚胎干(es)细胞或者小鼠或大鼠早期胚胎的细胞。
65.在一方面，提供了从本文描述的转基因啮齿动物获得的b淋巴细胞谱系细胞，其中b细胞表达或能够表达包含牛科动物可变区和啮齿动物免疫球蛋白恒定区的嵌合免疫球蛋白重链或轻链。在一方面，提供了来源于从本文描述的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞获得的b淋巴细胞谱系细胞的杂交瘤细胞或永生化细胞系。
66.在一方面，提供了由来自本文描述的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的细胞产生的抗体或其抗原结合部分。
67.在一方面，提供了来源于由本文描述的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞产生的免疫球蛋白的vh、d或jh或者v
l
或j
l
基因区段编码序列的核酸序列。在一方面，提供了一种用于产生包含部分牛科动物免疫球蛋白基因座的非牛科动物哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：a)将两个或更多个重组酶靶向位点引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞的基因组中，并且将至少一个位点整合在包含内源免疫球蛋白可变区基因的基因组区域的上游并且将至少一个位点整合在下游，其中内源免疫球蛋白可变基因包含vh、d和jh基因区段，或者v
κ
和j
κ
基因区段，或者v
λ
和j
λ
基因区段，或者v
λ
、j
λ
和c
λ
基因区段；和b)经由重组酶介导的盒交换(rmce)将工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞中，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座包含牛科动物免疫球蛋白可变区基因编码序列和非编码调控或支架序列，所述非编码调控或支架序列对应于存在于非牛科动物哺乳动物宿主的内源免疫球蛋白可变区基因座中的非编码调控或支架序列。
68.在另一方面，方法还包括在步骤b之前使侧翼为两个外源引入的重组酶靶向位点的基因组区域缺失。
69.在特定方面，提供了外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座，所述外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物vh基因区段编码序列，并且还包含i)牛科动物d和jh基因区段编码序列和ii)牛科动物d基因区段上游的非编码调控或支架序列(前d序列，图1a)，该非编码调控或支架序列对应于存在于非牛科动物哺乳动物宿主的基因组中内源d基因区段上游的序列。在一方面，这些上游支架序列被非免疫球蛋白基因间隔开，所述非免疫球蛋白基因诸如雄性生育力所需的adam6a或adam6b(图1a)(nishimura等人developmental biol.233(1):204-213(2011))。使用先前已经被引入到同一染色体上内源免疫球蛋白vh基因座的上游和内源jh基因座的下游的重组酶靶向位点将部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座引入到宿主细胞中。
70.在其他方面，非编码调控或支架序列(至少部分地)来源于其他来源，例如，它们可以是合理设计的人工序列或其他未知功能的保守序列、牛科动物和人工或其他设计序列的组合的序列，或者来自其他物种的序列。如本文使用的，“人工序列”是指不来源于遗传基因座处自然存在的序列的核酸序列。在一方面，非编码调控或支架序列来源于啮齿动物免疫球蛋白重链可变区基因座的非编码调控或支架序列。在一方面，非编码调控或支架序列与啮齿动物免疫球蛋白重链可变区基因座的非编码调控或支架序列具有至少约75％、80％、
85％、90％、95％或100％的序列同一性。在另一方面，非编码调控或支架序列是啮齿动物免疫球蛋白重链可变区非编码或支架序列。
71.在方法的又另一特定方面，引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物免疫球蛋白v
l
基因区段编码序列，并且还包含i)牛科动物l链j基因区段编码序列和ii)非编码调控或支架序列，该非编码调控或支架序列对应于存在于非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源l链基因座中的非编码调控或支架序列。在一方面，使用先前已经被引入到同一染色体上内源免疫球蛋白v
l
基因座的上游和内源j基因座的下游的重组酶靶向位点将工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座引入到宿主细胞中。
72.在更特定方面，提供了一种外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座，所述外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含牛科动物v
λ
基因区段编码序列和牛科动物j
λ
基因区段编码序列。在一方面，使用先前已经被引入到同一染色体上内源免疫球蛋白v
λ
基因座的上游和内源j
λ
基因座的下游的重组酶靶向位点将部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座引入到宿主细胞中。
73.在一方面，外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含牛科动物v
κ
基因区段编码序列和牛科动物j
κ
基因区段编码序列。在一方面，使用先前已经被引入到同一染色体上内源免疫球蛋白v
κ
基因座的上游和内源j
κ
基因座的下游的重组酶靶向位点将部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座引入到宿主细胞中。
74.在一方面，非编码调控或支架序列来源于啮齿动物λ免疫球蛋白轻链可变区基因座的非编码调控或支架序列。在一方面，非编码调控或支架序列与啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的非编码调控或支架序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。在另一方面，非编码调控或支架序列是啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区非编码或支架序列。
75.在一方面，非编码调控或支架序列来源于啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的非编码调控或支架序列。在一方面，非编码调控或支架序列与啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的非编码调控或支架序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。在另一方面，非编码调控或支架序列是啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区非编码或支架序列。
76.在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座作为单个核酸合成，并且作为单个核酸区域引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞中。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座在两个或更多个连续区段中合成，并且作为离散区段引入至哺乳动物宿主细胞。在另一方面，将工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座使用重组方法产生，并且分离，然后引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞中。
77.在另一方面，提供了用于产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的非牛科动物哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：a)将不能彼此重组的两个或更多个序列特异性重组位点引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞的基因组中，其中至少一个重组位点被引入内源免疫球蛋白可变区基因座的上游，而至少一个重组位点被引入同一染色体上内源免疫球蛋白可变区基因座的下游；b)提供包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的载体，该工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座具有i)牛科动物免疫球蛋白可变区基因编码序列和ii)基于宿主细胞基因组的内源免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序
列，其中部分牛科动物免疫球蛋白基因座侧翼为与位于a)的宿主细胞的内源免疫球蛋白可变区基因座侧翼相同的两个序列特异性重组位点；c)将步骤b)的载体和能够识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入到宿主细胞中；d)允许a)的细胞的基因组与工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，导致内源免疫球蛋白可变区基因座被工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座取代。
78.在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含vh免疫球蛋白基因区段编码序列，并且还包含i)牛科动物d和jh基因区段编码序列，ii)在内源地存在于非牛科动物哺乳动物宿主的基因组中的单独vh、d和jh基因区段的密码子周围的非编码调控或支架序列，以及iii)基于非牛科动物哺乳动物宿主细胞的内源基因组的前d序列。重组酶靶向位点被引入内源免疫球蛋白vh基因座的上游以及内源d和jh基因座的下游。
79.在一方面，提供了一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物具有缺失了啮齿动物内源免疫球蛋白可变基因座的基因组，并且其中缺失的啮齿动物内源免疫球蛋白可变基因座已经被工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代，该工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和基于啮齿动物内源免疫球蛋白可变基因座的非编码调控或支架序列，其中转基因啮齿动物的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座是功能性的，并且表达具有牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的免疫球蛋白链。在一些方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物vh、d和jh编码序列，并且在一些方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
l
和j
l
编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
和j
λ
编码序列。在另一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
和j
κ
编码序列。
80.一些方面提供了来自转基因啮齿动物的b淋巴细胞谱系细胞、包含从b淋巴细胞谱系细胞获得的牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的部分或整个免疫球蛋白分子、来源于b淋巴细胞谱系细胞的杂交瘤细胞、包含从杂交瘤细胞获得的牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的部分或整个免疫球蛋白分子、包含从杂交瘤细胞获得的免疫球蛋白分子来源的牛科动物可变结构域的部分或整个免疫球蛋白分子、来源于b淋巴细胞谱系细胞的永生化细胞、包含从永生化细胞获得的牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的部分或整个免疫球蛋白分子、包含从永生化细胞获得的免疫球蛋白分子来源的牛科动物可变结构域的部分或整个免疫球蛋白分子。
81.在一方面，提供了其中工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
l
和j
l
编码序列的转基因啮齿动物，以及其中工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物vh、d和jh或者v
l
和j
l
编码序列的转基因啮齿动物。在一些方面，啮齿动物是小鼠。在一些方面，非编码调控序列包括以下内源宿主来源的序列：每个v基因区段编码序列之前的启动子、内含子、剪接位点和用于v(d)j重组的重组信号序列；在其他方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座还包含以下内源宿主来源的序列中的一个或更多个：adam6a或adam6b基因、pax-5活化的基因间重复(pair)元件或来自重链基因间控制区1的ctcf结合位点。
82.在一方面，用于在以上每种方法中使用的非牛科动物哺乳动物细胞是哺乳动物细胞，例如哺乳动物胚胎干(es)细胞。在一方面，哺乳动物细胞是早期胚胎的细胞。在一方面，非牛科动物哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。在一方面，非牛科动物哺乳动物细胞是小鼠细胞。
83.在细胞已经经历内源免疫球蛋白可变区基因座被引入的部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因基因取代后，就可以选择和分离细胞。在一方面，细胞是非牛科动物哺乳动物es细胞，例如，啮齿动物es细胞，并且然后利用至少一个分离的es细胞克隆来产生表达工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的转基因非牛科动物哺乳动物。
84.在一方面，提供了一种用于产生转基因啮齿动物的方法，所述方法包括：a)将用于位点特异性重组酶的至少一个靶位点整合在啮齿动物细胞的基因组中内源免疫球蛋白可变基因座上游并且将用于位点特异性重组酶的至少一个靶位点整合在内源免疫球蛋白可变基因座下游，其中内源免疫球蛋白可变基因座包含vh、d和jh基因区段，或者v
κ
和j
κ
基因区段，或者v
λ
和j
λ
基因区段，或者v
λ
、j
λ
和c
λ
基因区段；b)提供包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的载体，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含嵌合牛科动物免疫球蛋白基因区段，其中每个部分牛科动物免疫球蛋白基因区段包含牛科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和啮齿动物非编码调控或支架序列，其中部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座侧翼为用于位点特异性重组酶的靶位点，其中靶位点能够与引入到啮齿动物细胞中的靶位点重组；c)将载体和能够识别靶位点的位点特异性重组酶引入到细胞中；d)允许细胞基因组与工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，导致内源免疫球蛋白可变基因座被工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代；e)选择包含步骤d)中产生的工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座的细胞；并且利用细胞产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座的转基因啮齿动物。在一些方面，细胞是啮齿动物胚胎干(es)细胞，并且在一些方面，细胞是小鼠胚胎干(es)细胞。该方法的一些方面还包括在步骤a)之后和步骤b)之前，通过引入识别第一组靶位点的重组酶来使内源免疫球蛋白可变基因座缺失的步骤，其中缺失步骤在啮齿动物细胞基因组中原位(in place)留下不能彼此重组的至少一组靶位点。在一些方面，载体包含牛科动物vh、d和jh编码序列，并且在一些方面，载体包含牛科动物v
l
和j
l
编码序列。在一些方面，载体还包含啮齿动物启动子、内含子、剪接位点和可变区基因区段的重组信号序列。
85.在另一方面，提供了一种用于产生包含外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的转基因非牛科动物哺乳动物的方法，所述方法包括：a)将一个或更多个序列特异性重组位点引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞的基因组中，该一个或更多个序列特异性重组位点位于内源免疫球蛋白可变区基因座的侧翼并且不能彼此重组；b)提供包含部分牛科动物免疫球蛋白基因座的载体，该部分牛科动物免疫球蛋白基因座具有i)牛科动物可变区基因编码序列和ii)基于内源宿主免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序列，其中编码和非编码调控或支架序列的侧翼为与引入a)的宿主细胞基因组的那些相同的序列特异性重组位点；c)将步骤b)的载体和能够识别一组重组酶位点的位点特异性重组酶引入到细胞中；d)允许a)的细胞的基因组与工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座之间发生重组事件，导致内源免疫球蛋白可变区基因座被部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代；e)选择包含部分牛科动物免疫球蛋白基因座的细胞；并且f)利用细胞产生包含部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物。
86.在特定方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物vh、d和jh基因区段编码序列以及存在于非牛科动物哺乳动物宿主的内源基因组中的非编码调控和支架前d序列(包括实现生育力的基因(fertility-enabling gene))。在一方面，然后将序列特
异性重组位点引入内源免疫球蛋白vh基因区段的上游和内源jh基因区段的下游。
87.在一方面，提供了一种用于产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因非牛科动物动物的方法，所述方法包括：a)提供具有包含两组序列特异性重组位点的基因组的非牛科动物哺乳动物细胞，所述两组序列特异性重组位点不能彼此重组并且位于宿主基因组的内源免疫球蛋白可变区基因座的一部分的侧翼；b)通过引入识别第一组序列特异性重组位点的重组酶来使宿主基因组的内源免疫球蛋白基因座的一部分缺失，其中基因组中的这样的缺失保留第二组序列特异性重组位点；c)提供包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的载体，该工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座具有牛科动物编码序列和基于内源免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序列，其中编码和非编码调控或支架序列的侧翼为第二组序列特异性重组位点；d)将步骤c)的载体和能够识别第二组序列特异性重组位点的位点特异性重组酶引入到细胞中；e)允许细胞基因组与部分牛科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，导致内源免疫球蛋白基因座被工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变基因座取代；f)选择包含部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的细胞；并且g)利用细胞产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的转基因动物。
88.在一方面，提供了一种用于产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因非牛科动物哺乳动物的方法，所述方法包括：a)提供具有包含两个序列特异性重组位点的基因组的非牛科动物哺乳动物胚胎干es细胞，所述两个序列特异性重组位点不能彼此重组并且位于内源免疫球蛋白可变区基因座的侧翼；b)提供包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的载体，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和基于内源免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序列，其中部分牛科动物免疫球蛋白基因座的侧翼为位于es细胞中内源免疫球蛋白可变区基因座侧翼的相同的两个序列特异性重组位点；c)使es细胞和载体与能够在适当条件下识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶接触，以促进重组事件，该重组事件导致在es细胞中内源免疫球蛋白可变区基因座被工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因基因位点取代；d)选择包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的es细胞；并且e)利用细胞产生包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物。
89.在一个方面，转基因非牛科动物哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。
90.在一方面，提供了表达引入的免疫球蛋白可变区基因座的非牛科动物哺乳动物细胞和非牛科动物转基因哺乳动物，该免疫球蛋白可变区基因座具有牛科动物可变区基因编码序列和基于宿主基因组的内源非牛科动物免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列，其中非牛科动物哺乳动物细胞和转基因动物表达具有与其各自的对非牛科动物哺乳动物细胞或动物天然的恒定区结合的完全牛科动物h链或l链可变结构域的嵌合抗体。
91.此外，提供了来自转基因动物的b细胞，所述b细胞能够表达具有完全牛科动物可变序列的部分牛科动物抗体，其中这样的b细胞是永生化的，以提供对特定抗原有特异性的单克隆抗体的来源。在一方面，提供了来自转基因动物的b淋巴细胞谱系细胞，所述b淋巴细胞谱系细胞能够表达包含牛科动物可变区和啮齿动物恒定区的部分牛科动物重链或轻链抗体。
92.在一方面，提供了从b细胞克隆的牛科动物免疫球蛋白可变区基因序列，用于在产
生或优化用于诊断、预防和治疗用途的抗体中使用。
93.在一方面，提供了杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞能够产生具有完全牛科动物免疫球蛋白可变区序列的部分牛科动物单克隆抗体。在一方面，提供了b淋巴细胞谱系的杂交瘤或永生化细胞系。
94.在另一方面，提供了由本文描述的转基因动物或细胞产生的抗体或其抗原结合部分。在另一方面，提供了包含来源于由本文描述的转基因动物或细胞产生的抗体的可变重链或可变轻链序列的抗体或其抗原结合部分。
95.在一方面，提供了用于确定来自产生单克隆抗体的杂交瘤或原代浆细胞或b细胞的h链和l链免疫球蛋白可变结构域的序列并且将vh和v
l
序列与牛科动物恒定区组合的方法，用于产生在注射到牛中时无免疫原性的完全牛科动物抗体。
96.下文更详细地描述这些以及其他方面、目的和特征。
97.附图简述
98.图1a是位于12号染色体端粒末端处的内源小鼠igh基因座的示意图。
99.图1b是位于16号染色体上的内源小鼠igl基因座的示意图。
100.图1c是位于6号染色体上的内源小鼠igk基因座的示意图。
101.图2是图示通过同源重组将第一组序列特异性重组位点引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中的h链可变区基因座上游区域中的靶向策略的示意图。
102.图3是图示通过同源重组将第一组序列特异性重组位点引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中的h链可变区基因座上游区域中的靶向策略的另一示意图。
103.图4是图示经由同源靶向载体将第二组序列特异性重组位点引入到非牛科动物哺乳动物细胞基因组中的h链可变区基因座下游区域中的示意图。
104.图5是图示使内源免疫球蛋白h链可变区基因座从非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中缺失的示意图。
105.图6是图示rmce策略的示意图，该rmce策略将工程化部分牛科动物免疫球蛋白h链基因座引入到先前已经被修饰为缺失内源免疫球蛋白h链可变区基因座的非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中。
106.图7是图示rmce策略的示意图，该rmce策略将包含另外的调控序列的工程化部分牛科动物免疫球蛋白h链基因座引入到先前已经被修饰为缺失内源免疫球蛋白h链可变区基因的非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中。
107.图8是图示将工程化部分牛科动物免疫球蛋白h链可变区基因座引入到小鼠基因组的内源免疫球蛋白h链基因座的示意图。
108.图9是图示将工程化部分牛科动物免疫球蛋白κl链可变区基因座引入到小鼠基因组的内源免疫球蛋白κl链基因座的示意图。
109.图10是图示将工程化部分牛科动物免疫球蛋白λl链可变区基因座引入到小鼠基因组的内源免疫球蛋白λl链基因座的示意图。
110.图11是图示经由rmce引入包含牛科动物vh微基因座的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的示意图。
111.图12a是位于21号染色体上的内源牛科动物igh基因座(1201)的示意图。vh(1202)、d(1203)和jh(1204)基因区段被指示为编码m1(1205)、dd1p(1206)、dd2p(1207)、
dd3p(1208)、m2(1209)、d(1210)、g3(1211)、g1(1212)、g2(1213)、e(1214)和a(1215)的恒定区的外显子。
112.图12b是位于17号染色体上的内源牛科动物igl基因座(1217)的示意图。指示了v
λ
(1218)和串联簇j
λ-c
λ
(1219)基因区段-外显子。散布在基因座中的其他非ig基因是锌指蛋白280b(1220)、锌指蛋白280a(1221)和黑素瘤中优先表达的抗原(1222)。vpreb(1223)编码前b细胞受体的v
λ
样组分。基因1220-1223与ig基因在相对的转录方向。
113.图12c是位于11号染色体上的内源牛科动物igk基因座(1224)的示意图。v
κ
(1225)和j
κ
(1226)基因区段被指示为编码c
κ
(1227)的外显子。编码核糖5-磷酸异构酶a(1228)的基因以相对的转录方向存在于基因座的下游。
114.图13是图示工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链可变区基因座的示意图，其中一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列插入到一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列上游的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中，所述一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
区编码序列的上游。
115.图14是图示引入工程化部分牛科动物轻链可变区基因座的示意图，其中一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列插入到j
λ-c
λ
串联盒阵列上游的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中，其中j
λ
来自牛科动物来源，并且c
λ
来自小鼠来源，为c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
。
116.图15示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的流式细胞术分析结果，该vh结构域具有超长hcdr3，其中小鼠igm骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。
117.图16示出了表达牛科动物ighv b4的细胞的流式细胞术分析结果，该vh结构域具有正常长度hcdr3，其中小鼠igm骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。
118.图17a示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的上清液(1701)的蛋白印迹，并且图17b示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的细胞裂解物(1702)的蛋白印迹，该vh结构域具有超长hcdr3，其中小鼠igg2a hc骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。
119.图18a示出了图17a和图17b中示出的蛋白印迹的使用myc(1802)的上样对照(loading controls)，并且图18b示出了图17a和图17b中示出的蛋白印迹的使用gapdh(1803)的上样对照。
120.图19a示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的上清液(1901)的蛋白印迹，并且图19b示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的细胞裂解物(1902)的蛋白印迹，该vh结构域具有平均长度hcdr3，其中小鼠igg2ahc骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。
121.图20a示出了图19a和图19b中示出的蛋白印迹的使用myc(2001)的上样对照，并且图20b示出了图17a和图17b中示出的蛋白印迹的使用gapdh(2002)的上样对照。
122.图21示出了具有小鼠igd骨架和牛科动物v
λ-小鼠c
λ1
(2103)、c
λ2
(2104)或c
λ3
(2105)的细胞内牛科动物ighv blv1h12(2101)和牛科动物ighv blv5b8(2102)的表达。
123.图22示出了与图21中相同的牛科动物构建体的细胞表面的表达(用相同的抗体染色)，并且其中数据排列与图21中相同。
124.图23示出了细胞内牛科动物ighv b4的表达，该牛科动物ighv b4具有平均长度hcdr3，其中小鼠igd骨架和牛科动物vλ附接至小鼠c
λ1
(2302)、c
λ2
(2303)或c
λ3
(2304)。
125.图24示出了具有细胞表面染色的牛科动物ighv b4的表达，该牛科动物ighv b4具有附接至小鼠c
λ1
(2402)、c
λ2
(2403)或c
λ3
(2404)的小鼠igd骨架和牛科动物vλ，其中细胞表面染色数据的排列与图23中相同。
126.定义
127.本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制这样的术语的含义，除非特别地指示。
128.如本文使用的术语“基因座”是指分别内源地存在于基因组中或外源地(或即将)引入到基因组中的染色体区段或核酸序列。例如，免疫球蛋白基因座可以包括支持免疫球蛋白h链或l链多肽的表达的部分或全部基因(即v、d、j基因区段以及恒定区基因)和间插序列(即内含子、增强子等)。因此，基因座(例如，免疫球蛋白重链可变区基因座)可以指更大基因座的特定部分(例如，包括vh、d和jh基因区段的免疫球蛋白h链基因座的一部分)。类似地，免疫球蛋白轻链可变区基因座可以指更大基因座的特定部分(例如，包括v
l
和j
l
基因区段的免疫球蛋白l链基因座的一部分)。如本文使用的术语“免疫球蛋白可变区基因”是指编码免疫球蛋白h链或l链可变结构域的一部分的v、d或j基因区段。如本文使用的术语“免疫球蛋白可变区基因座”是指包含v、d或j基因区段簇的染色体区段或核酸链的一部分或整体，并且可以包括非编码调控序列或支架序列。
129.如本文使用的术语“基因区段”是指编码免疫球蛋白分子的重链或轻链可变结构域的一部分的核酸序列。基因区段可以包括编码序列和非编码序列。基因区段的编码序列是可以翻译为多肽诸如前导肽和重链或轻链可变结构域的n-末端部分的核酸序列。基因区段的非编码序列是位于编码序列侧翼的序列，其可能包括启动子、5’非翻译序列、间插前导肽编码序列的内含子、一个或更多个重组信号序列(rss)和剪接位点。免疫球蛋白重链(igh)基因座中的基因区段包括vh、d和jh基因区段(也分别称为ighv、ighd和ighj)。免疫球蛋白κ和λ轻链基因座中的轻链可变区基因区段可以称为v
l
和j
l
基因区段。在κ轻链中，v
l
和j
l
基因区段可以称为v
κ
和j
κ
基因区段或igkv和igkj。类似地，在λ轻链中，v
l
和j
l
基因区段可以称为v
λ
和j
λ
基因区段或iglv和iglj。
130.重链恒定区可以称为ch或ighc。编码igm、igd、igg1-4、ige或iga的ch区外显子可以分别称为c
μ
、c
δ
、c
γ1-4
、c
ε
或c
α
。类似地，免疫球蛋白κ或λ恒定区可以分别称为c
κ
或c
λ
区，以及igkc或iglc。
131.如本文使用的“部分牛科动物”是指包含与存在于牛科动物和非牛科动物哺乳动物宿主二者的给定基因座中的序列对应的序列的核酸链，或其表达的蛋白和rna产物。如本文使用的“部分牛科动物”还指包含来自牛科动物和非牛科动物哺乳动物(例如啮齿动物)二者的核酸序列的动物。在一方面，部分牛科动物核酸具有牛科动物免疫球蛋白h链或l链可变区基因区段的编码序列和基于非牛科动物哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列的序列。
132.在提及来自非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源非编码调控或支架序列时，术语“基于”是指存在于对应的哺乳动物宿主细胞基因组的内源基因座中的非编码调控
或支架序列。在一方面，术语“基于”意指存在于部分牛科动物免疫球蛋白基因座中的非编码调控或支架序列与宿主哺乳动物内源基因座的非编码调控或支架序列共有相对高度的同源性。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列与宿主哺乳动物内源基因座中发现的对应非编码序列共有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列从宿主哺乳动物的免疫球蛋白基因座保留。在一方面，牛科动物编码序列嵌入到宿主哺乳动物免疫球蛋白基因座的非调控序列或支架序列中。在一方面，宿主哺乳动物是啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。
[0133]“非编码调控序列”是指已知对于以下至关重要的序列：(i)v(d)j重组、(ii)同种型转换、(iii)v(d)j重组后全长免疫球蛋白h链或l链的正确表达以及(iv)可变剪接以产生例如免疫球蛋白h链的膜和分泌形式。“非编码调控序列”可以还包括以下内源来源的序列：增强子和基因座控制元件，诸如ctcf和pair序列(proudhon，等人，adv.immunol.128:123-182(2015))；每个内源v基因区段之前的启动子；剪接位点；内含子；位于每个v、d或j基因区段侧翼的重组信号序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座的“非编码调控序列”与非牛科动物哺乳动物宿主细胞的靶向内源免疫球蛋白基因座中发现的对应非编码序列共有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及高达100％的同源性。
[0134]“支架序列”是指间插存在于宿主细胞基因组内源免疫球蛋白基因座中的基因区段的序列。在某些方面，支架序列被对于功能性非免疫球蛋白基因表达至关重要的序列，例如，adam6a或adam6b间隔开。在某些方面，支架序列来源于(至少部分地来源于)其他来源，例如，它们可以是合理设计的或人工的序列、存在于牛科动物基因组免疫球蛋白基因座中的序列、存在于另一物种的免疫球蛋白基因座中的序列或其组合。应当理解，措辞“非编码调控序列或支架序列”在含义上是包括性的(即，指存在于给定基因座中的非编码调控序列和支架序列二者)。
[0135]
术语“同源性靶向载体”是指用于通过同源重组修饰哺乳动物宿主细胞内源基因组的核酸序列；这样的核酸序列可以包括(i)与位于存在于非牛科动物哺乳动物宿主基因组中的待修饰基因座侧翼的对应的内源序列具有显著同源性的靶向序列，(ii)至少一个序列特异性重组位点，(iii)非编码调控或支架序列，和(iv)任选地一个或更多个选择性标志物基因。因此，同源性靶向载体可以用于将序列特异性重组位点引入到宿主细胞基因组的特定区域。
[0136]“位点特异性重组”或“序列特异性重组”是指两个相容重组序列(也称为“序列特异性重组位点”或“位点特异性重组序列”)之间的dna重排过程，包括以下三种事件中的任何一种：a)侧翼为重组位点的预选核酸的缺失；b)侧翼为重组位点的预选核酸的核苷酸序列的倒位，和c)位于不同核酸链上的重组位点附近的核酸序列的相互交换。应当理解，核酸区段的这种相互交换可以用作将外源核酸序列引入到宿主细胞基因组中的靶向策略。
[0137]
术语“靶向序列”是指与细胞基因组中的位于待修饰的免疫球蛋白基因座区域的侧翼或与之相邻的dna序列同源的序列。侧翼或相邻序列可以位于基因座本身中，或者在宿主细胞基因组中的编码序列的上游或下游。将靶向序列插入到用于转染例如es细胞的重组dna载体中，使得被插入到宿主细胞基因组中的序列(诸如重组位点的序列)的侧翼为载体
manual；bowtell和sambrook(2003),dna microarrays:a molecular cloning manual；mount(2004),bioinformatics:sequence and genome analysis；sambrook和russell(2006),condensed protocols from molecular cloning:a laboratory manual；以及sambrook和russell(2002),molecular cloning:a laboratory manual(全部来自cold spring harbor laboratory press)；stryer,l.(1995)biochemistry(第4版)w.h.freeman,new york n.y.；gait,"oligonucleotide synthesis:a practical approach"1984,irl press,london；nelson和cox(2000),lehninger,principles of biochemistry第3版,w.h.freeman pub.,new york,n.y.；以及berg等人(2002)biochemistry,第5版,w.h.freeman pub.,new york,n.y.，全部这些文献出于全部目的通过引用以其整体并入本文。
[0147]
详细描述
[0148]
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
[0149]
本文描述了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链或轻链基因座的基因组。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含一个或更多个牛科动物免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含一个或更多个牛科动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因区段。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含一个或更多个牛科动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因区段。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白重链或轻链基因座包含来自家牛(bos taurus)的免疫球蛋白区基因区段。
[0150]
在一方面，提供了非牛科动物哺乳动物细胞，所述非牛科动物哺乳动物细胞包含外源引入的工程化部分牛科动物核酸序列，该外源引入的工程化部分牛科动物核酸序列包含牛科动物可变区的编码序列和存在于哺乳动物宿主基因组的免疫球蛋白基因座中的非编码调控或支架序列，例如在宿主哺乳动物是小鼠时为小鼠基因组非编码序列。在一方面，牛科动物可变区基因区段的一个或更多个编码序列嵌入对应于哺乳动物宿主基因组中免疫球蛋白基因座的那些序列的非编码调控或支架序列中。在一方面，牛科动物可变区基因区段的编码序列嵌入啮齿动物或小鼠免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列中。
[0151]
在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座是合成的，并且包含处于内源宿主调控元件控制下的牛科动物vh、d或jh或者v
l
或j
l
基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含嵌入对应于哺乳动物宿主基因组中免疫球蛋白基因座的那些序列的非编码调控或支架序列中的牛科动物vh、d或jh或者v
l
或j
l
基因区段编码序列。
[0152]
还提供了用于产生转基因啮齿动物或啮齿动物es细胞的方法，所述转基因啮齿动物或啮齿动物es细胞包含外源引入的部分工程化牛科动物免疫球蛋白基因座，其中所得转基因啮齿动物能够产生的包含λ轻链的免疫球蛋白比包含κ轻链的免疫球蛋白更多。
[0153]
小鼠和牛中的免疫球蛋白基因座
[0154]
在体液免疫系统中，各异抗体的库通过称为v(d)j重组的过程，由igh链和igl链基因座的组合和连接多样性产生。在正发育的b细胞中，发生的第一重组事件是在重链基因座
and biochemistry of bovine immunoglobulins adv.immunol.137:135-164)。不同品种的牛似乎都具有由长的牛科动物d区段编码的异常长的cdr h3。一个牛科动物d(称为d2)包含149个核苷酸，占49个氨基酸密码子。该长d显著有助于牛科动物免疫球蛋白h链的互补决定区3(cdr3)的长度。相比之下，小鼠中的平均h链cdr3长度是～11个氨基酸，并且在人类中的平均h链长度是～15个氨基酸。牛科动物抗体具有两种类型，常规抗体(尽管有相对较长的cdr3(～25个氨基酸))和具有超长cdr3的那些抗体(范围为40-67个残基，具有平均～58个氨基酸)。特别长的cdr3具有包含带有突出旋钮(projecting knob)的支撑柄的独特结构。在常规抗体中，h链可变区和l链可变区二者的cdr环都有助于抗原结合。然而，在超长(ul)cdr3抗体中，cdr h1、h2、l1和l2环仅形成支持柄，而ul cdr h3环形成旋钮结构，该旋钮结构与抗原结合并且可以通过改变cys残基的数量以及所得的在体细胞上产生的二硫键的模式和连接性而极大地多样化。迄今，分析的全部ul牛科动物抗体的重链由单个vh基因区段vhbul、单个d基因区段d2以及单个jh基因区段jh1编码。
[0162]
与人类和小鼠类似，两种类型的ig轻链(κ和λ)在牛科动物中表达，尽管λ与κ比例在这些动物显著不同。在小鼠中，血清抗体中大约96％的轻链是κ型，而人类中的κ型仅占igl链总群体的66％。相比之下，牛中的l链库以λ为主。牛具有20个功能性v
λ
和8个功能性v
κ
基因。ul牛科动物抗体使用单个的v
λ
，为v
λ1x
。
[0163]
牛科动物κ基因座(1240)位于第11号染色体上，并且尺寸是大约280kb。κ基因座包含22个v
κ
基因(1225)、3个j
κ
基因(1226)和1个c
κ
基因(1227)。图12c提供了内源牛科动物igk基因座的示意图。
[0164]
牛科动物λ基因座(1216)位于第17号染色体上，并且比κ基因座大，并且包含以j
λ-c
λ
串联簇(c
λ6
缺乏j
λ
区段)阵列化的大约63个v
λ
基因(1218)、8个j
λ
基因和9个c
λ
基因。图12b提供了内源牛科动物igl基因座的示意图。
[0165]
小鼠免疫球蛋白κ基因座位于6号染色体上。图1b提供了内源小鼠igk基因座的示意图。igk基因座(112)跨越3300kbp，并且包括位于5个连接(j
κ
)基因区段(114)和一个恒定(c
κ
)基因(115)上游的多于100个可变v
κ
基因区段(113)。小鼠κ基因座包括位于j
κ
与c
κ
之间的内含子增强子(ie
κ
，116)，该内含子增强子(ie
κ
，116)活化κ重排并有助于维持κ相比于λ更早或更有效的重排(inlay等人(2004)important roles for e protein binding sites within the immunoglobulinκchain intronic enhancer in activating v
κjκ
rearrangement.j.exp.med.200(9):1205-1211)。另一个增强子为3’增强子(3’e
κ
，117)，位于c
κ
外显子下游9.1kb，并且也参与κ重排和转录；缺乏ie
κ
和3’e
κ
二者的突变体小鼠在κ基因座没有v
κjκ
重排(inlay等人(2002)essential roles of the kappa light chain intronic enhancer and 3’enhancer in kappa rearrangement and demethylation.nature immunol.3(5):463-468)。然而，例如通过插入新霉素抗性基因来破坏ie
κ
也足以消除大多数v
κjκ
重排(xu等人(1996)deletion of the igκlight chain intronic enhancer/matrix attachment region impairs but does not abolish v
κjκ
rearrangement)。
[0166]
小鼠免疫球蛋白λ基因座位于16号染色体上。图1c提供了内源小鼠igl基因座(118)的示意图。小鼠免疫球蛋白λ基因座的组织不同于小鼠免疫球蛋白κ基因座。基因座跨越240kb，具有包含3个功能性可变(v
λ
)基因区段(iglv2，119；iglv3，120和iglv1，123)的两
个簇和λ连接(j
λ
)基因区段和恒定(c
λ
)基因区段(iglj2，121；iglc2，122；iglj3，124:iglc3，125；iglj1，126；iglc1，127)的3个串联盒，其中v
λ
基因区段位于可变数量的j-c串联盒的上游(5’)。基因座还包含三个转录增强子(e
λ2-4
，128；e
λ
，129；e
λ3-1
，130)。
[0167]
本文描述的部分牛科动物核酸序列允许转基因动物产生包含牛科动物vh或v
l
区域的重链或轻链库，同时保留可以在宿主基因组(例如啮齿动物的)的间插序列内发现的有助于促进宿主中有效抗体产生和抗原识别的调控序列和其他元件。
[0168]
在一方面，合成的或通过重组产生的部分牛科动物核酸被工程化以包含免疫球蛋白vh、v
λ
或v
κ
基因座(或者在一些方面，其组合)的牛科动物编码序列和非牛科动物非编码调控或支架序列二者。
[0169]
在一方面，表达具有牛科动物可变区的免疫球蛋白的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞可以通过将一个或更多个牛科动物vh基因区段编码序列插入到啮齿动物重链免疫球蛋白基因座的vh基因座中来产生。在另一方面，表达具有牛科动物可变区的免疫球蛋白的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞可以通过将一个或更多个牛科动物v
l
基因区段编码序列插入到啮齿动物轻链免疫球蛋白基因座的v
l
基因座中来产生。
[0170]
两个轻链基因座(κ和λ)的存在意味着各种轻链插入组合对于产生表达具有牛科动物可变区的免疫球蛋白的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞是可能的，所述轻链插入组合包括但不限于：将一个或更多个牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列插入到啮齿动物v
λ
基因座中，将一个或更多个牛科动物v
κ
或j
κ
基因区段编码序列插入到啮齿动物v
κ
基因座中，将一个或更多个牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列插入到啮齿动物v
κ
基因座中，以及将一个或更多个牛科动物v
κ
或j
κ
基因区段编码序列插入啮齿动物v
λ
基因座中。
[0171]
表达部分牛科动物免疫球蛋白的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞的选择和开发由于以下事实而变得复杂：由小鼠产生的多于90％的轻链是κ，并且小于10％的轻链是λ，而由牛科动物产生的多于90％的轻链是λ，并且小于10％的轻链是κ的事实。
[0172]
由于小鼠主要产生含κlc的抗体，增加由转基因啮齿动物产生含λlc的部分牛科动物免疫球蛋白的一种合理方法是将一个或更多个牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列插入到啮齿动物κ基因座中。然而，如下文实施例9中示出的，将牛科动物v
λ
区外显子与啮齿类动物c
κ
区外显子偶联导致部分牛科动物免疫球蛋白在体外的次优表达。
[0173]
本文提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达包含牛科动物可变结构域的免疫球蛋白，其中转基因啮齿动物产生的包含λ轻链的免疫球蛋白比包含κ轻链的免疫球蛋白更多，或者产生包含λ轻链的免疫球蛋白的可能性比产生包含κ轻链的免疫球蛋白更大。虽然不希望受理论束缚，但认为产生包含λ轻链的免疫球蛋白更多或更可能产生包含λ轻链的免疫球蛋白的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞产生用于开发治疗的更完整抗体库。
[0174]
本文提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座的基因组。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白轻链基因座包含牛科动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因区段。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座能够表达包含牛科动物可变结构域的免疫球蛋白。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座能够表达包含牛科动物λ可变结构域的免疫球蛋白。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座能够表达包含牛科动物κ可变结构域的免疫球蛋白。在一方面，工程化
免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的免疫球蛋白轻链。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物λ可变结构域和啮齿动物λ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物κ可变结构域和啮齿动物κ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。
[0175]
在一方面，转基因啮齿动物或啮齿动物细胞产生的包含λ轻链的免疫球蛋白比包含κ轻链的免疫球蛋白更多，或者产生包含λ轻链的免疫球蛋白的可能性比产生包含κ轻链的免疫球蛋白更大。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物，其中从啮齿动物分离出产生λ轻链的细胞的可能性比分离出产生κ轻链的细胞更大。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物产生至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的包含λ轻链的免疫球蛋白。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物细胞或其后代，所述转基因啮齿动物细胞或其后代产生具有λ轻链的免疫球蛋白的可能性比产生具有κ轻链的免疫球蛋白更大。在一方面，转基因啮齿动物细胞或其后代具有至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以及高达约100％的概率产生包含λ轻链的免疫球蛋白。在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中内源啮齿动物轻链免疫球蛋白基因座已经缺失，并且被工程化部分牛科动物轻链免疫球蛋白基因座取代。在一方面，转基因啮齿动物是小鼠。
[0176]
免疫球蛋白轻链基因座
[0177]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含通过重组产生的部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的基因组。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座是轻链可变区(v
l
)基因座。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列或者一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
κ
基因区段编码序列或者一个或更多个牛科动物j
κ
基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个啮齿动物恒定结构域基因或编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个啮齿动物c
λ
基因或编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个啮齿动物c
κ
基因或编码序列。在一方面，内源啮齿动物轻链免疫球蛋白基因座已经失活。在一方面，内源啮齿动物轻链免疫球蛋白基因座已经缺失，并且被工程化部分牛科动物轻链免疫球蛋白基因座取代。
[0178]
在一方面，工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物λ可变结构域和啮齿动物λ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座表达包含牛科动物κ可变结构域和啮齿动物κ恒定结构域的免疫球蛋白轻链。
[0179]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部v
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少20个、30个、40个、50个以及高达63个牛科动物v
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含
有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0180]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有在牛科动物基因组中发现的大部分或全部j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个或3个牛科动物v
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有在牛科动物基因组中发现的至少约50％、75％以及高达100％的j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、75％以及高达100％的j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0181]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部v
λ
和j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
λ
和j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
λ
和j
λ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0182]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部v
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个以及高达22个牛科动物v
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0183]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有在牛科动物基因组中发现的大部分或全部j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个或3个牛科动物j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有在牛科动物基因组中发现的至少约50％、75％以及高达100％的j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、75％以及高达100％的j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0184]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部v
κ
和j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
κ
和j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的v
κ
和j
κ
基因区段编码序列的v
l
基因座。
[0185]
在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
l
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白轻
链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，啮齿动物非编码调控或支架序列来自啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座。在一方面，啮齿动物非编码调控或支架序列来自啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白λ恒定区(c
λ
)编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白c
λ
编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和在啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中嵌入的一个或更多个啮齿动物c
λ
编码序列。
[0186]
在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含在啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
λ
或j
λ
基因区段编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白c
λ
编码序列和啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含在啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白c
λ
编码序列。
[0187]
在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j
λ
基因区段编码序列的上游，该一个或更多个j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
基因的上游。在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j
λ
基因区段编码序列的上游并且与一个或更多个j
λ
基因区段编码序列在相同的转录方向，该一个或更多个j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物λc
λ
基因的上游。
[0188]
在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列、一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物c
λ
基因。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列、一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列和一个或多个啮齿动物c
λ
区基因，其中v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
区基因插入到啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列、一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物c
λ
基因，其中v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物(c
λ
)区基因嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的非编码调控或支架序列中。
[0189]
在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j
λ
基因区段编码序列的上游，该一个或更多个j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
基因的上游，其中v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
基因插入到啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j
λ
基因区段编码序列的上游，该一个或更多个j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
基因的上游，其中v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
基因嵌入啮齿动物免疫球蛋
白κ轻链基因座的非编码调控或支架序列中。
[0190]
在一方面，啮齿动物c
λ
编码序列选自啮齿动物c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
编码序列。
[0191]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中工程化免疫球蛋白基因座包含啮齿动物免疫球蛋白κ基因座，其中一个或更多个啮齿动物v
κ
基因区段编码序列和一个或更多个啮齿动物j
κ
基因区段编码序列已经缺失并且分别被一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j
λ
基因区段编码序列取代，并且其中基因座中的啮齿动物c
κ
编码序列已经被啮齿动物c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
编码序列取代。
[0192]
在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j-c单元，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物cλ基因。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j-c单元，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
区编码序列，其中v
λ
基因区段编码序列和j-c单元插入到啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列和一个或更多个j-c单元，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
编码序列，其中v
λ
基因区段编码序列和j-c单元嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的非编码调控或支架序列中。
[0193]
在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j-c单元的上游并且与一个或更多个j-c单元在相同的转录方向，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
基因。在一方面，一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个j-c单元的上游并且与一个或更多个j-c单元在相同的转录方向，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含位于一个或更多个j-c单元上游的一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物c
λ
编码序列，其中v
λ
基因区段编码序列和j-c单元插入到啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在一方面，工程化免疫球蛋白可变区基因座包含在一个或更多个j-c单元上游并且与一个或更多个j-c单元在相同的转录方向的一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列，其中每个j-c单元包含牛科动物j
λ
基因区段编码序列和啮齿动物cλ编码序列，其中v
λ
基因区段编码序列和j-c单元嵌入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的非编码调控或支架序列中。在一方面，啮齿动物c
λ
编码序列选自啮齿动物c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
编码序列。
[0194]
在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
或j
κ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，啮齿动物非编码调控或支架序列来自啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座。在一方面，啮齿动物非编码调控或支架序列来自啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列和来自啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个啮齿动物免疫球蛋白c
κ
编码序列。
在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个啮齿动物免疫球蛋白c
λ
编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列和一个啮齿动物免疫球蛋白c
κ
编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含在啮齿动物κ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列和一个啮齿动物免疫球蛋白c
κ
编码序列。在一方面，工程化免疫球蛋白基因座包含在啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变区基因座的啮齿动物非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列和一个啮齿动物免疫球蛋白c
λ
编码序列。
[0195]
虽然不希望受理论束缚，但认为使内源啮齿动物κ轻链基因座失活或赋予其非功能性可以增加来自部分牛科动物免疫球蛋白基因座的λ轻链免疫球蛋白的表达。这已被证明在其中κ轻链基因座在种系中已经失活的其他常规小鼠中是这种情况(zon，等人(1995)subtle differences in antibody responses and hypermutation ofλlight chains in mice with a disruptedκconstant region.eur.j.immunol.25:2154-2162)。在一方面，使内源啮齿动物κ轻链基因座失活或赋予其非功能性可以相对于由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞产生的包含κ轻链的免疫球蛋白的量增加包含λ轻链的免疫球蛋白的相对量。
[0196]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中内源啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座是缺失、失活的或成为非功能性的。在一方面，内源啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座因以下中的一种或更多种而失活或成为非功能性的：缺失或突变全部内源啮齿动物v
κ
基因区段编码序列；缺失或突变全部内源啮齿动物j
κ
基因区段编码序列；缺失或突变内源啮齿动物c
κ
编码序列；缺失、突变或破坏内源内含子κ增强子(ie
κ
)和3’增强子序列(3’e
κ
)；或其组合。
[0197]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，其中内源啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变结构域是缺失的、失活的或成为非功能性的。在一方面，内源啮齿动物免疫球蛋白λ轻链可变结构域因以下中的一种或更多种而失活或成为非功能性的：缺失或突变全部内源啮齿动物v
κ
基因区段；缺失或突变全部内源啮齿动物j
λ
基因区段；缺失或突变全部内源啮齿动物c
λ
编码序列；或其组合。
[0198]
在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含啮齿动物调控或支架序列，包括但不限于增强子、启动子、剪接位点、内含子、重组信号序列及其组合。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含啮齿动物λ调控或支架序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含啮齿动物κ调控或支架序列。
[0199]
在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含驱动基因表达的启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含κv区启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含λv区启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含驱动在v
λ
至j
λ
基因区段重排之后产生的一个或更多个λlc基因编码序列的表达的λv区启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含驱动在v
κ
至j
κ
基因区段重排之后产生的一个或更多个κlc基因编码序列的表达的λv区启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含驱动在v
λ
至j
λ
基因区段重排之后产生的一个或更多个λlc基因编码序列的表达的κv区启动子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含驱动在v
κ
至j
κ
基因区段重排之后产生的一个或更多个κlc基因编码序列的表达的κv区启动子。
[0200]
在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个增强子。在一方面，
部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含小鼠κie
κ
或3’e
κ
增强子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个v
λ
或j
λ
基因区段编码序列和一个小鼠κie
κ
或3’e
κ
增强子。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含一个或更多个v
κ
或j
κ
基因区段编码序列和κie
κ
或3’e
κ
增强子。
[0201]
免疫球蛋白重链基因座
[0202]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含通过重组产生的部分牛科动物免疫球蛋白重链可变区(vh)基因座的基因组。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含一个或更多个牛科动物vh、d或jh基因区段编码序列。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白重链可变区基因座包含一个或更多个啮齿动物恒定结构域(ch)基因或编码序列。在一方面，内源啮齿动物重链免疫球蛋白基因座已经失活。在一方面，内源啮齿动物重链免疫球蛋白基因座已经缺失，并且被工程化部分牛科动物重链免疫球蛋白基因座取代。
[0203]
在一方面，合成的h链dna区段包含雄性生育力所需的adam6a或adam6b基因，参与igh基因座收缩(igh locus contraction)的pax-5-活化的基因间重复(pair)元件和参与调控正常vdj重排的来自重链基因间控制区1的ctcf结合位点((proudhon，等人，adv.immunol.,128:123-182(2015))或其各种组合。这些内源非编码调控和支架序列在小鼠igh基因座中的位置描绘于图1中，图1从左到右图示了：～100个功能性重链可变区基因区段(101)；参与vdj重组的igh基因座收缩的pax-5活化的基因间重复序列pair(102)；雄性生育力所需的解整联蛋白和金属肽酶结构域6a基因adam6a或adam6b(103)；最远端d基因区段上游的21609bp区段前d区ighd-5d(104)；包含调控vh基因区段使用的ctcf绝缘子位点的基因间控制区1(igcr1)(106)；多样性基因区段d(10-15个，取决于小鼠品系)(105)；四个连接jh基因区段(107)；参与vdj重组的内含子增强子e
μ
(108)；用于同种型转换的μ转换区域s
μ
(109)；八个重链恒定区基因：c
μ
、c
δ
、c
γ3
、c
γ1
、c
γ2b
、c
2γa/c
、c
ε
和c
α
(110)；控制同种型转换和体细胞突变的3’调控区(3’rr)(111)。图1a根据取自proudhon等人adv.immunol.,128:123-182(2015)的图修改。
[0204]
在一方面，待整合到哺乳动物宿主细胞中的工程化部分牛科动物区域包含全部或大量的已知牛科动物vh基因区段。然而，在一些情况下，使用这样的vh基因区段的子集可能是合意的，并且在特定情况下，甚至可以将少至一个牛科动物vh编码序列引入到细胞或动物中。
[0205]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部vh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个以及高达12个功能性牛科动物vh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的vh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的vh基因区段编码序列的vh基因座。
[0206]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部vh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免
疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个以及高达12个牛科动物vh基因区段编码序列的vh基因座。在这方面，使用本领域熟知的方法，例如通过将符合框的终止密码子突变为功能性密码子来恢复vh基因区段假基因以恢复其功能性。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的vh基因区段编码序列的vh基因座。
[0207]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有在牛科动物基因组中发现的大部分或全部d基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个以及高达23个牛科动物d基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有在牛科动物基因组中发现的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的d基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的d基因区段编码序列的vh基因座。
[0208]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有在牛科动物基因组中发现的大部分或全部jh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有至少1个、2个、3个以及高达4个功能性牛科动物jh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有在牛科动物基因组中发现的至少约50％、75％以及高达100％的jh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、75％以及高达100％的jh基因区段编码序列的vh基因座。
[0209]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区包含含有来自牛科动物基因组的大部分或全部vh、d和jh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自牛科动物基因组的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的vh、d和jh基因区段编码序列的vh基因座。在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座包含含有来自家牛的至少约50％、60％、70％、80％、90％以及高达100％的vh、d和jh基因区段编码序列的vh基因座。
[0210]
在一方面，提供了一种转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，所述转基因啮齿动物或啮齿动物细胞包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物免疫球蛋白重链可变区基因编码序列和啮齿动物免疫球蛋白重链基因座的非编码调控或支架序列。在一方面，工程化牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物vh、d或jh基因区段编码序列。在一方面，工程化牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含在啮齿动物免疫球蛋白重链基因座的非编码调控或支架序列中嵌入的牛科动物vh、d或jh基因区段编码序列。
[0211]
在一方面，提供了包含工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的非牛科动物哺乳动物和哺乳动物细胞，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物vh、牛科动物d和牛科动物jh基因的编码序列，所述工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座还包含基于非牛科动物哺乳动物宿主的内源igh基因座的非编码调控和支架序列，包括前d序列。
在某些方面，外源引入的工程化部分牛科动物区域可以包含完全重组的v(d)j外显子。
[0212]
在一方面，转基因非牛科动物哺乳动物是包含外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的啮齿动物，例如小鼠，该外源引入的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含多个牛科动物vh、牛科动物d和牛科动物jh基因的密码子，具有基于啮齿动物中的间插(非编码调控或支架)序列的间插序列，包括前d区。在一方面，转基因啮齿动物还包含部分牛科动物igl基因座，所述部分牛科动物igl基因座分别包含与其存在于啮齿动物igl基因座中的免疫球蛋白间插序列对应的间插(非编码调控或支架)序列结合的牛科动物v
κ
或v
λ
基因和j
κ
或j
λ
基因的编码序列。
[0213]
在示例性实施方案中，如实施例部分中更详细阐述的，小鼠基因组的整个内源vh免疫球蛋白基因座是缺失的，并且随后被包含20个牛科动物vh基因区段的部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代，该牛科动物vh基因区段包含与小鼠基因组的j558 vh基因座的非编码序列对应的间隔开的非编码序列。完整的外源引入的工程化免疫球蛋白基因座还包含牛科动物d和jh基因区段，以及小鼠前d区。因此，牛科动物vh、d和jh密码子序列嵌入啮齿动物基因间序列和内含子序列中。
[0214]
部分牛科动物免疫球蛋白基因座的制备
[0215]
在一方面，使用位点特异性重组酶使包含vh、d和jh或者v
l
和j
l
基因区段的非牛科动物哺乳动物(诸如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)的内源免疫球蛋白基因座可变区缺失并且被工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代。在一方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座作为单个核酸或盒插入到宿主动物的基因组中。因为包含部分牛科动物免疫球蛋白基因座的盒被用来取代内源免疫球蛋白基因座可变区，牛科动物编码序列可以在单个插入步骤中插入到宿主基因组中，从而提供用于获得转基因动物的快速且直接的方法。
[0216]
在一方面，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座可变区通过使鼠vh、d和jh或者v
l
和j
l
编码序列从小鼠免疫球蛋白基因座可变区缺失并且用牛科动物编码序列取代鼠编码序列来制备。在一方面，包括调控序列和其他元件的鼠免疫球蛋白基因座的非编码侧翼序列保持完整。
[0217]
在一方面，用于工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的核苷酸序列进行计算机制备，并且该基因座使用用于基因合成的已知技术合成。在一方面，来自牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的编码序列和宿主动物免疫球蛋白基因座的序列使用诸如blast(基本局部比对搜索工具)的搜索工具来鉴定。在获得宿主免疫球蛋白基因座的基因组序列和牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的编码序列之后，宿主编码序列可以使用已知的计算方法用牛科动物编码序列进行计算机取代，以定位内源宿主动物免疫球蛋白编码区段和使之缺失，并且该编码序列被牛科动物编码序列取代，保持内源调控序列和侧翼序列完整。
[0218]
同源重组
[0219]
在一方面，使用同源重组和位点特异性重组的组合来产生本文描述的细胞和动物。在一些实施方案中，首先使用同源性靶向载体将序列特异性重组位点引入到哺乳动物宿主细胞基因组中内源免疫球蛋白基因座中的期望位置处。在一方面，在重组酶蛋白不存在的情况下，通过同源重组插入到哺乳动物宿主细胞基因组中的序列特异性重组位点不影响哺乳动物宿主细胞中任何基因的表达和氨基酸密码子。这种方法维持在插入重组位点以及任选地任何另外的序列诸如选择性标志物基因之后产生期望抗体的免疫球蛋白基因的
正确转录和翻译。然而，在一些情况下，将重组酶位点和其他序列插入到免疫球蛋白基因座序列中使得抗体分子的氨基酸序列通过插入而改变，但抗体仍保留用于所期望目的的足够功能是可能的。这样的改变密码子的同源重组的实例可以包括将多态性引入内源基因座中并改变恒定区外显子，使得由内源基因座表达不同的同种型。在一方面，免疫球蛋白基因座包括一个或更多个这样的插入。
[0220]
在一方面，同源性靶向载体可以用于取代内源基因组内的某些序列，以及将某些序列特异性重组位点和一个或更多个选择性标志物基因插入到宿主细胞基因组中。本领域普通技术人员应当理解，如本文使用的选择性标志物基因可以用于清除尚未经历同源重组的单独细胞和携带随机整合的靶向载体的细胞。
[0221]
用于同源重组的示例性方法描述于以下中：美国专利第6,689,610号；第6,204,061号；第5,631,153号；第5,627,059号；第5,487,992号；和第5,464,764号，所述专利中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
[0222]
位点/序列特异性重组
[0223]
位点/序列特异性重组与一般的同源重组的差异在于由重组酶识别所要求的短特异性dna序列是重组发生处的唯一位点。根据特定dna链或染色体上这些位点的方向，识别这些特定序列的专门重组酶可以催化i)dna切离或ii)dna倒位或旋转。如果这些位点不存在于同一条染色体上，位点特异性重组也可以发生在两条dna链之间。许多噬菌体和酵母来源的位点特异性重组系统(各自都包含重组酶和特定的同源位点)，已经被证明在真核细胞中工作，并且因此适用于与本文描述的方法结合使用，并且这些系统包括噬菌体p1 cre/lox、酵母flp-frt系统和位点特异性重组酶的酪氨酸家族的dre系统。这样的系统和使用方法描述于以下中：例如，美国专利第7,422,889号；第7,112,715号；第6,956,146号；第6,774,279号；第5,677,177号；第5,885,836号；第5,654,182号；和第4,959,317号，所述专利中的每一个都通过引用并入本文，以教导使用这样的重组酶的方法。
[0224]
已知位点特异性重组酶的酪氨酸家族的其他系统诸如噬菌体λ整合酶、hk2022整合酶以及属于重组酶的单独丝氨酸家族的另外系统诸如噬菌体phic31、r4tp901整合酶，使用它们各自的重组位点在哺乳动物细胞中工作，并且也适用于在本文描述的方法中使用。
[0225]
由于位点特异性重组可以发生在两条不同的dna链之间，位点特异性重组的发生可以用作通过称为重组酶介导的盒交换(rmce)的过程将外源基因座引入到宿主细胞基因组中的机制。rmce过程可以通过组合使用用于相同重组酶蛋白的野生型和突变体序列特异性重组位点与阴性选择一起来利用。例如，待靶向的染色体基因座的一个末端上的侧翼可以是野生型loxp位点，并且另一个末端上的侧翼可以是突变体loxp位点。同样，类似地，包含被插入到宿主细胞基因组中的序列的外源载体的一个末端上的侧翼可以是野生型loxp位点，并且另一个末端上的侧翼可以是突变体loxp位点。在这种外源载体在存在cre重组酶的情况下被转染到宿主细胞中时，cre重组酶催化两条dna链之间的rmce，而不是同一条dna链上的切离反应，因为每条dna链上的野生型loxp和突变体loxp位点对于彼此重组是不相容的。因此，一条dna链上的loxp位点会与另一条dna链上的loxp位点重组；类似地，一条dna链上的突变的loxp位点会仅与另一条dna链上同样突变的loxp位点重组。
[0226]
在一方面，使用被用于rmce的相同重组酶识别的序列特异性重组位点的组合变体。这样的序列特异性重组位点变体的实例包括包含反向重复序列的组合的那些变体或包
含具有突变体间隔区序列的重组位点的那些变体。例如，两类变体重组酶位点可用于工程化稳定的cre-loxp整合重组。二者都利用了cre识别序列中的在8bp间隔区内或在13bp反向重复序列内的序列突变。间隔区突变体诸如lox511(hoess，等人，nucleic acids res,14:2287-2300(1986))、lox5171和lox2272(lee和saito,gene,216:55-65(1998))、m2、m3、m7和m11(langer，等人，nucleic acids res,30:3067-3077(2002))容易地与自身重组，但与野生型位点具有显著降低的重组率。这类突变体已经使用非相互作用的cre-lox重组位点和非相互作用的flp重组位点通过rmce被利用于dna插入(baer和bode,curr opin biotechnol,12:473-480(2001)；albert，等人，plant j,7:649-659(1995)；seibler和bode,biochemistry,36:1740-1747(1997)；schlake和bode,biochemistry,33:12746-12751(1994))。
[0227]
反向重复序列突变体表示第二类变体重组酶位点。例如，loxp位点可以在左侧反向重复序列(le突变体)或右侧反向重复序列(re突变体)中包含改变的碱基。le突变体lox71，在左反向重复序列的5’末端上具有从野生型序列改变为taccg的5bp(araki，等人，nucleic acids res,25:868-872(1997))。类似地，re突变体lox66具有改变为cggta的5个最3’碱基。使用反向重复序列突变体将质粒插入物(plasmid inserts)整合到染色体dna中，其中le突变体被指定为“供体”re突变体重组到其中的“靶”染色体loxp位点。重组后，loxp位点位于插入区段的顺式侧翼。重组的机制使得，重组后一个loxp位点是双突变体(包含le和re反向重复序列突变二者)，并且另一个是野生型(lee和sadowski,prog nucleic acid res mol biol,80:1-42(2005)；lee和sadowski,j mol biol,326:397-412(2003))。双突变体与野生型位点有足够的差异，因为双突变体不能被cre重组酶识别，并且插入的区段不能被切离。
[0228]
在某些方面，与编码核酸区域或调控序列相反，序列特异性重组位点可以被引入到内含子中。这避免在将序列特异性重组位点插入动物细胞基因组中后无意中破坏适当抗体表达所需的任何调控序列或编码区。
[0229]
序列特异性重组位点的引入可以通过常规同源重组技术实现。这样的技术描述于参考文献中，诸如，例如sambrook和russell(2001)(molecular cloning:a laboratory manual第3版(cold spring harbor,n.y.:cold spring harbor laboratory press)和nagy,a.(2003).(manipulating the mouse embryo:a laboratory manual，第3版(cold spring harbor,n.y.:cold spring harbor laboratory press)。renault和duchateau，编著(2013)(site-directed insertion of transgenes.topics in current genetics 23.springer)。tsubouchi,h.ed.(2011)(dna recombination,methods and protocols.humana press)。
[0230]
特异性重组到基因组中可以使用如本领域已知的设计用于阳性或阴性选择的载体来促进。为了促进鉴定已经经历取代反应的细胞，可以使用适当的遗传标志物系统，并且细胞通过例如使用选择组织培养基来选择。然而，为了确保基因组序列在取代间隔区间的两个末端点处或附近大体上没有外来核酸序列，标志物系统/基因可以期望地在包含取代的核酸的细胞的选择之后去除。
[0231]
在一方面，在暴露于毒素或药物后，对内源免疫球蛋白基因座的全部或一部分已经发生取代的细胞进行阴性选择。例如，保留hsv-tk表达的细胞可以通过使用核苷类似物
诸如更昔洛韦来选择。在另一方面，包含内源免疫球蛋白基因座缺失的细胞可以通过使用标志物基因而被阳性选择，该标志物基因可以任选地在重组事件之后或作为重组事件的结果从细胞去除。可以使用的阳性选择系统基于对标志物基因诸如hprt的两个非功能性部分(它们通过重组事件聚集在一起)的使用。这两个部分在进行成功的取代反应后发生功能性缔合，并且其中功能地重构的标志物基因在任一侧的侧翼是另外的序列特异性重组位点(其不同于取代反应中使用的序列特异性重组位点)，使得标志物基因可以使用适当的位点特异性重组酶从基因组切离。
[0232]
重组酶可以作为纯化的蛋白提供，或者作为从瞬时转染到宿主细胞中或稳定整合到宿主细胞基因组中的载体构建体表达的蛋白提供。可选地，细胞可以首先用于产生转基因动物，然后该转基因动物可以与表达所述重组酶的动物杂交。
[0233]
因为本文描述的方法可以利用工程化基因组内的两组或更多组序列特异性重组位点，所以可以利用多轮rmce将部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因插入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组中。
[0234]
尽管尚未常规用于插入大的dna区段，但crispr-cas技术是引入嵌合牛科动物ig基因座的另一种方法。
[0235]
转基因动物的产生
[0236]
在一方面，提供了用于产生包含引入的部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物，例如啮齿动物，诸如小鼠的方法。
[0237]
在一方面，用于取代内源免疫球蛋白基因的宿主细胞是胚胎干(es)细胞，所述胚胎干(es)细胞然后可以用于产生转基因哺乳动物。在一方面，宿主细胞是早期胚胎的细胞。在一方面，宿主细胞是原核期胚胎或合子。因此，根据一方面，本文描述的方法还包括：分离包含引入的部分牛科动物免疫球蛋白基因座的胚胎干细胞或早期时期胚胎的细胞，诸如原核期胚胎或合子，并且使用所述es细胞产生包含取代的部分牛科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物。
[0238]
使用方法
[0239]
在一方面，提供了一种产生包含牛科动物可变区的抗体的方法。在一方面，方法包括提供本文描述的转基因啮齿动物或啮齿动物细胞，并且分离包含由转基因啮齿动物表达的牛科动物可变区的抗体。在一方面，提供了一种产生包含牛科动物可变区的单克隆抗体的方法。在一方面，方法包括提供来自本文描述的转基因啮齿动物或细胞的b细胞，使b细胞永生化；并且分离包含由永生化b细胞表达的牛科动物可变结构域的抗体。
[0240]
在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含牛科动物hc可变结构域。在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含小鼠hc恒定结构域。这些可以是任何同种型，igm、igd、igg1、igg2a/c、igg2b、igg3、ige或iga。
[0241]
在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含牛科动物hc可变结构域和小鼠hc恒定结构域。在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含牛科动物lc可变结构域和小鼠lc恒定结构域。在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含牛科动物hc可变结构域和牛科动物lc可变结构域以及小鼠hc恒定结构域和小鼠lc恒定结构域。
[0242]
在一方面，由转基因啮齿动物或啮齿动物细胞表达的抗体包含牛科动物λlc可变
tk)(203)，该融合蛋白的侧翼是两个不同的重组酶识别位点(例如，分别针对flp和cre的frt(207)和loxp(205))和两个不同的突变体位点(例如，修饰的突变体frt(209)和突变loxp(211))，该突变体位点缺乏与它们各自的野生型对应物/位点(即野生型frt(207)和野生型loxp(205))重组的能力。靶向载体包含白喉毒素受体(dtr)cdna(217)，用于在未来步骤中对包含引入的构建体的细胞的阴性选择中使用。靶向载体还任选地包含可视标志物，诸如绿色荧光蛋白(gfp)(未示出)。区域213和215分别与内源非牛科动物基因座中的邻接区域(229)的5’和3’部分同源，该邻接区域(229)处于包含内源非牛科动物vh基因区段(219)的基因组区域的5’。同源靶向载体(201)被引入(202)到es细胞中，该同源靶向载体(201)具有免疫球蛋白基因座(231)，该免疫球蛋白基因座(231)包含内源vh基因区段(219)、前d区(221)、d基因区段(223)、jh基因区段(225)和免疫球蛋白恒定区基因(227)。来自同源靶向载体(201)的位点特异性重组序列和dtr cdna被整合(204)到非牛科动物基因组中内源小鼠vh基因座5’位点处，产生233处所示的基因组结构。没有外源载体(201)整合到其基因组中的es细胞可以通过在培养培养基中包含嘌呤霉素而被选择(杀死)；仅已经将外源载体(201)稳定整合到其基因组中并组成型表达puro-tk基因的es细胞对嘌呤霉素是抗性的。
[0252]
图3有效地图示了与图2相同的方法，除了添加一组另外的序列特异性重组位点，例如rox位点(331)和修饰的rox位点(335)用于与dre重组酶一起使用。在图3中，提供了同源靶向载体(301)，该同源靶向载体(301)包含puro-tk融合蛋白(303)，所述融合蛋白的侧翼是针对frt(307)、loxp(305)和rox(331)的野生型重组酶识别位点以及针对分别缺乏与野生型位点307、305和331重组的能力的flp(309)、cre(311)和dre(335)重组酶的突变位点。靶向载体还包含白喉毒素受体(dtr)cdna(317)。区域313和315分别与内源非牛科动物基因座(339)中的邻接区域(329)的5’和3’部分同源，该邻接区域(329)处于包含内源小鼠vh基因区段(319)的基因组区域的5’。同源靶向载体被引入(302)到小鼠免疫球蛋白基因座(339)中，该小鼠免疫球蛋白基因座(339)包含内源vh基因区段(319)、前d区(321)、d基因区段(323)、jh(325)基因区段和igh基因座的恒定区基因(327)。同源靶向载体(301)中的位点特异性重组序列和dtr cdna(317)被整合(304)到内源小鼠vh基因座5’位点处的小鼠基因组中，产生333处所示的基因组结构。
[0253]
如图4中图示的，提供了第二同源靶向载体(401)，该第二同源靶向载体(401)包含任选的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因(435)(该基因可以用于hprt缺陷型es细胞中的阳性选择)；新霉素抗性基因(437)；分别针对flp和cre的重组酶识别位点frt(407)和loxp(405)，其具有与先前从第一同源靶向载体整合到小鼠基因组的frt(407)和loxp(405)位点重组的能力。先前的同源靶向载体还包含突变体frt位点(409)、突变体loxp位点(411)、puro-tk融合蛋白(403)和位于内源小鼠vh基因座的5’的位点处的dtr cdna(419)。区域429和439分别与位于内源jh基因区段(425)下游和恒定区基因(427)上游的内源非牛科动物基因座中的邻接区域(441)的5’和3’部分同源。同源靶向载体被引入(402)到修饰的小鼠免疫球蛋白基因座(431)中，该修饰的小鼠免疫球蛋白基因座(431)包含内源vh基因区段(419)、前d区(421)、d基因区段(423)、jh基因区段(425)和恒定区基因(427)。同源靶向载体的位点特异性重组序列(407，405)、hprt基因(435)和新霉素抗性基因(437)被整合(404)到内源小鼠恒定区基因(427)上游的小鼠基因组中，产生433处所示的基因组结构。
[0254]
在重组位点被整合到哺乳动物宿主细胞基因组中后，然后免疫球蛋白结构域的内源区域经历通过引入对应于整合到基因组中的序列特异性重组位点的重组酶之一例如flp或cre进行的重组。图5中图示了包含两个整合的dna片段的哺乳动物宿主细胞基因组的修饰的igh基因座。包含突变体frt位点(509)、突变体loxp位点(511)、puro-tk基因(503)、野生型frt位点(507)和野生型loxp位点(505)和dtr cdna(517)的一个片段被整合在vh基因座(519)的上游。包含hprt基因(535)、新霉素抗性基因(537)、野生型frt位点(507)和野生型loxp位点(505)的另一个dna片段被整合在前d(521)、d(523)和jh(525)基因座的下游，但在恒定区基因(527)的上游。在flp或cre(502)存在的情况下，野生型frt或野生型loxp位点之间的全部间插序列，包括dtr基因(517)、内源igh可变区基因座(519、521、525)以及hprt(535)和新霉素抗性(537)基因在内是缺失的，产生539处所示的基因组结构。程序依赖于已经发生在同一染色体上的第二靶向而不是依赖于其同源物(即顺式而不是反式)。如果靶向按预期以顺式发生，细胞在cre-或flp-介导的重组之后通过引入到培养基中的白喉毒素对阴性选择不敏感，因为引起啮齿动物中对白喉毒素的敏感性的dtr基因应该在宿主细胞基因组中不存在(缺失)。同样，携带随机整合的第一或第二靶向载体的es细胞由于未缺失的dtr基因的存在而被赋予对白喉毒素的敏感性。
[0255]
然后筛选对白喉毒素不敏感的es细胞的内源可变区基因座的缺失。缺失的内源免疫球蛋白基因座的初级筛选方法可以通过dna印迹进行，或者通过聚合酶链式反应(pcr)进行，随后是用二级筛选技术诸如dna印迹进行确认。
[0256]
图6图示了将工程化部分牛科动物序列引入到非牛科动物基因组中，该非牛科动物基因组先前被修饰以使编码重链可变区结构域的部分内源igh基因座(vh、d和jh)以及vh与jh基因座之间的全部间插序列缺失。将位点特异性靶向载体(629)引入(602)到宿主细胞中，该位点特异性靶向载体(629)包含部分牛科动物vh基因座(619)、内源非牛科动物前d基因区(621)、部分牛科动物d基因座(623)、部分牛科动物jh基因座(625)以及在侧翼的突变体frt(609)、突变体loxp(611)、野生型frt(607)和野生型loxp(605)位点。特别地，部分牛科动物vh基因座(619)包含与基于内源非牛科动物基因组序列的间插序列结合的20个牛科动物vh编码序列；前d区(621)包含与内源牛科动物igh基因座的对应区域具有显著同源性的21.6kb小鼠序列；d基因座(623)包含嵌入内源非牛科动物d基因区段周围的间插序列中的10个d基因区段的密码子；并且jh基因座(625)包含嵌入基于内源非牛科动物基因组的间插序列中的4个牛科动物jh基因区段的密码子。宿主细胞基因组的igh基因座(601)先前已经被修饰以缺失全部vh、d和jh基因区段，包括如图5中描述的间插序列。作为这种修饰的结果，内源非牛科动物宿主细胞igh基因座(601)留有puro-tk融合基因(603)，该puro-tk融合基因(603)侧翼是上游的突变体frt位点(609)和突变体loxp位点(611)以及下游的野生型frt(607)和野生型loxp(605)。引入适当的重组酶(604)后，部分牛科动物免疫球蛋白基因座被整合到内源非牛科动物恒定区基因(627)上游的基因组中，产生631处所示的基因组结构。
[0257]
牛科动物vh、d和jh基因区段编码区的序列在表1中。
[0258]
用于引入部分牛科动物免疫球蛋白基因座的初级筛选程序可以通过dna印迹进行，或者通过pcr进行，随后用二级筛选方法诸如dna印迹进行确认。筛选方法旨在检测插入的vh、d和jh基因座以及全部间插序列的存在。
[0259]
实施例2：将包含另外的非编码调控或支架序列的工程化部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座引入到非牛科动物哺乳动物宿主细胞基因组的免疫球蛋白h链可变区基因座中
[0260]
在某些方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含如实施例1中描述的元件，但是具有另外的非编码调控或支架序列，例如策略性地添加以进行以下的序列：引入另外的调控序列，确保引入的免疫球蛋白基因座中的期望间隔(spacing)，确保某些编码序列与其他的与被取代的免疫球蛋白基因座相邻的序列充分并列，等等。图7图示了将第二个示例性工程化部分牛科动物序列引入到如图2-图5中产生并在以上实施例1中描述的修饰的非牛科动物基因组中。
[0261]
图7图示了将工程化部分牛科动物序列引入到小鼠基因组中，该小鼠基因组先前被修饰以使编码重链可变区结构域的部分内源非牛科动物igh基因座(vh、d和jh)以及内源vh与jh基因座之间的全部间插序列缺失。将位点特异性靶向载体(731)引入(702)到基因组区域(701)中，该位点特异性靶向载体(731)包含待插入到非牛科动物宿主基因组中的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座。将位点特异性靶向载体(731)引入(702)到宿主细胞中，该位点特异性靶向载体(731)包含部分牛科动物vh基因座(719)、小鼠前d区(721)、部分牛科动物d基因座(723)、部分牛科动物jh基因座(725)、pair元件(741)以及在侧翼的突变体frt(709)、突变体loxp(711)、野生型frt(707)和野生型loxp(705)位点。特别地，工程化部分牛科动物vh基因座(719)包含与基于内源非牛科动物基因组序列的间插序列结合的20个牛科动物vh基因区段编码区；前d区(721)包含存在于内源非牛科动物基因组上游的21.6kb非牛科动物序列；d区(723)包含嵌入内源非牛科动物d基因区段周围的间插序列中的10个牛科动物d基因区段的密码子；并且jh基因座(725)包含嵌入基于内源非牛科动物基因组序列的间插序列中的4个牛科动物jh基因区段的密码子。宿主细胞基因组的igh基因座(701)先前已经被修饰以缺失全部vh、d和jh基因区段，包括如关于图5中描述的间插序列。作为这种修饰的结果，内源非牛科动物igh基因座(701)留有puro-tk融合基因(703)，该puro-tk融合基因(703)的侧翼是上游的突变体frt位点(709)和突变体loxp位点(711)以及下游的野生型frt(707)和野生型loxp(705)。引入适当的重组酶(704)后，工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座被整合到内源小鼠恒定区基因(727)上游的基因组中，产生729处所示的基因组结构。
[0262]
引入工程化部分牛科动物免疫球蛋白区域的初级筛选程序可以通过dna印迹进行，或者通过pcr进行，其中用二级筛选方法诸如dna印迹进行确认。筛选方法旨在检测插入的pair元件、vh、d和jh基因座以及全部间插序列的存在。
[0263]
实施例3：将工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座引入到小鼠基因组的免疫球蛋白重链基因座中
[0264]
图8图示了用工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代小鼠基因组的一部分的方法。该方法利用了将第一位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，随后将第二位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中。这两个位点位于小鼠内源vh、d和jh区基因区段的整个簇的侧翼。如本文描述的，使用相关的位点特异性重组酶使有侧翼的区域(flanked region)缺失。
[0265]
用于在野生型小鼠免疫球蛋白基因座(801)中的vh(815)、d(817)和jh(819)基因区
段簇的任一侧和恒定区基因(821)的上游引入位点特异性重组酶序列的靶向载体(803、805)包含另外的位点特异性重组序列，该另外的位点特异性重组序列已经被修饰使得它仍然被重组酶有效识别，但是不与未修饰的位点重组。该修饰的突变体位点(例如lox5171)位于靶向载体中，使得在内源vh、d和jh基因区段缺失(802)之后，该修饰的突变体位点可以用于其中非天然的dna片段被rmce移入修饰的igh基因座中的第二位点特异性重组事件。在本实施例中，非天然的dna是包含牛科动物和非牛科动物序列二者的合成核酸(809)。
[0266]
构建两个基因靶向载体来完成刚刚概述的方法。载体之一(803)包含取自最远端vh基因区段上游的igh基因座5’末端的小鼠基因组dna。另一个载体(805)包含取自jh基因区段下游的基因座内的小鼠基因组dna。
[0267]5’
载体(803)从5’至3’顺序的关键特征如下：在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(823)；在igh基因座中最远端的vh基因区段上游定位的4.5kb小鼠基因组dna(825)；用于flp重组酶的frt识别序列(827)；包含小鼠polr2a基因启动子的基因组dna片段(829)；翻译起始序列(嵌入“kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子835))；用于cre重组酶的突变loxp识别序列(lox5171)(831)；转录终止/多腺苷酸化序列(pa.833)；用于cre重组酶的loxp识别序列(837)；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下编码融合蛋白的基因(839)，所述融合蛋白具有与胸苷激酶的截短形式融合的赋予嘌呤霉素抗性的蛋白(pu-tk)；以及在存在于载体5’末端附近并以天然相对方向排列的4.5kb小鼠基因组dna序列附近定位的3kb小鼠基因组dna(841)。
[0268]3’
载体(805)从5’至3’顺序的关键特征如下：在jh与ch基因座之间的内含子中定位的3.7kb小鼠基因组dna(843)；在小鼠polr2a基因启动子转录控制下的hprt基因(845)；小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子控制下的新霉素抗性基因(847)；cre重组酶的loxp识别序列(837)；在紧邻存在于载体5’末端附近并且以天然相对方向排列的3.7kb小鼠基因组dna片段的下游定位的2.1kb小鼠基因组dna(849)；以及在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码dta亚基的基因(823)。
[0269]
根据广泛使用的程序，将小鼠胚胎干(es)细胞(来源于c57b1/6ntac小鼠)通过电穿孔用3’载体(805)转染。在电穿孔之前，将载体dna用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头(polylinker)。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，将其置于通过使用新霉素类似物药物g418对已经将3’载体整合到其dna中的细胞进行的阳性选择下。也存在阴性选择用于已经将载体整合到其dna中但不是通过同源重组进行整合的细胞。非同源重组导致dta基因(823)的保留，在基因表达时dta基因(823)杀死细胞，而dta基因因为位于与小鼠igh基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。约一周之后，在药物抗性es细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性es细胞的集落从其板上物理提取。这些挑选的集落被分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，每个细胞克隆被分配，使得一些细胞可以被冷冻作为存档材料(archive)，并且其余的用于dna的分离而用于分析目的。
[0270]
来自es细胞克隆的dna通过pcr使用广泛实践的基因靶向测定设计进行筛选。对于该测定，一种pcr寡核苷酸引物序列定位在3’载体(805)与基因组dna之间共有同一性的区
域之外，而另一种pcr寡核苷酸引物序列定位在载体中有基因组同一性的两条臂之间的新dna中，即hprt(845)或新霉素抗性(847)基因中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于来源于转染细胞的es细胞克隆中的dna片段，所述转染细胞经历3’靶向载体与内源小鼠igh基因座之间完全正常(fully legitimate)的同源重组。两次单独的转染用3’载体(805)进行。选择来自两次转染的pcr阳性克隆进行扩增，随后使用dna印迹测定进一步分析。
[0271]
dna印迹测定根据广泛使用的程序使用三种探针和用选择的多种限制酶消化的基因组dna进行，使得探针和消化物的组合允许克隆中靶向基因座的结构被鉴定为通过同源重组适当修饰。探针之一定位至位于3’靶向载体与基因组dna之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的dna序列；第二探针定位在同一性区域之外，但在3’侧；并且第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新dna中，即在hprt(845)或新霉素抗性(847)基因中。dna印迹鉴定预期限制性酶产生的dna片段的存在，所述dna片段对应于由一种外部探针和由新霉素或hprt探针检测到的经正确突变(即通过使用3’igh靶向载体的同源重组)的igh基因座的一部分。外部探针检测突变体片段和也检测来自同源染色体上免疫球蛋白igh基因座的非突变体拷贝的野生型片段。
[0272]
es细胞的pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。基于dna印迹数据判断具有预期的正确基因组结构并且基于核型分析也没有可检测到的染色体畸变的es细胞克隆被选择用于进一步使用。
[0273]
然后可接受的克隆用5’载体(803)使用以下程序和筛选测定进行修饰：所述程序和筛选测定在设计上类似于与3’载体(805)一起使用的那些程序和筛选测定，不同之处在于使用嘌呤霉素选择替代g418/新霉素进行选择。pcr测定、探针和消化物也被定制以匹配被5’载体(805)修饰的基因组区域。
[0274]
在载体靶向和分析之后分离出已经通过3’载体和5’载体二者以预期方式突变的es细胞克隆，即携带两种工程化突变的双重靶向细胞。与同源染色体相反，克隆必须在同一条染色体上经历基因靶向(即通过靶向载体产生的工程化突变必须在同一条dna链上呈顺式，而不是在分开的同源dna链上呈反式)。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的克隆通过分析程序诸如使用探针的中期涂片(metaphase spreads)的荧光原位杂交区分开，所述探针与存在于两个基因靶向载体(803和805)的其有基因组同一性的臂之间的新dna杂交。两种类型的克隆也可以通过以下来彼此区分开：用表达cre重组酶的载体(如果靶向载体已经以顺式整合，则该载体使pu-tk(839)、hprt(845)和新霉素抗性(847)基因缺失)转染它们，并且然后将针对通过5’载体(803)引入的胸苷激酶基因进行更昔洛韦选择而存活的集落数进行比较，并且通过“亲缘种选择(sibling selection)”筛选程序(其中测试了来自克隆的一些细胞对嘌呤霉素或g418/新霉素的抗性)分析存活克隆的药物抗性表型。具有顺式突变排列的细胞预期比具有反式排列的细胞产生大约多103个更昔洛韦抗性克隆。大多数所得的顺式来源的更昔洛韦抗性克隆也对嘌呤霉素和g418/新霉素二者都敏感，相比之下，反式来源的更昔洛韦抗性克隆应该对这两种药物都保留抗性。选择重链基因座中具有工程化突变的顺式排列的双重靶向细胞克隆用于进一步使用。
[0275]
将双重靶向细胞克隆用表达cre重组酶的载体瞬时转染，并且随后将转染的细胞置于更昔洛韦选择下，如在以上总结的分析实验中的那样。分离出更昔洛韦抗性的细胞克
隆，并且通过pcr和dna印迹分析由5’(803)和3’(805)靶向载体产生的两个工程化突变之间的预期缺失的存在。在这些克隆中，cre重组酶引起由两个载体引入到重链基因座的loxp位点(837)之间发生重组(802)，以产生807处所示的基因组dna构型。因为loxp位点在两个载体中以相同相对方向排列，重组导致包含两个loxp位点之间整个基因组区间(genomic interval)的dna圈(a circle of dna)被切下。该圈不包含复制起点，并且因此在有丝分裂期间不被复制，并且因此在细胞经历增殖时从细胞中损失。所得的克隆携带最初位于两个loxp位点之间的缺失。选择具有预期缺失的克隆用于进一步使用。
[0276]
在其免疫球蛋白重链基因座的两个同源拷贝之一中携带序列缺失的es细胞克隆用cre重组酶表达载体与包含部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座的dna片段(809)一起再转染(804)，所述部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座包含牛科动物vh、d和jh区基因编码区序列，侧翼是小鼠调控和侧翼序列。该合成dna片段(809)的关键特征如下：lox5171位点(831)；新霉素抗性基因开放阅读框(847)，该开放阅读框缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框(in-frame)并与lox5171位点中的不间断开放阅读框邻接；frt位点(827)；20个牛科动物vh重链可变区基因的阵列(851)，每个基因具有嵌入小鼠非编码序列中的牛科动物编码序列；任选地，来自小鼠重链基因座的10kb前d区(未示出)；包含10个牛科动物d基因区段(853)和4个牛科动物jh基因区段(855)的58kb dna片段，其中牛科动物vh、d和jh编码序列嵌入小鼠非编码序列中；与lox5171位点(831)在相反的相对方向的loxp位点(837)。
[0277]
将转染的克隆置于g418选择下，这富集了已经经历rmce的细胞克隆，其中工程化部分牛科动物供体免疫球蛋白基因座(809)以其整体被整合到lox5171(831)与loxp(837)位点之间缺失的内源免疫球蛋白重链基因座中，以产生811处所示的dna区域。仅已经适当地经历rmce的细胞才具有表达新霉素抗性基因(847)的能力，因为其表达所要求的启动子(829)和起始甲硫氨酸密码子(835)不存在于载体(809)中，但已经预先存在于宿主细胞igh基因座(807)中。来自5’载体(803)中的剩余元件经由flp介导的体外或体内重组(806)去除，产生如813处所示的最终基于牛科动物的基因座。
[0278]
g418抗性es细胞克隆通过pcr和dna印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的rmce过程而没有不想要的重排或缺失。选择具有预期基因组结构的克隆用于进一步使用。
[0279]
根据标准程序，将小鼠重链基因座中携带部分牛科动物免疫球蛋白重链dna(813)的es细胞克隆显微注射到来自品系dba/2的小鼠胚泡中，以产生部分es细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的es细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。这里选择的雌性小鼠是c57b1/6ntac品系，并且还携带编码在其种系中表达的flp重组酶的转基因。分析来自这些交配的后代的部分牛科动物免疫球蛋白重链基因座的存在，以及在rmce步骤中产生的侧翼为frt的新霉素抗性基因的损失。携带部分牛科动物基因座的小鼠用于建立小鼠的集落。
[0280]
实施例4：将工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座引入到小鼠基因组的免疫球蛋白κ链基因座中
[0281]
图9图示了用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代小鼠基因组的一部分的另一种方法。该方法包括将第一位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，随后将第二位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，该第一位点特异性重组酶识别序列可以被引入小鼠基因组的内源v
κ
(915)和j
κ
(919)区基因区段簇的5’或3’，与第一序列特异性重组
位点组合的该第二位点特异性重组酶识别序列位于包含恒定区基因(921)上游的v
κ
和j
κ
基因区段簇的整个基因座的侧翼。有侧翼的区域缺失，并且然后使用相关的位点特异性重组酶用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代，如本文描述的。
[0282]
用于在v
κ
(915)和j
κ
(919)基因区段的任一侧引入位点特异性重组序列的靶向载体也包含另外的位点特异性重组序列，该另外的位点特异性重组序列已经被修饰使得它仍然被重组酶有效识别，但是不与未修饰的位点重组。该位点位于靶向载体中，使得在v
κ
和j
κ
基因区段簇缺失之后，它可以用于其中非天然的dna片段经由rmce移入到修饰的v
κ
基因座中的第二位点特异性重组事件。在本实施例中，非天然的dna是包含嵌入在小鼠调控和侧翼序列中的牛科动物v
κ
和j
κ
基因区段编码序列的合成核酸。
[0283]
构建两个基因靶向载体来完成刚刚概述的方法。载体之一(903)包含取自最远端v
κ
基因区段上游的基因座的5’末端的小鼠基因组dna。另一个载体(905)包含取自j
κ
基因区段(919)下游(3’)和恒定区基因(921)上游的基因座内的小鼠基因组dna。
[0284]5’
载体(903)的关键特征如下：在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(923)；在κ链基因座中最远端可变区基因的上游定位的6kb小鼠基因组dna(925)；用于flp重组酶的frt识别序列(927)；包含小鼠polr2a基因启动子的基因组dna片段(929)；翻译起始序列(935，嵌入“kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；用于cre重组酶的突变loxp识别序列(lox5171)(931)；转录终止/多腺苷酸化序列(933)；用于cre重组酶的loxp识别序列(937)；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下编码融合蛋白的基因(939)，所述融合蛋白具有与胸苷激酶的截短形式融合的赋予嘌呤霉素抗性的蛋白(pu-tk)；在载体中5’末端并以天然相对方向排列的6kb序列附近定位的2.5kb小鼠基因组dna(941)。
[0285]3’
载体(905)的主要特征如下：在j
κ
(919)与c
κ
(921)基因座之间的内含子中定位的6kb小鼠基因组dna(943)；在小鼠polr2a基因启动子的转录控制下编码人类次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)的基因(945)；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子控制下的新霉素抗性基因(947)；用于cre重组酶的loxp识别序列(937)；在紧邻载体5’末端处包含的6kb dna片段的基因组下游定位的3.6kb小鼠基因组dna(949)，其中两个片段以与小鼠基因组相同的转录方向来取向；在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(923)。
[0286]
根据广泛使用的程序，将来源于c57b1/6ntac小鼠的小鼠胚胎干(es)细胞通过电穿孔用3’载体(905)转染。在电穿孔之前，将载体dna用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，将其置于通过使用新霉素类似物药物g418对已经将3’载体整合到其dna中的细胞进行的阳性选择下。也存在阴性选择用于已经将载体整合到其dna中但不是通过同源重组进行整合的细胞。非同源重组导致dta基因的保留，在基因表达时dta基因杀死细胞，而dta基因因为位于与小鼠igk基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。约一周之后，在药物抗性es细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性es细胞的集落从其板上物理提取。这些挑选的集落被分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，每个细胞克隆被分配，使得一些细胞可以被冷冻作为存档材料，并且其余的用于dna的分离而用于分析目的。
[0287]
来自es细胞克隆的dna通过pcr使用广泛使用的基因靶向测定设计进行筛选。对于该测定，一种pcr寡核苷酸引物序列定位在3’载体(905)与基因组dna(901)之间共有同一性的区域之外，而另一种pcr寡核苷酸引物序列定位在载体中有基因组同一性的两条臂之间的新dna中，即hprt(945)或新霉素抗性(947)基因中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于来源于转染细胞的es细胞克隆中的dna片段，所述转染细胞已经经历3’载体(905)与内源小鼠igk基因座之间完全正常的同源重组。两次单独的转染用3’载体(905)进行。选择来自两次转染的pcr阳性克隆进行扩增，随后使用dna印迹测定进一步分析。
[0288]
dna印迹测定根据广泛使用的程序进行；dna印迹包括三种探针和用所选的多种限制酶消化的基因组dna，使得探针和消化物的组合允许得出关于以下的结论：克隆中靶向的基因座的结构以及其是否通过同源重组被适当修饰。探针之一定位至位于3’κ靶向载体(905)与基因组dna之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的dna序列；第二探针还定位在同一性区域之外，但在3’侧；第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新dna中，即在hprt(945)或新霉素抗性(947)基因中。dna印迹鉴定预期限制酶产生的dna片段的存在，所述dna片段对应于由一种外部探针和由新霉素抗性或hprt基因探针检测到的经正确突变(即通过用3’κ靶向载体(905)的同源重组)的κ基因座的一部分。外部探针检测突变体片段和也检测来自同源染色体上免疫球蛋白κ基因座的非突变体拷贝的野生型片段。
[0289]
es细胞的pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。选择基于dna印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆(karyoptypically normal clones)用于进一步使用。
[0290]
然后可接受的克隆用5’载体(903)使用以下程序和筛选测定进行修饰：所述程序和筛选测定在设计上类似于与3’载体(905)一起使用的那些程序和筛选测定，不同之处在于使用嘌呤霉素选择替代g418/新霉素选择，并且定制方案以匹配由5’载体(903)修饰的基因组区域。5’载体(903)转染实验的目标是分离出已经被3’载体(905)和5’载体(903)二者以预期方式突变的es细胞克隆，即携带两种工程化突变的双重靶向细胞。在这些克隆中，cre重组酶引起由两个载体引入到κ基因座中的loxp位点之间发生重组(902)，产生907处所示的基因组dna构型。
[0291]
此外，与同源染色体相反，克隆必须在同一条染色体上经历基因靶向；即通过靶向载体产生的工程化突变必须在同一条dna链上呈顺式，而不是在分开的同源dna链上呈反式。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的克隆通过分析程序诸如使用探针的中期涂片的荧光原位杂交区分开，所述探针与存在于两个基因靶向载体(903和905)的其有基因组同一性的臂之间的新dna杂交。两种类型的克隆也可以通过以下来彼此区分开：用表达cre重组酶的载体(如果靶向载体已经以顺式整合，则该载体使pu-tk(939)、hprt(945)和新霉素抗性(947)基因缺失)转染它们，并且将针对通过5’载体(903)引入的胸苷激酶基因进行更昔洛韦选择而存活的集落数进行比较，并且通过“亲缘种选择”筛选程序(其中测试了来自克隆的一些细胞对嘌呤霉素或g418/新霉素的抗性)分析存活克隆的药物抗性表型。具有顺式突变排列的细胞预期比具有反式排列的细胞产生大约多103个更昔洛韦抗性克隆。大多数所得的顺式来源的更昔洛韦抗性克隆应该也对嘌呤霉素和g418/新霉素二者都敏感，相比之下，反式来源的更昔洛韦抗性克隆应该对这两种药物都保留抗性。选择κ链基因座中具
有工程化突变的顺式排列的细胞克隆用于进一步使用。
[0292]
将双重靶向的细胞克隆用表达cre重组酶的载体瞬时转染(902)，并且随后将转染的细胞置于更昔洛韦选择下，如在以上总结的分析实验中的那样。分离出更昔洛韦抗性的细胞克隆，并且通过pcr和dna印迹分析由5’载体(903)和3’载体(905)产生的两个工程化突变之间的预期缺失(907)的存在。在这些克隆中，cre重组酶已经引起由两个载体引入到κ链基因座中的loxp位点(937)之间发生重组。因为loxp位点在两个载体中以相同的相对方向排列，重组导致包含两个loxp位点之间整个基因组区间的dna圈被切下。该圈不包含复制起点，并且因此在有丝分裂期间不被复制，并且因此在细胞经历克隆增殖时从细胞克隆中损失。所得的克隆携带最初位于两个loxp位点之间的缺失。选择具有预期缺失的克隆用于进一步使用。
[0293]
在其免疫球蛋白κ链基因座的两个同源拷贝之一中携带序列缺失的es细胞克隆用cre重组酶表达载体与包含部分牛科动物免疫球蛋白κ链基因座的dna片段(909)一起再转染(904)，所述部分牛科动物免疫球蛋白κ链基因座包含v
κ
(951)和j
κ
(955)基因区段编码序列。该dna片段(称为“k-k”)的关键特征如下：lox5171位点(931)；新霉素抗性基因开放阅读框(947，缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框并与lox5171位点(931)中的不间断开放阅读框邻接)；frt位点(927)；8个牛科动物v
κ
基因区段的阵列(951)，每个区段具有嵌入小鼠非编码序列中的牛科动物编码序列；任选地，来自紧邻小鼠κ链基因座(未示出)中的j
κ
区基因区段簇上游的13.5kb基因组dna片段；包含嵌入小鼠非编码dna中的3个牛科动物j
κ
区基因区段的2kb dna片段(955)；与lox5171位点(931)在相反的相对方向的loxp位点(937)。
[0294]
牛科动物v
κ
和j
κ
基因编码区的序列在表2中。
[0295]
在第二个独立的实验中，使用替代的部分牛科动物dna片段(909)代替k-k dna。该dna(称为“l-k”)的关键特征如下：lox5171位点(931)；新霉素抗性基因开放阅读框(947)，该开放阅读框缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框并与lox5171位点(931)中的不间断开放阅读框邻接；frt位点(927)；25个功能性牛科动物v
λ
可变区基因区段的阵列(951)，每个区段具有嵌入小鼠非编码调控或支架序列中的牛科动物编码序列；任选地，来自紧邻小鼠κ链基因座中的j
κ
区基因区段簇上游的13.5kb基因组dna片段(未示出)；包含嵌入小鼠非编码dna中的牛科动物j
λ
区基因区段的2kb dna片段(955)；与lox5171位点(931)在相反的相对方向的loxp位点(937)。
[0296]
将来自k-k和l-k转染实验的转染克隆置于g418选择下，这富集已经经历rmce的细胞克隆，其中部分牛科动物供体dna(909)以其整体被整合到分别由5’(903)和3’(905)载体置于其处的lox5171(931)与loxp(937)位点之间缺失的免疫球蛋白κ链基因座中。仅已经适当地经历rmce的细胞才具有表达新霉素抗性基因(947)的能力，因为其表达所要求的启动子(929)和起始甲硫氨酸密码子(935)不存在于载体(909)中，并且已经预先存在于宿主细胞igh基因座(907)中。使用k-k序列产生的dna区域在911处示出。来自5’载体(903)中的剩余元件经由flp介导的重组(906)在体外或体内去除，产生如913处所示的最终基于牛科动物的轻链基因座。
[0297]
g418抗性es细胞克隆通过pcr和dna印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的rmce过程而没有不想要的重排或缺失。选择具有预期基因组结构的k-k和l-k克隆二者用于进一步使用。
[0298]
根据标准程序，将小鼠κ链基因座中携带部分牛科动物免疫球蛋白dna(913)的k-k es细胞克隆和l-k es细胞克隆显微注射到来自品系dba/2的小鼠胚泡中，以产生部分es细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的es细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。选择用于在交配中使用的雌性小鼠是c57b1/6ntac品系，并且还携带编码在其种系中表达的flp重组酶的转基因。分析来自这些交配的后代的部分牛科动物免疫球蛋白κ或λ轻链基因座的存在，以及在rmce步骤中产生的侧翼为frt的新霉素抗性基因的损失。携带部分牛科动物基因座的小鼠用于建立k-k和l-k小鼠的集落。
[0299]
如实施例3中描述地产生的携带部分牛科动物重链基因座的小鼠可以与携带基于牛科动物的κ链基因座的小鼠一起育种。继而将它们的后代在一个方案中一起育种，最终产生的小鼠的两个基于牛科动物的基因座(即，基于牛科动物的重链和κ)均是纯合的。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座产生具有牛科动物κ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分牛科动物κ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有与牛科动物κ可变结构域配对的牛科动物重链可变结构域。
[0300]
育种方案的一种变化形式包括产生这样的小鼠，所述小鼠的基于牛科动物的重链基因座是纯合的，但在κ基因座处是杂合的，使得在一条染色体上它们具有k-k基于牛科动物的基因座，并且在另一条染色体上它们具有l-k基于牛科动物的基因座。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座之一产生具有牛科动物κ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分牛科动物κ蛋白。从另一个κ基因座，这样的小鼠产生具有牛科动物λ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分牛科动物λ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有在一些情况下与牛科动物κ可变结构域配对并且在其他情况下与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物可变结构域。
[0301]
实施例5：将工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座引入到小鼠基因组的免疫球蛋白λ链基因座中
[0302]
图10图示了用工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代小鼠基因组的一部分的另一种方法。该方法包括通过同源重组方法从野生型小鼠免疫球蛋白λ基因座(1001)中缺失大约194kb的dna，所述野生型小鼠免疫球蛋白λ基因座(1001)包含v
λx
/v
λ2
基因区段(1013)、j
λ2
/c
λ2
基因簇(1015)和v
λ1
基因区段(1017)，所述同源重组方法包括涉及与v
λx
/v
λ2
基因区段(1013)上游和v
λ1
基因区段(1017)下游紧邻j
λ3
、c
λ3
、j
λ1
和c
λ1
λ基因簇(1023)二者的基因座共有同一性的靶向载体(1003)。该载体用被设计为允许随后的位点特异性重组的元件取代194kb的dna，在位点特异性重组中非天然的dna片段经由rmce(1004)移动到修饰的v
λ
基因座中。在本实施例中，非天然的dna是包含牛科动物和小鼠序列二者的合成核酸。
[0303]
用于完成194kb缺失的基因靶向载体(1003)的关键特征如下：阴性选择基因，诸如编码白喉毒素a亚基(dta，1059)的基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(未示出)；来自λ基因座中小鼠v
λx
/v
λ2
可变区基因区段的5’的4kb基因组dna(1025)；frt位点(1027)；包含小鼠polr2a基因启动子的基因组dna片段(1029)；翻译起始序列(嵌入“kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)(1035)；用于cre重组酶的突变loxp识别序列(lox5171)(1031)；转录终止/多腺苷酸化序列(1033)；编码赋予对嘌呤霉素抗性的蛋白的开放阅读框(1037)，而该开放阅读框位于相对于polr2a启动子及紧邻其的翻译起始序列的反义链上，并且随后是其自身
的转录终止/多腺苷酸化序列(1033)；用于cre重组酶的loxp识别序列(1039)；在与嘌呤霉素抗性基因开放阅读框相同的反义链上的翻译起始序列(嵌入“kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)(1035)；鸡β肌动蛋白启动子和被定向为使得其指导嘌呤霉素抗性开放阅读框的转录的巨细胞病毒早期增强子元件(1041)，其中翻译起始于loxp位点下游的起始密码子处，并且继续通过loxp位点回到嘌呤霉素开放阅读框，全部这些都在相对于polr2a启动子及紧邻其的翻译起始序列的反义链上；用于flp重组酶的突变识别位点，称为“f3”位点(1043)；在j
λ3
、c
λ3
、j
λ1
和c
λ1
基因区段上游的基因组dna片段(1045)。
[0304]
根据广泛使用的程序，将来源于c57b1/6ntac小鼠的小鼠胚胎干(es)细胞通过电穿孔用靶向载体(1003)转染(1002)。同源重组用196kb区域中来自靶向载体(1003)的序列取代天然dna，产生1005处描绘的基因组dna构型。
[0305]
在电穿孔之前，将载体dna用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，将其置于使用嘌呤霉素的阳性药物选择下。也存在阴性选择用于已经将载体整合到其dna中但不是通过同源重组进行整合的细胞。非同源重组导致dta基因的保留，在基因表达时dta基因杀死细胞，而dta基因因为位于与小鼠igl基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。大约一周之后，在药物抗性es细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性es细胞的集落从其板上物理提取。这些挑选的集落被分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，每个细胞克隆被分配，使得一些细胞被冷冻作为存档材料，并且其余的用于dna的分离而用于分析目的。
[0306]
来自es细胞克隆的dna通过pcr使用广泛使用的基因靶向测定设计进行筛选。对于这些测定，一种pcr寡核苷酸引物序列定位在靶向载体与基因组dna之间共有同一性的区域之外，而另一种pcr寡核苷酸引物序列定位在载体中有基因组同一性的两条臂之间的新dna中，例如puro基因(1037)中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于来源于转染细胞的细胞克隆中的dna片段，所述转染细胞已经经历靶向载体(1003)与天然dna(1001)之间完全正常的同源重组。
[0307]
选择来自转染(1002)的6个pcr阳性克隆进行扩增，随后使用dna印迹测定进一步分析。dna印迹包括三种探针和来自已经用所选的多种限制酶消化的克隆的基因组dna，使得探针和消化物的组合允许鉴定es细胞dna是否已经通过同源重组被适当修饰。
[0308]
es细胞的6个pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常见的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。显示畸变迹象的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于dna印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
[0309]
在其免疫球蛋白λ链基因座的两个同源拷贝之一中携带缺失的es细胞克隆用cre重组酶表达载体与包含部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座的dna片段(1007)一起再转染(1004)，所述部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座包含v
λ
、j
λ
和c
λ
区基因区段。该dna片段(1007)的关键特征如下：lox5171位点(1031)；新霉素抗性基因开放阅读框(1047)，该开放阅读框缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框并与lox5171位点中的不间断开放阅读框同框邻接；frt位点(1027)；25个功能性牛科动物λ区基因区段的阵列(1051)，每个区段具有嵌入小鼠λ非编码序列中的牛科动物λ编码序列；j-c单元的阵列(1055)，其中每个单元具有嵌入
来自小鼠λ基因座的非编码序列中的牛科动物j
λ
基因区段和小鼠λ恒定结构域基因区段(牛科动物j
λ
基因区段是编码j
λ1
、j
λ2
、j
λ3
、j
λ4
、j
λ5
、j
λ6
和j
λ7
的那些基因区段，而小鼠λ恒定结构域基因区段是c
λ1
或c
λ2
或c
λ3
)；用于flp重组酶的突变识别位点，称为“f3”位点(1043)；赋予潮霉素抗性的开放阅读框(1057)，其位于相对于构建体中免疫球蛋白基因区段编码信息的反义链上；与lox5171位点在相反的相对方向的loxp位点(1039)。
[0310]
牛科动物v
λ
和j
λ
基因编码区的序列在表3中。
[0311]
将转染的克隆置于g418或潮霉素选择下，这富集了已经经历rmce过程的细胞克隆，其中部分牛科动物供体dna以其整体被整合到由基因靶向载体置于其处的lox5171与loxp位点之间缺失的免疫球蛋白λ链基因座中。来自靶向载体(1003)中的剩余元件经由flp介导的重组(1006)在体外或体内去除，产生如1011处所示的最终牛科动物化的基因座。
[0312]
g418/潮霉素抗性es细胞克隆通过pcr和dna印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的重组酶介导的盒交换过程而没有不想要的重排或缺失。选择具有预期基因组结构的克隆用于进一步使用。
[0313]
根据标准程序，将小鼠λ链基因座中携带部分牛科动物免疫球蛋白dna(1011)的es细胞克隆显微注射到来自品系dba/2的小鼠胚泡中，以产生部分es细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的es细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。这里选择的雌性小鼠是c57b1/6ntac品系，该c57b1/6ntac品系携带编码在其种系中表达的flp重组酶的转基因。分析来自这些交配的后代的部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座的存在，以及在rmce步骤中产生的侧翼为frt的新霉素抗性基因和侧翼为f3的潮霉素抗性基因的损失。携带部分牛科动物基因座的小鼠用于建立小鼠集落。
[0314]
在一些方面，包含基于牛科动物的重链和κ基因座的小鼠(如实施例3和4中描述的)被育种为携带基于牛科动物的λ基因座的小鼠。从这种类型的育种方案产生的小鼠的基于牛科动物的重链基因座是纯合的，并且k-k基于牛科动物的基因座或基于l-k牛科动物的基因座可以是纯合的。可选地，它们可以在κ基因座处是杂合的，在一条染色体上携带k-k基因座，并且在另一条染色体上携带l-k基因座。这些小鼠品系中的每一个的基于牛科动物的λ基因座都是纯合的。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有在一些情况下与牛科动物κ可变结构域配对并且在其他情况下与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物重链可变结构域。λ可变结构域来源于基于牛科动物的l-k基因座或基于牛科动物的λ基因座。
[0315]
实施例6：将工程化部分牛科动物免疫球蛋白微基因座引入到小鼠基因组中
[0316]
在某些其他方面，部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含牛科动物可变结构域微基因座，诸如图11中图示的。这里，不是部分牛科动物免疫球蛋白基因座包含全部或大体上全部牛科动物vh基因区段编码序列，而是小鼠免疫球蛋白基因座被包含更少嵌合牛科动物vh基因区段(例如，1-20个牛科动物vh基因片段被确定为是功能性的；也就是说，不是假基因)的微基因座(1119)取代。
[0317]
将包含待整合到哺乳动物宿主基因组中的部分牛科动物免疫球蛋白基因座的位点特异性靶向载体(1131)引入(1102)到基因组区域(1101)中，其中缺失的内源免疫球蛋白基因座包含puro-tk基因(1105)和以下在侧翼的序列特异性重组位点：突变体frt位点(1109)、突变体loxp位点(1111)、野生型frt位点(1107)和野生型loxp位点(1105)。位点特异性靶向载体包含i)任选的pair元件的阵列(1141)；ii)包含例如1-20个功能性牛科动物
vh编码区和基于小鼠基因组内源序列的间插序列的vh基因座(1119)；iii)包含小鼠序列的21.6kb前d区(1121)；iv)包含10个d和jh牛科动物编码序列和基于小鼠基因组内源序列的间插序列的d基因座(1123)和jh基因座(1125)。部分牛科动物免疫球蛋白基因座的侧翼是允许与修饰的内源基因座重组的重组位点：突变体frt(1109)、突变体loxp(1111)、野生型frt(1107)和野生型loxp(1105)。在引入适当的重组酶，例如cre(1104)后，部分牛科动物免疫球蛋白基因座被整合到恒定基因区(1127)上游的基因组中，如1129处所示。
[0318]
如实施例1中描述的，引入部分牛科动物免疫球蛋白可变区基因座的初级筛选通过次级dna印迹测定支持的初级pcr筛选进行。作为重组事件的一部分，puro-tk基因(1105)的缺失允许使用更昔洛韦阴性选择来鉴定没有经历重组事件的细胞。
[0319]
实施例7：引入具有嵌入κ免疫球蛋白非编码序列中的牛科动物λ可变区编码序列与小鼠λ恒定区序列的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座
[0320]
牛抗体大多包含λ轻链，而小鼠抗体大多包含κ轻链。为了增加包含λlc的抗体的产生，将内源小鼠v
κ
和j
κ
用部分牛科动物基因座取代，该部分牛科动物基因座包含嵌入小鼠v
κ
区侧翼和调控序列的v
λ
和j
λ
基因区段编码序列，即实施例4的l-k小鼠。在这样的小鼠中，促进高水平κ基因座重排和表达的内源调控序列被预测为对异位λ基因座具有等同效果。然而，体外研究展示出，牛科动物v
λ
结构域对小鼠的c
κ
没有良好地发挥功能(参见实施例9)。因此，l-k小鼠中包含λlc的抗体的预期增加可能不会发生。作为一种替代策略，将内源小鼠v
κ
和j
κ
用部分牛科动物基因座取代，该部分牛科动物基因座包含嵌入小鼠v
κ
区侧翼和调控序列中的v
λ
和j
λ
基因区段编码序列，并且将小鼠c
κ
用小鼠c
λ
取代。
[0321]
图13是图示引入工程化部分牛科动物轻链可变区基因座的示意图，其中一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列被插入到一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列上游的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中，所述一个或更多个牛科动物j
λ
基因区段编码序列位于一个或更多个啮齿动物c
λ
区编码序列的上游。
[0322]
图13图示了用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代小鼠基因组的一部分的方法。该方法包括将第一位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，随后将第二位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，该第一位点特异性重组酶识别序列可以被引入小鼠基因组的内源v
κ
(1315)和j
κ
(1319)区基因区段和c
κ
(1321)外显子的簇的5’或3’，与第一序列特异性重组位点组合的该第二位点特异性重组酶识别序列位于包含v
κ
和j
κ
基因区段和c
κ
外显子的簇的整个基因座的侧翼。有侧翼的区域缺失，并且然后使用相关的位点特异性重组酶用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代，如本文描述的。
[0323]
用于在v
κ
(1315)基因区段和c
κ
外显子(1321)的任一侧引入位点特异性重组序列的靶向载体也包含另外的位点特异性重组序列，该另外的位点特异性重组序列已经被修饰使得它仍然被重组酶有效识别，但是不与未修饰的位点重组。该位点位于靶向载体中，使得在v
κ
和j
κ
基因区段簇和c
κ
外显子缺失之后，它可以用于其中非天然的dna片段经由rmce移入到修饰的v
κ
基因座中的第二位点特异性重组事件。在本实施例中，非天然的dna是包含嵌入在小鼠igk调控和侧翼序列中的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个小鼠c
λ
外显子的合成核酸。
[0324]
构建两个基因靶向载体来完成刚刚概述的方法。载体之一(1303)包含取自最远端v
κ
基因区段上游的基因座的5’末端的小鼠基因组dna。另一个载体(1305)包含取自跨越c
κ
外
显子(1321)上游(5’)和下游(3’)的区域中的基因座内的小鼠基因组dna 。
[0325]5’
载体(1303)的关键特征如下：在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(1323)；在κ链基因座中最远端可变区基因的上游定位的6kb小鼠基因组dna(1325)；用于flp重组酶的frt识别序列(1327)；包含小鼠polr2a基因启动子的基因组dna片段(1329)；翻译起始序列(1335，嵌入“kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；用于cre重组酶的突变loxp识别序列(lox5171)(1331)；转录终止/多腺苷酸化序列(1333)；用于cre重组酶的loxp识别序列(1337)；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下编码融合蛋白的基因(1339)，所述融合蛋白具有与胸苷激酶的截短形式融合的赋予嘌呤霉素抗性的蛋白(pu-tk)；在载体中5’末端并以天然的相对方向排列的6kb序列附近定位的2.5kb小鼠基因组dna(1341)。
[0326]3’
载体(1305)的主要特征如下：在跨越c
κ
外显子上游(5’)和下游(3’)的区域中的基因座内定位的6kb小鼠基因组dna(1343)；在小鼠polr2a基因启动子的转录控制下编码人类次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)的基因(1345)；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子控制下的新霉素抗性基因(1347)；用于cre重组酶的loxp识别序列(1337)；在紧邻载体5’末端处包含的6kb dna片段的基因组下游定位的3.6kb小鼠基因组dna(1349)，其中两个片段以与小鼠基因组相同的转录方向来取向；在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(1323)。
[0327]
使内源小鼠igk基因座缺失的一种策略是将3’载体(1305)插入小鼠c
κ
外显子(1321)下游的侧翼区。然而，需要保留在修饰基因座中的3'κ增强子位于c
κ
外显子下游9.1kb，这太短不能容纳3’载体的上游和下游同源臂(总计9.6kb)。因此，同源性上游区域被扩展。
[0328]
根据广泛使用的程序，将来源于c57b1/6ntac小鼠的小鼠胚胎干(es)细胞通过电穿孔用3’载体(1305)转染。在电穿孔之前，将载体dna用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，将其置于使用新霉素类似物药物g418对已经将3’载体整合到其dna中的细胞进行的阳性选择下。也存在阴性选择用于已经将载体整合到其dna中但不是通过同源重组进行整合的细胞。非同源重组保留dta基因，在基因表达时dta基因杀死细胞，但dta基因因为位于与小鼠igk基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。约一周之后，在药物抗性es细胞的集落为裸眼可见之后，将药物抗性es细胞的集落从其板上物理提取。这些集落被分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，每个细胞克隆被分配，一些细胞被冷冻作为存档材料，并且其余的用于dna的分离用于分析目的。
[0329]
来自es细胞克隆的dna通过pcr使用广泛使用的基因靶向测定设计进行筛选。对于该测定，一种pcr寡核苷酸引物序列定位在3’载体(1305)与基因组dna(1301)之间共有同一性的区域之外，而另一种pcr寡核苷酸引物序列定位在载体中有基因组同一性的两条臂之间的新dna中，即hprt(1345)或新霉素抗性(1347)基因中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于来源于转染细胞的es细胞克隆中的dna片段，所述转染细胞已经经历3’载体(1305)与内源小鼠igk基因座之间完全正常的同源重组。两次单独的转染用3’载体(1305)进行。选
择来自两次转染的pcr阳性克隆进行扩增，随后使用dna印迹测定进一步分析。
[0330]
dna印迹测定根据广泛使用的程序使用三种探针和用所选的多种限制酶消化的基因组dna进行，使得探针和消化物的组合允许得出关于以下的结论：克隆中靶向的基因座的结构以及其是否通过同源重组被适当修饰。第一探针定位至位于3’κ靶向载体(1305)与基因组dna之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的dna序列；第二探针还定位在同一性区域之外，但在3’侧；第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新dna中，即在hprt(1345)或新霉素抗性(1347)基因中。dna印迹鉴定预期限制酶产生的dna片段的存在，所述dna片段对应于由一种外部探针和由新霉素抗性或hprt基因探针检测到的经正确突变(即通过使用3’κ靶向载体(1305)的同源重组)的κ基因座的一部分。外部探针检测突变体片段和也检测来自同源染色体上免疫球蛋白κ基因座的非突变体拷贝的野生型片段。
[0331]
es细胞的pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于dna印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
[0332]
然后可接受的克隆用5’载体(1303)使用以下程序和筛选测定进行修饰：所述程序和筛选测定在设计上类似于与3’载体(1305)一起使用的那些程序和筛选测定，不同之处在于使用嘌呤霉素选择替代g418/新霉素选择，并且定制方案以匹配由5’载体(1303)修饰的基因组区域。5’载体(1303)转染实验的目标是分离出已经被3’载体(1305)和5’载体(1303)二者以预期方式突变的es细胞克隆，即携带两种工程化突变的双重靶向细胞。在这些克隆中，cre重组酶引起由两个载体引入到κ基因座中的loxp位点之间发生重组(1302)，产生1307处所示的基因组dna构型。
[0333]
此外，与同源染色体相反，克隆必须在同一条染色体上经历基因靶向；即通过靶向载体产生的工程化突变必须在同一条dna链上呈顺式，而不是在分开的同源dna链上呈反式。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的克隆通过分析程序诸如使用探针的中期涂片的荧光原位杂交区分开，所述探针与存在于两个基因靶向载体(1303和1305)的其有基因组同一性的臂之间的新dna杂交。两种类型的克隆也可以通过以下来彼此区分开：用表达cre重组酶的载体(如果靶向载体已经以顺式整合，则该载体使pu-tk(1339)、hprt(1345)和新霉素抗性(1347)基因缺失)转染它们，并且将针对通过5’载体(1303)引入的胸苷激酶基因进行更昔洛韦选择而存活的集落数进行比较，并且通过“亲缘种选择”筛选程序(其中测试了来自克隆的一些细胞对嘌呤霉素或g418/新霉素的抗性)分析存活克隆的药物抗性表型。具有顺式突变排列的细胞预期比具有反式排列的细胞产生大约多103个更昔洛韦抗性克隆。大多数所得的顺式来源的更昔洛韦抗性克隆应该也对嘌呤霉素和g418/新霉素二者都敏感，相比之下，反式来源的更昔洛韦抗性克隆应该对这两种药物都保留抗性。选择κ链基因座中具有工程化突变的顺式排列的细胞克隆用于进一步使用。
[0334]
将细胞的双重靶向克隆用表达cre重组酶的载体瞬时转染(1302)，并且随后将转染的细胞置于更昔洛韦选择下，如在以上总结的分析实验中的那样。分离出更昔洛韦抗性的细胞克隆，并且通过pcr和dna印迹分析由5’载体(1303)和3’载体(1305)产生的两个工程化突变之间的预期缺失(1307)的存在。在这些克隆中，cre重组酶引起由两个载体引入到κ链基因座中的loxp位点(1337)之间发生重组。因为loxp位点在两个载体中以相同的相对方
向排列，重组导致包含两个loxp位点之间整个基因组区间的dna圈被切下。该圈不包含复制起点，并且因此在有丝分裂期间不被复制，并且因此在细胞经历克隆增殖时从细胞克隆中损失。所得的克隆携带最初位于两个loxp位点之间的dna缺失，并且具有1307处示出的基因组结构。选择具有预期缺失的克隆用于进一步使用。
[0335]
在其免疫球蛋白κ链基因座的两个同源拷贝之一中携带序列缺失的es细胞克隆用cre重组酶表达载体与包含部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座的dna片段(1309)一起再转染(1304)，所述部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座包含v
λ
(1351)和j
λ
(1355)基因区段编码序列和一个或更多个小鼠c
λ
外显子(1357)。该dna片段的关键特征如下：lox5171位点(1331)；新霉素抗性基因开放阅读框(1347，缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框并与lox5171位点(1331)中的不间断开放阅读框邻接)；frt位点(1327)；1-24个功能性牛科动物v
λ
可变区基因区段的阵列(1351)，每个区段具有嵌入小鼠非编码调控或支架序列中的牛科动物编码序列；任选地，来自紧邻小鼠κ链基因座中的j
κ
区基因区段簇上游的13.5kb基因组dna片段(未示出)；包含嵌入小鼠非编码dna(1355)和一个或更多个小鼠c
λ
外显子(1357)中的1-5个功能性牛科动物j
λ
区基因区段的2kb dna片段；与lox5171位点(1331)在相反的相对方向的loxp位点(1337)。该dna片段还包含缺失的ie
κ
(未示出)。
[0336]
牛科动物v
λ
和j
λ
基因编码区的序列在表3中。
[0337]
将转染的细胞置于g418选择下，这富集了已经经历rmce的细胞克隆，其中部分牛科动物供体dna(1309)以其整体被整合到分别由5’(1303)和3’(1305)载体置于其处的lox5171(1331)与loxp(1337)位点之间缺失的免疫球蛋白κ链基因座中。仅已经适当地经历rmce的细胞才具有表达新霉素抗性基因(1347)的能力，因为其表达所要求的启动子(1329)和起始甲硫氨酸密码子(1335)不存在于载体(1309)中，并且已经预先存在于宿主细胞igk基因座(1307)中。由rmce产生的dna区域在1311处示出。来自5’载体(1303)中的剩余元件经由flp介导的重组(1306)在体外或体内去除，产生如1313处所示的最终基于牛科动物的轻链基因座。
[0338]
g418抗性es细胞克隆通过pcr和dna印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的rmce过程而没有不想要的重排或缺失。选择具有预期基因组结构的克隆用于进一步使用。
[0339]
根据标准程序，将小鼠κ链基因座(1313)中携带部分牛科动物免疫球蛋白dna的克隆显微注射到来自品系dba/2的小鼠胚泡中，以产生部分es细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的es细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。选择用于在交配中使用的雌性小鼠是c57b1/6ntac品系，并且还携带编码在其种系中表达的flp重组酶的转基因。分析来自这些交配的后代的部分牛科动物免疫球蛋白λ轻链基因座的存在，以及在rmce步骤中产生的侧翼为frt的新霉素抗性基因的损失。携带部分牛科动物基因座的小鼠用于建立小鼠的集落。
[0340]
如实施例3中描述地产生的携带部分牛科动物重链基因座的小鼠可以与携带基于牛科动物λ的κ链基因座的小鼠一起育种。继而将它们的后代在一个方案中一起育种，最终产生的小鼠两个基于牛科动物的基因座(即，基于牛科动物的重链和基于λ的λ)均是纯合的。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座产生具有牛科动物λ可变结构域和小鼠λ恒定结构域的部分牛科动物λ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物重
链可变结构域。
[0341]
育种方案的一种变化形式包括产生这样的小鼠，所述小鼠的基于牛科动物的重链基因座是纯合的，但在κ基因座处是杂合的，使得在一条染色体上它们具有实施例4中描述的k-k基于牛科动物的基因座，并且在另一条染色体上它们具有在本实施例中描述的基于部分牛科动物λ的κ基因座。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座之一产生具有牛科动物κ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分牛科动物κ蛋白。从另一个κ基因座，产生包含牛科动物λ可变结构域和小鼠λ恒定结构域的部分牛科动物λ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体包括在一些情况下与牛科动物κ可变结构域配对并且在其他情况下与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物可变结构域。
[0342]
实施例8.引入具有嵌入小鼠κ免疫球蛋白非编码序列中的牛科动物λ可变区编码序列与小鼠λ恒定区序列的工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座
[0343]
本实施例描述了实施例7的一种替代策略，其中将内源小鼠v
κ
和j
κ
用部分牛科动物基因座取代，该部分牛科动物基因座包含嵌入小鼠v
κ
区侧翼和调控序列中的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列，并且将小鼠c
κ
用小鼠c
λ
取代。然而，在本实施例中，包含部分牛科动物基因座的靶向载体的结构是不同的。牛科动物v基因座编码序列包含处于距离1个至24个功能性v
λ
基因区段编码序列的任何地方的阵列，随后是j
λ-c
λ
串联盒阵列，其中j
λ
是牛科动物来源的，并且c
λ
是小鼠来源的，例如c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
。盒的数量范围为一个至五个独特功能性牛科动物j
λ
基因区段的数量。本实施例中部分牛科动物λ基因座的整体结构类似于内源小鼠λ基因座，而实施例7中基因座的结构类似于内源小鼠κ基因座，该内源小鼠κ基因座在本实施例中被部分牛科动物λ基因座取代。
[0344]
图14是图示了引入工程化部分牛科动物轻链可变区基因座的示意图，其中一个或更多个牛科动物v
λ
基因区段编码序列被插入到j
λ-c
λ
串联盒阵列上游的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中，其中j
λ
来自牛科动物来源的，并且c
λ
来自小鼠来源的，例如，c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
。
[0345]
图14图示了用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代小鼠基因组的一部分的方法。该方法提供了将第一位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，随后将第二位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，该第一位点特异性重组酶识别序列可以被引入小鼠基因组的内源v
κ
(1415)和j
κ
(1419)区基因区段和c
κ
(1421)外显子的簇的5’或3’，与第一序列特异性重组位点组合的该第二位点特异性重组酶识别序列位于包含v
κ
和j
κ
基因区段和c
κ
外显子的簇的整个基因座的侧翼。有侧翼的区域缺失，并且然后使用相关的位点特异性重组酶用部分牛科动物免疫球蛋白基因座取代，如本文描述的。
[0346]
用于在v
κ
(1415)基因区段和c
κ
外显子(1421)的任一侧引入位点特异性重组序列的靶向载体也包含另外的位点特异性重组序列，该另外的位点特异性重组序列已经被修饰使得它仍然被重组酶有效识别，但是不与未修饰的位点重组。该位点位于靶向载体中，使得在v
κ
和j
κ
基因区段簇和c
κ
外显子缺失之后，它可以用于其中非天然的dna片段经由rmce移入到修饰的v
κ
基因座中的第二位点特异性重组事件。在本实施例中，非天然的dna是包含牛科动物v
λ
基因区段编码序列阵列和j
λ-c
λ
串联盒阵列的合成核酸，其中j
λ
是牛科动物来源的，并且c
λ
是小鼠来源的，例如嵌入小鼠igk调控和侧翼序列中的c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
。
[0347]
构建两个基因靶向载体来完成刚刚概述的方法。载体之一(1403)包含取自最远端vκ
基因区段上游的基因座的5’末端的小鼠基因组dna。另一个载体(1405)包含取自跨越c
κ
外显子(1321)上游(5’)和下游(3’)的区域中的基因座内的小鼠基因组dna。
[0348]
实施例7中描述了5’载体(1403)和3’载体(1405)的关键特征。
[0349]
根据如实施例7中描述的广泛使用的程序，将来源于c57b1/6ntac小鼠的小鼠胚胎干(es)细胞通过电穿孔用3’载体(1405)转染。来自es细胞克隆的dna通过pcr使用如实施例7中描述的广泛使用的基因靶向测定进行筛选。dna印迹测定根据如实施例7中描述的广泛使用的程序进行。
[0350]
es细胞的pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于dna印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
[0351]
可接受的克隆使用如实施例7中描述的程序和筛选测定用5’载体(1403)进行修饰。所得的正确靶向的es克隆具有内源κ基因座的基因组dna构型，其中5’载体(1403)被插入内源v
κ
基因区段的上游，并且3’载体(1405)被插入内源c
κ
的下游。在这些克隆中，cre重组酶引起由两个载体引入到κ基因座中的loxp位点之间发生重组(1402)，产生1407处所示的基因组dna构型。
[0352]
与同源染色体相反，可接受的克隆在同一条染色体上经历基因靶向；使得通过靶向载体产生的工程化突变在同一条dna链上呈顺式，而不是在分开的同源dna链上呈反式。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的那些克隆通过如实施例7中描述的分析程序区分开。
[0353]
将双重靶向细胞克隆用表达cre重组酶的载体瞬时转染(1402)，并且随后将转染的细胞置于更昔洛韦选择下，并且使用如实施例7中描述的程序进行分析。在选择的克隆中，cre重组酶已经引起在由两个载体引入到κ链基因座中的loxp位点(1437)之间发生重组。因为loxp位点在两个载体中以相同的相对方向排列，重组导致包含两个loxp位点之间整个基因组区间的dna圈被切下。该圈不包含复制起点，并且因此在有丝分裂期间不被复制，并且因此在细胞经历克隆增殖时从细胞克隆中损失。所得的克隆携带最初位于两个loxp位点之间的dna缺失，并且具有1407处示出的基因组结构。选择具有预期缺失的克隆用于进一步使用。
[0354]
在其免疫球蛋白κ链基因座的两个同源拷贝之一中携带序列缺失的es细胞克隆用cre重组酶表达载体与包含部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座的dna片段(1409)一起再转染(1404)，所述部分牛科动物免疫球蛋白λ链基因座包含嵌入在小鼠igk侧翼和调控dna序列(1457)中的v
λ
(1451)区段编码序列和牛科动物j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个小鼠c
λ
外显子的串联盒阵列。该dna片段的关键特征如下：lox5171位点(1431)；新霉素抗性基因开放阅读框(1447，缺乏起始甲硫氨酸密码子，但符合框并与lox5171位点(1431)中的不间断开放阅读框邻接)；frt位点(1427)；1-24个功能性牛科动物v
λ
可变区基因区段的阵列(1451)，每个区段包含嵌入小鼠非编码调控或支架序列中的牛科动物编码序列；任选地，来自紧邻小鼠κ链基因座中的j
κ
区基因区段簇上游的13.5kb基因组dna片段(未示出)；包含含有嵌入小鼠igk侧翼和调控dna序列中的牛科动物j
λ
基因区段编码序列和一个或更多个小鼠c
λ
外显子的串联盒阵列的dna(1457)；与lox5171位点(1431)在相反的相对方向的loxp位
点(1437)。
[0355]
牛科动物v
λ
和j
λ
基因编码区的序列在表3中。
[0356]
将转染的细胞置于g418选择下，这富集了已经经历rmce的细胞克隆，其中部分牛科动物供体dna(1409)以其整体被整合到分别由5’(1403)和3’(1405)载体置于其处的lox5171(1431)与loxp(1437)位点之间缺失的免疫球蛋白κ链基因座中。仅适当地经历rmce的细胞才具有表达新霉素抗性基因(1447)的能力，因为其表达所要求的启动子(1429)和起始甲硫氨酸密码子(1435)不存在于载体(1409)中，并且已经预先存在于宿主细胞igk基因座(1407)中。由rmce产生的dna区域在1411处示出。来自5’载体(1403)中的剩余元件经由flp介导的重组(1406)在体外或体内去除，产生如1413处所示的最终基于牛科动物的轻链基因座。
[0357]
g418抗性es细胞克隆通过pcr和dna印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的rmce过程而没有不想要的重排或缺失。选择具有预期基因组结构的克隆用于进一步使用。
[0358]
根据标准程序，将小鼠κ链基因座(1413)中携带部分牛科动物免疫球蛋白dna的克隆显微注射到来自品系dba/2的小鼠胚泡中，以产生部分es细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的es细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。选择用于在交配中使用的雌性小鼠是c57b1/6ntac品系，并且还携带编码在其种系中表达的flp重组酶的转基因。分析来自这些交配的后代的部分牛科动物免疫球蛋白λ轻链基因座的存在，以及在rmce步骤中产生的侧翼为frt的新霉素抗性基因的损失。携带部分牛科动物基因座的小鼠用于建立小鼠集落。
[0359]
如实施例3中描述产生的携带部分牛科动物重链基因座的小鼠可以与携带基于牛科动物λ的κ链基因座的小鼠一起育种。继而将它们的后代在一个方案中一起育种，最终产生的小鼠的两个基于牛科动物的基因座(即，基于牛科动物的重链和基于λ的κ)均是纯合的。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座产生具有牛科动物λ可变结构域和小鼠λ恒定结构域的部分牛科动物λ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物重链可变结构域。
[0360]
育种方案的一种变化形式包括产生这样的小鼠，所述小鼠的基于牛科动物的重链基因座是纯合的，但在κ基因座处是杂合的，使得在一条染色体上它们具有实施例4中描述的k-k基于牛科动物的基因座，并且在另一条染色体上它们具有本实施例中描述的基于部分牛科动物λ的κ基因座。这样的小鼠产生具有牛科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分牛科动物重链。这样的小鼠还从其κ基因座之一产生具有牛科动物κ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分牛科动物κ蛋白。从另一个κ基因座，这样的小鼠产生具有牛科动物λ可变结构域和小鼠λ恒定结构域的部分牛科动物λ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体具有在一些情况下与牛科动物κ可变结构域配对并且在其他情况下与牛科动物λ可变结构域配对的牛科动物可变结构域。
[0361]
以上描述的用于引入工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座的方法包括小鼠c
κ
外显子的缺失，该工程化部分牛科动物免疫球蛋白基因座具有嵌入小鼠κ免疫球蛋白非编码序列中的牛科动物λ可变区编码序列和小鼠λ恒定区序列。替代方法包括通过突变其剪接受体位点来使c
κ
外显子失活。内含子必须通过称为rna剪接的过程从初级mrna转录物中去
除，在该过程中，位于核中的大分子机器剪接体识别内含子5’(剪接供体)和3’(剪接受体)末端处的序列以及内含子的其他特征，包括位于紧邻剪接受体上游的多聚嘧啶区。dna中的剪接供体序列是ngt，其中“n”是任何脱氧核苷酸，并且剪接受体是agn(cech tr,seitz ja和atkins jf编著(2019)(rna worlds:new tools for deep exploration,cshl press)isbn978-1-621822-24-0)。
[0362]
小鼠c
κ
外显子通过使其剪接受体序列和多聚嘧啶区突变而失活。c
κ
外显子上游的野生型序列是cttccttcctcag(seq id no:294)(剪接受体位点加下划线)。它突变为aaattaattaacc(seq id no:295)，产生非功能性剪接受体位点并且因此产生非功能性c
κ
外显子。突变体序列还引入paci限制酶位点(加下划线的)。作为八个碱基对的识别序列，该限制性位点预期很少存在于小鼠基因组中(～每65,000bp)，使得通过对已经用paci和另一种更常见切割的限制酶消化的es细胞dna进行dna印迹分析来检测突变体序列是否已经插入到igk位点变得简单。野生型序列通过本领域广泛已知的关于将3’rmce载体插入的技术同源重组被突变体序列取代。用于使c
κ
外显子剪接受体序列和多聚嘧啶区突变的同源重组载体(msa，1457)的关键特征如下：6kb小鼠基因组dna(1443)，其在跨越c
κ
外显子(1421)上游(5’)和下游(3’)的区域中的κ基因座内定位，并且在其天然位置紧邻c
κ
外显子上游的包含突变体aaattaattaacc(seq id no:295)(1459)序列而不是野生型cttccttcctcag(seq id no:294)序列；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子(1447)控制下并且侧翼为突变体frt位点(1461)的新霉素抗性基因；3.6kb小鼠基因组dna(1449)，其紧邻在载体5’末端包含的6kb dna片段的基因组下游定位，其中两个片段以与小鼠基因组相同的转录方向来取向；在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶基因启动子的转录控制下编码白喉毒素a(dta)亚基的基因(1423)。这里使用突变体frt位点(1461)，例如，frt f3或frt f5(schlake和bode(1994)use of mutated flp recognition target(frt)sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci.biochemistry 33:12746-12751pmid:7947678doi:10.1021/bi00209a003)，因为在剪接突变被引入并且neo基因通过flp重组酶表达载体的瞬时转染(1406)而缺失后，es细胞就经历进一步的遗传操纵。该过程需要野生型frt位点来使另一个neo选择基因(1403处的1447)缺失。如果在引入剪接突变之后保留在igk基因座(1469)中的frt位点(1461)是野生型，尝试的frt介导的第二neo基因(1413处的1406)的缺失可能无意中导致整个新引入的部分牛科动物基因座缺失和小鼠c
κ
外显子失活。
[0363]
根据广泛使用的程序，将来源于c57b1/6ntac小鼠的小鼠胚胎干(es)细胞通过电穿孔用msa载体(1457)转染。在电穿孔之前，将载体dna用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，将其置于通过使用新霉素类似物药物g418对已经将msa载体整合到其dna中的细胞进行的阳性选择下。也存在阴性选择用于已经将载体整合到其dna中但不是通过同源重组进行整合的细胞。非同源重组导致dta基因的保留，在基因表达时dta基因杀死细胞，而dta基因因为位于与小鼠igk基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。约一周之后，在药物抗性es细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性es细胞的集落从其板上物理提取。这些挑选的集落被分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，每个细胞克隆被分配，使得一些细胞被冷冻作为存档材料，并且其余的用于dna的分离而用于分析目的。
[0364]
通过同源重组正确靶向的es细胞中的igk基因座具有1463处描绘的构型。
[0365]
来自es细胞克隆的dna通过pcr使用广泛使用的基因靶向测定设计进行筛选。对于该测定，一种pcr寡核苷酸引物序列定位在msa载体(1457)与基因组dna(1401)之间共有同一性的区域之外，而另一种pcr寡核苷酸引物序列定位在载体中有基因组同一性的两条臂之间的新dna，即或新霉素抗性(1447)基因中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于来源于转染细胞的es细胞克隆中的dna片段，所述转染细胞已经经历msa载体(1457)与内源小鼠igk基因座之间完全正常的同源重组。两次单独的转染用msa载体(1457)进行。选择来自两次转染的pcr阳性克隆进行扩增，随后使用dna印迹测定进一步分析。
[0366]
dna印迹测定根据广泛使用的程序使用三种探针和用所选的多种限制酶消化的基因组dna进行，使得探针和消化物的组合允许得出关于以下的结论：克隆中靶向的基因座的结构以及其是否通过同源重组被适当修饰。在该特定实施例中，dna被pac1和另一种限制酶诸如ecori或hindiii双重消化，因为仅具有被整合的msa载体的细胞才包含paci位点。第一探针定位至位于msa载体(1457)与基因组dna之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的dna序列；第二探针还定位在同一性区域之外，但在3’侧；第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新dna中，即在新霉素抗性(1447)基因中。dna印迹鉴定预期限制酶产生的dna片段的存在，该dna片段对应于由一种外部探针和由新霉素抗性基因探针检测到的经正确突变(即通过使用msaκ靶向载体(1457)的同源重组)的κ基因座的一部分。外部探针检测突变体片段和也检测来自同源染色体上免疫球蛋白κ基因座的非突变体拷贝的野生型片段。dna印迹测定根据实施例7中描述的广泛使用的程序进行。
[0367]
es细胞的pcr阳性克隆和dna印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠es细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于dna印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
[0368]
尽管es细胞dna在突变的igk等位基因中被paci消化的能力确认了ttaattaa序列的存在，但是进行了聚焦于c
κ
外显子上游区域的dna测序以确认完全预期剪接突变的存在。该区域通过基因组pcr使用位于突变侧翼的引物[1465和1467(表5：seq id no:275和seq id no:276)]进行扩增。替代引物对示于seq id no:277和seq id no:278。这些引物使用ncbi primer-blast设计，并且通过计算机验证在小鼠基因组中缺乏任何预测的脱靶结合位点。
[0369]
经序列验证的es细胞克隆用flp重组酶表达载体瞬时转染(1406)，以使新霉素抗性基因(1427)缺失。然后将细胞亚克隆，并且缺失通过pcr来确认。es细胞中的igk基因座具有1469处描绘的基因组构型。
[0370]
如以上描述的，将es细胞用5’和3’rmce载体进行电穿孔。唯一的区别是3’载体(1405)被插入在突变体c
κ
外显子的上游在图9中示出的位置901处，并且3’载体(1405)的上游和下游同源性臂分别被图9中示出的3’载体(905)的序列943和949取代。结果，用于测试3’载体(1405)正确整合的pcr引物和dna印迹探针来源于序列943和949，而不是1443和1449。ie
κ
增强子不包含在靶向载体(1409)中，因为该序列没有缺失。
[0371]
实施例9：牛科动物v
λ
结构域与小鼠c
κ
结构域不能发挥良好功能，并且牛科动物v
κ
结构域与小鼠c
λ
结构域不能发挥良好功能。
[0372]
对于所提出的l-k小鼠(实施例4)，侧翼是小鼠非编码和调控序列的牛科动物v
λ
和j
λ
基因区段编码序列被嵌入内源v
κ
和j
κ
基因区段已从其缺失的小鼠igk基因座中。在有效v
λ
→jλ
基因重排之后，所得的ig基因编码具有牛科动物λ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的lc。为了测试这样的杂交体lc是否被正确表达并形成完整的ig分子，用vs(v
κ
和v
λ
二者)和c轻链外显子(c
κ
和c
λ
二者)的不同组合与ig hc一起进行一系列瞬时转染测定，并且测试了编码的ig的细胞表面和细胞内表达和分泌。
[0373]
对于这些实验，测试了编码两个牛科动物igh可变区结构域的牛科动物序列，这两个结构域都是从异源杂交瘤克隆的并且都是经体细胞超突变的。一个包含超长的hcdr3(克隆blv1h12，登录号#af015506.1)，并且另一个包含与小鼠igmb同种异型hc连接的正常长度的hcdr3(克隆b4，登录号#u11628.1)。每个编码vh的dna都包含内源牛科动物l1-内含子-l2。每个都被单独克隆到pcmv载体中。将牛科动物v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)v
l
外显子连接至小鼠的恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
，并且克隆到pfuse载体中。每个v
l
中的l1-内含子-l2序列都是牛来源的。这些序列包含被恢复为种系序列的经体细胞超突变的残基。
[0374]
为了检查细胞表面igm的表达，将293t/17细胞与作为转染对照的人类cd4(hcd4)表达载体加上hc和lc构建体之一以及cd79a/b表达载体共转染。细胞表面表达igm要求cd79a/b异二聚体。大约24小时后，转染的细胞通过流式细胞术经历细胞表面或细胞内染色。为了分析ig的分泌，将与以上相同的vh基因克隆到包含小鼠igg2a fc的pfuse载体中。将293t/17细胞与作为转染对照的人类cd4(hcd4)表达载体加上以上描述的hc和lc构建体之一共转染。大约48小时后，收获转染的细胞及其对应的上清液，并且通过蛋白印迹分析hc/lc表达/分泌。
[0375]
为了总结从这些实验获得的数据，在包含超长或正常长度hcdr3并连接至小鼠igm骨架的牛科动物vh结构域与具有v
κ
或v
λ
与错配的c
l
区(即v
λ
与c
κ
，或v
κ
与c
λ
)的lc共表达时，如通过流式细胞术评价的细胞表面上的igm表达比在相同牛科动物vh与具有匹配v
l
/c
l
的lc共表达时(即，在v
λ
与c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
连接时，或者在v
κ
与c
κ
连接时)少至少两倍。这些结果通过是bcr的专性组分的细胞表面cd79b的染色得到确认。表达缺陷的程度取决于所使用的特定vh基因；一些vh基因允许杂交体轻链的一定细胞表面表达，但其他的更严格。对于ig分泌也观察到同样的趋势。
[0376]
图15示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的流式细胞术分析结果，该vh结构域具有超长hcdr3，其中小鼠igm骨架与连接至小鼠(m)的恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。流式细胞术谱每列的身份是：1501，bv
κ
/mc
κ
；1502，bv
κ
/mc
λ1
；1503,bv
κ
/mc
λ2
；1504，bv
κ
/mc
λ3
；1505,bv
λ
/mc
κ
；1506，bv
λ
/mc
λ1
；1507，bv
λ
/mc
λ2
；1508，bv
λ
/mc
λ3
。第1509行的图是针对hcd4染色的转染对照，第1510行中的图针对小鼠igmb同种异型染色，第1511行中的图针对λlc染色，第1512行中的图针对κlc染色，并且第1513行中的图针对cd79b染色。第一行中的全部图的x轴(1514)指示细胞计数。其余行(1515-1518)中全部图的x轴指示最大值的％。未转染的hcd4-细胞的频率由第1514行中每幅图左上方的数字指示，并且转染的hcd4+细胞的频率由第1514行中每幅图右上方的数字指示。转染效率在全部情况下都类似。第1515-1518行中的全部图中的不同阴影直方图指示每行中使用的特定抗体对转染的hcd4+细胞门控的阴性(1519)和阳性(1520)染色。(如第1501列第1515行中的实例示出的)。第1515行中各图右上方的数字指示对转染的即hcd4+细胞的细胞表面igmb染色的
平均荧光强度(mfi)，这是表达水平的定量指示。在牛科动物v
κ
与小鼠c
λ1
、c
λ1
或c
λ2
(第1515行，第1502-1504图)连接时，细胞表面上的igm表达比在相同牛科动物v
κ
与小鼠c
κ
(第1515行，第1501图，mfi 7547)连接时更少(分别地，mfi 586、449、180)。类似地，在与c
λ1
、c
λ1
或c
λ2
(分别地，第1515行，第1506-1508图，mfi 8017、8951、10783)连接时，具有v
λ
的牛科动物igm表达比与c
κ
(第1515行，第1505图，mfi 6726)更好，尽管在这种情况下，这种情况下的表达差异并不那么明显。
[0377]
图16示出了表达牛科动物ighv b4的细胞的流式细胞术分析结果，该vh结构域具有正常长度hcdr3，其中小鼠igm骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。流式细胞术谱每列的身份是：1601，bv
κ
/mc
κ
；1602，bv
κ
/mc
λ1
；1603,bv
κ
/mc
λ2
；1604，bv
κ
/mc
λ3
；1605,bv
λ
/mc
κ
；1606，bv
λ
/mc
λ1
；1607，bv
λ
/mc
λ2
；1608，bv
λ
/mc
λ3
。第(1609)行的图是针对hcd4染色的转染对照，第(1610)行中的图针对小鼠igmb同种异型染色，第(1611)行中的图针对λlc染色，第(1612)行中的图针对κlc染色，并且第(1613)行中的图针对cd79b染色。行中的全部图的x轴(1614)指示细胞计数。其余行(1615-1618)中全部图的x轴指示最大值的％。未转染的hcd4-细胞的频率由第1614行中每幅图左上方的数字指示，并且转染的hcd4+细胞的频率由第1614行中每幅图右上方的数字指示。转染效率在全部情况下都类似。第1615-1618行中的全部图中的不同阴影直方图指示每行中使用的特定抗体对转染的hcd4+细胞门控的阴性(1619)和阳性(1620)染色。(如第1601列第1615行的实例示出的)。第1615行中各图右上方的数字指示对转染的即hcd4+细胞的细胞表面igmb染色的平均荧光强度(mfi)，这是表达水平的定量指示。在牛科动物v
κ
与小鼠c
λ1
、c
λ1
或c
λ2
(第1615行，第1602-1604图)连接时，细胞表面上的igm表达比在相同牛科动物v
κ
与小鼠c
κ
(第1615行，第1601图，mfi 6339)连接时更少(分别地，mfi 496、566、168)。类似地，在与c
λ2
或c
λ3
(分别地，第1615行，第1607图、第1608图，mfi 10246、17240)连接时，具有v
λ
的牛科动物igm表达比与c
κ
(第1615行，第1605图、第9103)更好。然而，在这种情况下，v
λ-c
κ
(9108)的mfi实际上高于v
λ-c
λ1
(7263)。
[0378]
该分析的结果指示，包含牛科动物v
λ
和小鼠c
κ
或牛科动物v
κ
和小鼠c
λ1
、c
λ2
或c
λ
3的杂合体轻链在具有μhc的细胞表面上相对表达不良。由于b细胞的存活取决于igm bcr表达，明显的是，牛科动物v
λ
和小鼠c
κ
的配对会导致表达λlc的b细胞的发育大大降低。类似地，将牛科动物v
κ
与小鼠c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
配对会降低表达κ-lc的b细胞的发育。
[0379]
具有杂交体或同源lc的ig的表达和分泌。瞬时转染细胞的上清液和细胞裂解物通过蛋白印迹进行分析。图17示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的上清液(1701)和细胞裂解物(1702)的结果，该vh结构域具有超长hcdr3，其中小鼠igg2a hc骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。印迹在还原条件下电泳并用小鼠γ2a hc抗体探测。每个泳道的内容物：1703，bv
κ
/mc
κ
；1704，bv
κ
/mc
λ1
；1705,bv
κ
/mc
λ2
；1706，bv
κ
/mc
λ3
；1707,bv
λ
/mc
κ
；1708，bv
λ
/mc
λ1
；1709，bv
λ
/mc
λ2
；1710，bv
λ
/mc
λ3
。
[0380]
分子量标准物处于1711泳道。无论lc是什么，这种特定bv
κ
/mcl组合都没有特别良好分泌，但明显bv
κ
/mc
κ
(1703)比bv
κ
/mc
λ2
(1705)或bv
κ
/mc
λ3
(1706)分泌得更好。另一方面，bv
λ
与mc
κ
(1707)分泌很差，但bv
λ
与全部三个小鼠c
λ
亚类(1708-1710)分泌良好。细胞内hc水平与全部八种构建体类似(印迹1702，泳道1703-1710)，指示不同的细胞内蛋白稳定性不是观察到的分泌差异的原因。图18示出了使用myc(1802)和gapdh(1803)的上样对照。该图中
的泳道命名对应于图17中的那些。
[0381]
图19示出了表达牛科动物blv1h12的细胞的上清液(1901)和细胞裂解物(1902)的结果，该vh结构域具有平均长度hcdr3，其中小鼠igg2ahc骨架与连接至小鼠(m)恒定区c
κ
、c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
的牛科动物(b)v
λ
(af023843.1)或v
κ
(bc122795)配对。在这种情况下，印迹在还非原条件下电泳并用小鼠γ2a hc抗体探测。每个泳道的内容物：1903，bv
κ
/mc
κ
；1904，bv
κ
/mc
λ1
；1905,bv
κ
/mc
λ2
；1906，bv
κ
/mc
λ3
；1907,bv
λ
/mc
κ
；1908，bv
λ
/mc
λ1
；1909，bv
λ
/mc
λ2
；1910，bv
λ
/mc
λ3
。分子量标准物处于1911泳道。无论lc是什么，这种特定bv
κ
/mcl组合都没有特别良好分泌，但明显bv
κ
/mc
κ
(1903)比bv
κ
/mc
λ2
(1905)或bv
κ
/mc
λ3
(1906)分泌得更好。另一方面，bv
λ
(1907)与mc
κ
分泌很差，但bv
λ
(1907)与全部三个小鼠c
λ
亚类(1908-1910)分泌良好。细胞内hc水平与全部八种构建体类似(印迹1902，泳道1903-1910)，指示不同的细胞内蛋白稳定性不是观察到的分泌差异的原因。图20示出了使用myc(2001)和gapdh(2002)的上样对照。该图中的泳道命名对应于图19中的那些。
[0382]
实施例10：具有小鼠igd的部分牛科动物免疫球蛋白的表达
[0383]
在大多数哺乳动物的成熟b细胞中，igd与igm共表达。然而，关于奶牛是否具有编码δhc的功能性恒定区基因的问题始终颇有争议。早期的研究没有在奶牛中发现cδ基因或igd蛋白的证据(butler等人，同上；naessens j同上)。随后，已经报道了牛科动物cδ基因的存在(zhao，等人，同上)和牛科动物igd的表达(xu，等人，同上)的证据，尽管报道的牛科动物ig
d+
细胞的频率比小鼠中低得多。国际immunogeneticshttp://www.imgt.org,(imgt)目前对牛科动物igh基因座的注释列出了四个cδ基因ighdd1p、ighdd2p、ighdd39和ighd，它们没有一个是功能性的。存在两个ighd等位基因，一个是由于m1的移码导致的假基因，并且另一个是由于非典型剪接供体ngc导致的orf，而不是ngt导致的orf。xu等人(同上)观察到的igd
+
细胞的低频率可能是由于偶然的orf等位基因的漏剪接。无论如何，一项令人担忧的是，牛科动物vh结构域在与小鼠cδ连接时可能不正确折叠，因为牛科动物vh基因区域显然随着部分或完全非功能性c
δ
基因而进化。部分牛科动物igd的部分或缺失组装问题可能干扰正常的b细胞发育。
[0384]
为了测试具有cδ骨架的牛科动物vh结构域是否能组装为可在细胞膜上表达的igd分子，使用类似于实施例9的方法进行瞬时转染和流式细胞术分析。
[0385]
将293t/17细胞与作为转染对照的人类cd4(hcd4)表达载体加上来自实施例9的一种hc构建体(ighv blv1h12或b4)共转染，不同之处在于c
μ
被cδ取代，以及另外的ighv bl5b8，也与cδ连接，ighv blv1h12和b4二者分别具有61个和56个氨基酸的超长hcdr3区。每个重链构建体连同cd79a/b表达载体一起共转染实施例9中描述的λlc构建体之一。如可以从图21-图24看出，在与牛科动物v
λ-小鼠c
λ1
、c
λ2
或c
λ3
lc配对时，具有牛科动物vh结构域与小鼠igd骨架的hc在细胞内以及细胞表面上表达。图21示出了具有小鼠igd骨架和牛科动物v
λ-小鼠c
λ1
(2103)、c
λ2
(2104)或c
λ3
(2105)的细胞内牛科动物ighv blv1h12(2101)和牛科动物ighv blv5b8(2102)的表达。在这些研究中，第2106行显示细胞内hcd4染色，这是转染效率的对照。未转染的hcd4-细胞的频率由第2106行中每幅图左下方的数字指示，并且转染的hcd4+细胞的频率由第2106行中每幅图右下方的数字指示。转染效率在全部情况下都类似。第2107-2109行中的全部图中的不同阴影直方图指示每行中使用的特定抗体对转染的hcd4+细胞门控的阴性(2110)和阳性(2111)染色。(如第2103列第2107行中的实例示出的)。第
2107行显示针对细胞内igd的染色，第2108行显示针对细胞内λlc的染色，并且第2109行显示针对细胞内cd79b的染色。这些特定的牛科动物bvh-mc
δ
/bv
λ-mc
λ
组合在转染细胞中细胞内良好表达。图22示出了用相同抗体染色的与图21中相同的牛科动物构建体的细胞表面的表达。基于细胞表面igd、λlc或cd79b染色，全部表达均良好。(细胞表面染色数据与图21中的相同的排列)。图23示出了细胞内牛科动物ighv b4的表达，该牛科动物ighv b4具有平均长度hcdr3，其中小鼠igd骨架和牛科动物v
λ
附接至小鼠c
λ1
(2302)、c
λ2
(2303)或c
λ3
(2304)。在这些研究中，第2305行显示细胞内hcd4染色，这是转染效率的对照。未转染的hcd4-细胞的频率由第2305行中每幅图左下方的数字指示，并且转染的hcd4+细胞的频率由第2305行中每幅图右下方的数字指示。转染效率在全部情况下都类似。第2306-2308行中的全部图中的不同阴影直方图指示每行中使用的特定抗体对转染的hcd4+细胞门控的阴性(2309)和阳性(2310)染色。(如第2302列第2306行中的实例示出的)。第2306行显示针对细胞内igd的染色，第2307行显示针对细胞内λlc的染色，并且第2308行显示针对细胞内cd79b的染色。这些特定的牛科动物bvh-mc
δ
/bv
λ-mc
λ
组合在转染细胞中细胞内良好表达。
[0386]
同样，图24示出了牛科动物ighv b4的表达，该牛科动物ighv b4具有附接至小鼠c
λ1
(2402)、c
λ2
(2403)或c
λ3
(2404)的小鼠igd骨架和牛科动物vλ，但该图显示细胞表面染色。(细胞表面染色数据与图23中的相同的排列)。这些特定的牛科动物bv
h-mc
δ
/bv
λ-mc
λ
组合在转染细胞表面上良好表达。
[0387]
因此，三个测试的牛科动物vh结构域与小鼠igd骨架表达，尽管取决于特定的hc/lc组合，但细胞表面表达水平存在一些变异性。认为，在b细胞发育期间，可以在细胞表面上表达为igd的hc/lc组合被选择进入滤泡b细胞区室，产生多样的bcr库。
[0388]
前面仅仅说明了本文描述的方法的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文未明确描述或显示，这些布置体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要意在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于这样的具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述预期包括其结构和功能等同物两者。另外，意在这样的等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发的执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。在随附的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应被解释为根据35u.s.c.
§
112,的手段加功能的限定。本文引用的全部参考文献为了全部目的通过引用以其整体并入。
[0389]
序列表
[0390]
牛科动物ig
[0391]
(注意，牛科动物基因组的序列和注释仍然不完整。这些表格不一定描述完整的牛科动物vh、d和jh、v
κ
和j
κ
，或v
λ
和j
λ
基因区段。)
[0392]
(f＝功能性，orf＝开放阅读框，p＝假基因，*01指示imgt等位基因数)
[0393]
表1.牛科动物igh基因座
[0394]
种系vh序列
[0395]
在登录号(如果已知，则加下划线)指重排的基因组dna或cdna，并且对应的种系基
因尚未分离，并且染色体位置未知时，功能性显示在括号[f]与[p]之间。
[0396]
seq id no.1ighv1-7(f)
[0397]
》ighv1-7*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0398]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccgtcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcgacaaggctgtaggctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtggctcggtggtatagacactggtggaagcacaggctataacccaggcctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacaactgaggactcggccacatactactgtactactgtgcaccag
[0399]
seq id no.2ighv1-10(f)
[0400]
》ighv1-10*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0401]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcagctatggtgtaggctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtgtcttggtggtataagtagtggtggaagcacaggctataacccagccctgaaataccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcactgagcagcgtgacaactgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0402]
seq id no.3ighv1-14(f)
[0403]
》ighv1-14*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0404]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctgtccctcacctgcacggtctctggattctcattaagcgataatagtgtaggctgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtggctcggtgtcatatatagtggtggaagcacaggctataacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctatcactgagcagcgtgacaactgaggacacggccacatactactgtgcaagaga
[0405]
seq id no.4ighv1-17(f)
[0406]
》ighv1-17*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0407]
caggtgcagctgcgcgagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcagctatgctgtaagctgggtccgccaggctccagggaaggctctggagtggcttggtgatataagcagtggtggaagcacaggctataacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacacctgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0408]
seq id no.5ighv1-20(f)
[0409]
》ighv1-20*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0410]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcactgagcagctatgctgtaggctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtggctcggtggtataagcagtggtggaagcacatactataacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacacctgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0411]
seq id no.6ighv1-121(f)
[0412]
》ighv1-21*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0413]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacgatctctggattctcattgagcagctatgctgtaggctgggtccgccaggctccggggaaggcgctggagtgggttggtggtataagtagtggtggaagcacatgccttaacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacaactgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0414]
seq id no.7ighv1-25(f)
[0415]
》ighv1-25*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0416]
caggtgcagctgcaggagtcgggccccagcctggtaaagacctcacagaccctctccctcacctgcacggcctctggattatcattaaccagatatggtatacactgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtggcttggtgatataagcagtggtggaagcacaggctataacccaggcctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcactgagcagcctgacacctgaggactcagccacatactactgtgcaagaga
[0417]
seq id no.8ighv1-27(f)
[0418]
》ighv1-27*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0419]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcagcaatggtgtaggctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtgggttggtggtatagataatgatggagacacatactataacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacacctgaggacacggccacatactactgtgcaaaaga
[0420]
seq id no.9ighv1-30(f)
[0421]
》ighv1-30*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0422]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcagcaatggtgtagtctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtggctcggtggtatatgcagtggtggaagcacaagctttaacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacacctgaggacacggccacatactactgtgcaagaga
[0423]
seq id no.10ighv1-32(p)
[0424]
》ighv1-32*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0425]
caggtgcagctgcaggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctgtccctcacctgcacggtctctggattctcattaagcgacaatgctgtaggctgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtagcttggtggtatagataatgatggatacacaaggtataacccagccctgaaatcccggctcagcattaccaaggacaactccaagagctaagtctctgtgtcagtgagcagcgtgacaactgaggactcggccgtgtactactgtgcgaagga
[0426]
seq id no.11ighv1-33(f)
[0427]
》ighv1-33*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0428]
caggtgcagctgcgggagtcgggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacgatctctggattctcattgagcagctatgctgtaggctgggtccgccaggctccggggaaggcgctggagtgggttggtggtataagtagtggtggaagcacatgccttaacccagccctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacaactgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0429]
seq id no.12ighv1-37(f)
[0430]
》ighv1-37*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0431]
caggtgcagctgcaggagtcgggccccagcctggtgaagacctcacagacactctccctcacttgcacggcctctggattatcattaaccagatatggtatacactgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtggcttggtgatataagcagtggtggaagcacaggctataacccaggcctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcactgagcagcctgacgcctgaggactcagccacatactactgtgcaagaga
[0432]
seq id no.13ighv1-39(f)
[0433]
》ighv1-39*01|家牛_荷斯坦牛|f|v-区|
[0434]
aaggtgcagctgcaggagtcgggtcccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacgacctctggattctcattgaccagctatggtgtaagctgggtccgccaggctccagggaaggcgctggagtggctc
ggtggtatagatagtggtggaagcacaggctataacccaggcctgaaatccaggctcagcatcaccagggacaactccaagagccaagtctctctgtcagtgagcagcgtgacacctgaggacacggccacatactactgtgcgaagga
[0435]
seq id no.14ighv1-43(f)
[0436]
》ighv1-43*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0437]
gaggtgcagctgcgggagtggggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcaccttcatggtctctggattctcattgaccagctatggtgtagattgggtccgccaggctccagggaaggtgccggaatgggttggtggtataagcagtggtggaagtacatactataacccagccctgaaattcccggctcagcatcacgagggaaacctccaagagccaagtctctctgagcagcgtgacaactgaggacacggccgtgcactactgtgtgaagga
[0438]
seq id no.15ighv1-46(p)
[0439]
》ighv1-46*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0440]
aaggtgcagctgcgggagtggggccccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcaccttcatggtctctggattctcattgaccagctatggtgtagattgggtccgccaggctccagggaaggtgccggaatgggttggtggtataagcagtggtggaagtacatactataacccagccctgaaattcctggctcagcatcacgagggaaacctccaagagccaagtctctctgagcagcgtgacaactgaggacacggccgtgcactactgtgtgaagga
[0441]
seq id no.16ighv1s1[f]
[0442]
》u55165|ighv1s1*01|家牛|f|v-区|
[0443]
aaggtgcagctgcaggagtcgggtcccagcctggtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggattctcattgagcagctatggtatacactgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtggcttggtgatataagcagtggtggaagcacaggctataacccaggcctgaaatcccggctcagcatcaccaaggacaactccaagagccaagtctctctgtcactgagcagcctgacgcctgaggacacagccacatactactgt
[0444]
seq id no.17ighv1s2[p]
[0445]
》ighv1s2*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0446]
ccgatgcagctgcaggagtcaggccccagcctggtgaagccctcacagaccctttccttcacctgcactgtgtctggattctcattaaccaacaatggtgtaggctgggtccgccaggctccacaaaagggattggagttggttggtatcatatgtacaatatgatatatatatgatatggaagcacatactaccacccagcccttaagtccaggctcagcatcaccagcgacatctccaagagcctagtctcttgtattactgagcagcgtgacaactgaggacacggccctgtagtactgtgcaaaaga
[0447]
seq id no.18ighv2-5(p)
[0448]
》ighv2-5*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0449]
cagatgagctgcagcagtcgggccagaactggtgaaccctcactcaccctctcctgacgtgcactgtctcttcttactccatcacgtggttattgtcggaactggattcgccaggccctagggaaggggctagagcagatgtcataaataagctatgatggtgacacttactacagcccctgcatcaagatcacacctccatctgcagagacatccaagaatcagttctctctgcagctgagctctgtgaccactgaggacacggcagtgtgctgctgtgcaagaga
[0450]
seq id no.19ighv2-6(p)
[0451]
》ighv2-6*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0452]
caggtgaaggtgcaggagtcgggcccagacctggtgaagccctcgcagatcgtctccctcacatgtgctgtctctggttactccatcacgtggttatggtgagagctgggtccaccaggccccagcgaaggggctagagtggatgggaagcatatattataatggtgacacttaccacagcccctccatcaagagccacacctccatctccaggggcacgtctaagaaccagtcctccctgcagctgagctccgtgaccactgtggacacagctgtgtattactgtgcaagaga
[0453]
seq id no.20ighv2-9(p)
[0454]
》ighv2-9*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0455]
ccagtgcagctgcaggagcagggtccagaactgcggaagctctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccaatggttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgacaaccaaggacacggcagtatgctgctgtgcaagaga
[0456]
seq id no.21ighv2-12(p)
[0457]
》ighv2-12*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0458]
ccagatgcactgcagcagtcgggcccagaactagtgagccctcactgaccctctcctcacgtgcactatctctggttactccatcaagtggttattgagggaactggttttgccaggccccagggaaggggctagagcagatggcatgcataaactaagatggtgacacttactacatcccctccatcaagagccacacctccaatcagttctccctgcagctgaactctgtgaccattgaggacacggccatgtgttgctgggcaagaga
[0459]
seq id no.22ighv2-13(p)
[0460]
》ighv2-13*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0461]
caggtgaaggtgcaggagtcgggcccagagacctggtgaagccctcgcagatcgtctccctcacatgtgctgtctctggttactccatcacgtggttatggtgggagctggatccaccaggccccagcgaaggggctagagtagatgggaagcatatattataatggtgacacttaccacagcccctccttcaagagccacacgtccatctccaggggcacgtctaagaaccagtcctccctgcagctgagctccgtgaccactgtggacacagctgtgtgttactgtgcaagaga
[0462]
seq id no.23ighv2-16(p)
[0463]
》ighv2-16*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0464]
ccagtgcagctgcaggagcagggtccagaactgcggaagctctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccagtggttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgacaaccaaggacacggcagtatgctgctgtgcaagaga
[0465]
seq id no.24ighv2-19(p)
[0466]
》ighv2-19*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0467]
ccagtgcagctgcaggagcagggtccagaactgcggaagctctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccagtggttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgatgaccaaggacacggcagtatgctgctgtgcaagaga
[0468]
seq id no.25ighv23(p)
[0469]
》ighv2-23*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0470]
cccagatgcactgctgcagtcgggccagaactggtgaagccctcactgactgtctcctcacttgcactgtctctgcttactccatcacgtggttattgtgggaactggattcgccaggccccagggaaggggctagagcagatgacatgcataaactatgatggtgacacttactacagcccctccatcaagagccacatctccatctgcagggacatccaagaatcagttctccctgcagctgagctctgtgaccactgaggacacggccatgtgttgctgtgcaagaga
[0471]
seq id no.26ighv2-24(p)
[0472]
》ighv2-24*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0473]
caggtgaaggtgcaggagtcgggcccagaactggtgaagccctcgcagatcgtctccctcacatgtgctgtctctggttactccatcacgtggttatggtgggagctggatccaccaggcccgagggaaggggctagagtagatgggaagcatatattataatggtgacacttaccacagcccctccatcaagagccacacgtccatctccaggggcacgtctaagaaccagtcctccctgcagctgagctctgtgaccactgaggacacagctgtgtattactgtgcaagaga
[0474]
seq id no.27ighv2-26(p)
[0475]
》ighv2-26*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0476]
ccagtgcagctgcaggagcagggtccagaactgcggaagctctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccagtggttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgacgaccaaggacacggcagtatactgctgtgcaagaga
[0477]
seq id no.28ighv2-29(p)
[0478]
》ighv2-29*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0479]
ccagtgcagctgcaggagcagggtccagaactgcggaagctctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccagtggttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgatgaccaaggacacggcagtatactgctgtgcaagaga
[0480]
seq id no.29ighv2-31(p)
[0481]
》ighv2-31*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0482]
caggtgaaggtgcaggagtcgggcccagaactggtgaagccctcgcagatcatctccctcacatgtgctgtctctggttactccatcacgtggttatggtgggagctggatccaccaggccccagggaaggggttagagtggatgggaagcatatattataatggtgacacttaccacagcccctccatcaagagccacacctccatctgcagagacatccaacaatcagttctccctgtagctgagctctgtgaccactgaggacacagctctgtgttgctgtgcaagaga
[0483]
seq id no.30ighv2-35(p)
[0484]
》ighv2-35*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0485]
cccagatgcactgctgcagtcgggccagaactggtgaagccctcactgactgtctcctcacttgcactgtctctgcttactccatcacgtggttattgtgggaactggattcgccaggccccagggaaggggctagagcagatgacatgcataaactatgatggtgacacttactacagcccctccatcaagagccacatctccatctgcagggacatccaagaatcagttctccctgcagctgagctctgtgaccactgaggacacggccatgtgttgctgtgcaagaga
[0486]
seq id no.31ighv2-36(p)
[0487]
》ighv2-36*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0488]
caggtgaaggtgcaggagtcgggcccagaactggtgaagccctcgcagatcgtctccctcacatgtgctgtctctggttactccatcacgtggttatggtgggagctggatccaccaggccccagggaaggggctagagtggatgggaagcatatattataaaggtgacacttaccacagcccttccatcaagagccacacgtccatctccaggggcacgtctaagaaccagtcctccctgcagctgagctctgtgaccactgaggacacagctgtgtattactgtgcaagaga
[0489]
seq id no.32ighv2-38(p)
[0490]
》ighv2-38*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0491]
ccagtgcagctgcaggagtagggcccagaactgctgaagctctcactgaccctctccctcacctgtgccatctctggttgctccatcaccagtgcttactggtaaccagtactccctgcagctaagctctgtgatgaccaaggacacggcagtgtgttgctgtgcaagaga
[0492]
seq id no.33ighv2-42(p)
[0493]
》ighv2-42*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0494]
caggtgtcctgcagcagttgggcccagaactggtgagccctcagagaccctctcctcacatgtgctatctctgcttacaccatcatgtggttatagtcagaagtggattcgccaggccgcagggaaggggctagagcagatggcatgcataaactatgatggtgacacttactacagcccctccattaagagccacacctccatctcagagacatccaagaatcagttctccctgctactgagctctgtgaccactgaggacatggccgtgtgttgctgtgcaagaga
[0495]
seq id no.34ighv2-45(p)
[0496]
》ighv2-45*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0497]
caggtgtcctgcagcagttgggcccagaactggtgagccctcagagaccctctcctcacatgtgctatctctgcttacaccatcatgtggttatagtcagaagtggattcgccaggccgcagggaaggggctagagcagatggcatgcataaactatgatggtgacacttactacagcccctccattaagagccacacctccatctcagagacatccaagaatcagttctccctgctactgagctctgtgaccactgaggacatggccgtgtgttgctgtgcaagaga
[0498]
seq id no.35ighv2s1[p]
[0499]
》ighv2s1*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0500]
caggtgcagctgcaggaatcaggcccggaactgataaagtcttcacagacactctccctcacctgtgctggttctggttactccatcaccagtgattatggtaggaactggatccgccaggccccagggaagggtctagagcagatgggatgcatgtattataatggtgacacttattacagcccctccatcaagagtcacacctccatctgcagagacacacccaagaaccagttctccctgcagctgagctctgtgcccacagaggacacagccatgtgttacttggcaagaaa
[0501]
seq id no.36ighv3-1(p)
[0502]
》ighv3-1*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0503]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatataccttcaccgactacatgcactgggtgtgacaggcccctcagcaagagcttgaacggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtacgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcatcacctacgtggagctgagcagtctgaggtctgacgacacggctgtttattactgtgtgaga
[0504]
seq id no.37ighv3-2(p)
[0505]
》ighv3-2*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0506]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatataccttcaccgactacatgcactgggtgtgacaggcccctcagcaagagcttgaacggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtacgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcatcacctacgtggagctgagcagtctgaggtctgacgacacggctgtttattactgtgtgaga
[0507]
seq id no.38ighv3-3(p)
[0508]
》ighv3-3*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0509]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatataccttcaccgactacatgcactgggtgtgacaggcccctcagcaagagcttgaacggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtacgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcatcacctacgtggagctgagcagtctgaggtctgacgacacggctgtttattactgtgtgaga
[0510]
seq id no.39ighv3-4(p)
[0511]
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[0512]
caggtgcagctggtgctgttggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactactacacgcactaggtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacagatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtacgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcaccgccgacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0513]
seq id no.40ighv3-8(p)
[0514]
》ighv3-8*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0515]
caggtgcagctggtgccgttggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaag
gcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcgtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacggatggatggactgaccctcaacatggtggaactaggtacacctagaagttccagagcagagtgatcttggttgcacacacgcccaccaacaccgcctacatggagcagagcagtctgagtctgaggacacggctgtttattactgtgtgaggta
[0516]
seq id no.41ighv3-11(p)
[0517]
》ighv3-11*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0518]
cagttgcagctggtgccattggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgggtgtgacaggcccctcaacaagggcttgaaaggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcaccgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0519]
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[0520]
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[0521]
caggtgcagctggtgctgttgtggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgggtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaagggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcactgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacatggctgtttattactgtgtgagaca
[0522]
seq id no.43ighv3-18(p)
[0523]
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caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcgtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacggatggatggactgaccctcaacatggtggaactaggtacacctagaagttccagagcagagtgatcttggttgcacacacgtccaccaacaccgcctacatggagcagagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagg
[0525]
seq id no.44ighv3-22(p)
[0526]
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caggtgcagctggtgccattggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcatgtgacaggcccctcagcaagggcttgaaaggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcaccttggttgcagacccgtgcacctgcactgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0528]
seq id no.45ighv3-28(p)
[0529]
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[0530]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcgtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacggatggatggactgaccctcaacatggtggaacaaggtacacctagaagttccagagcagagtgatcttggttgcacacacgcccaccaacaccgcctacatggagcagagcagtctgagtctgaggacacggctgtttattactgtgtgaggta
[0531]
seq id no.46ighv3-34(p)
[0532]
》ighv3-34*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0533]
caggtgcagctggtgccattggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcatgtgacaggcccctcagcaagggcttgaaaggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcaccttggttgcagacccgtgcacctgcactgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0534]
seq id no.47ighv3-40(p)
[0535]
》ighv3-40*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0536]
caggtgcagctggtgccgttggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcttgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcatgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacggatggatagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcacgttgctgcagacacgtccaccagcaccgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattattgtgtgagaca
[0537]
seq id no.48ighv3-41(p)
[0538]
》ighv3-41*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0539]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactactacacgcactaggtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacagatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtacgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcaccgccgacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0540]
seq id no.49ighv3-44(p)
[0541]
》ighv3-44*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0542]
caggtgcagctggtgcagtgggggctgagctgaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactacatgcactgcgtgtgacaggcccctcagcaagggcttgaacagatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcaccgccgacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgtttattactgtgtgagaca
[0543]
seq id no.50ighv3-47(p)
[0544]
》ighv3-47*01|家牛_荷斯坦牛|p|v-区|
[0545]
caggtacagttggggctgagctaaggaagcctggggcctcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacaccttcaccaactactacatgcactgggtgtgacaggaccctcagcaatggcttgaatggatggacagattgacagcaaagatggtggagcaaagtatgcacagaagttccagggcagagtcacgttggctgcagacacgtccaccagcaccgcctacatggagctgagcagtctgaggtctgaggacacggctgttattactgtgtgaaaca
[0546]
种系d序列
[0547]
seq id no.51ighd1-1(f)
[0548]
》ighd1-1*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0549]
agaataccgtgatgatggttactgctacacc
[0550]
seq id no.52ighd2-1(f)
[0551]
》kt723008|ighd2-1*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|286128..286143|16nt|1|||||16+0＝16|||
[0552]
ttactatagtgaccac
[0553]
seq id no.53ighd3-1(f)
[0554]
》ighd3-1*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0555]
gtattgtggtagctattgtggtagttattatggtac
[0556]
seq id no.54ighd4-1(f)
[0557]
》ighd4-1*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0558]
gtagttatagtggttatggttatggttatagttatggttatac
[0559]
seq id no.55ighd5-2(f)
[0560]
》ighd5-2*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0561]
atgatacgataggtgtggttgtagttattgtagtgttgctac
[0562]
seq id no.56ighd6-2(f)
[0563]
》ighd6-2*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0564]
gtagttgttatagtggttatggttatggttgtggttatggttatggttatgattatac
[0565]
seq id no.57ighd7-3(f)
[0566]
》ighd7-3*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0567]
gtagttatggtggttatggttatggtggttatggttgttatggttatggttatggttatggttatac
[0568]
seq id no.58ighd8-2(f)
[0569]
》ighd8-2*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0570]
gtagttgtcctgatggttatagttatggttatggttgtggttatggttatggttgtagtggttatgattgttatggttatggtggttatggtggttatggtggttatggttatagtagttatagttatagttatacttacgaatatac
[0571]
seq id no.59ighd9-1(f)
[0572]
》ighd9-1*01|家牛_荷斯坦牛|f|d-region|
[0573]
gaactcggtggggc
[0574]
种系jh序列
[0575]
seq id no.60igj1-1(orf)
[0576]
》ighj1-1*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0577]
actatgcagacttccatctctggagccaggctgccctgggcaccgtctcctcag
[0578]
seq id no.61igj1-2(orf)
[0579]
》ighj1-2*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region||
[0580]
ctgctgggacttggatctctggggccagcgcaccccggtcaccatgtccttgggga
[0581]
seq id no.62igj1-3(orf)
[0582]
》ighj1-3*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0583]
caatgcttttgactcctggggccagcgcacccccatctccatctcctcag
[0584]
seq id no.63igj1-4(f)
[0585]
》ighj1-4*01|家牛_荷斯坦牛|f|j-region|
[0586]
actattcgacaactggggcccaggaatccaaaacaccgtctcctcag
[0587]
seq id no.64igj1-5(p)
[0588]
》ighj1-5*01|家牛_荷斯坦牛|p|j-region|
[0589]
taacaactggctcaagcactggggtcaggaagcctgggcactgtctgctc
[0590]
seq id no.65igj1-6(f)
[0591]
》ighj1-6*01|家牛_荷斯坦牛|f|j-region|
[0592]
tttactatggtatagacgcctggggccgagggctcagggtcaccgtctcctcag
[0593]
seq id no.66igj2-1(orf)
[0594]
》ighj2-1*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0595]
actatgctgacttccatctctgtggccaggctgccctgggcaccgtctcctcagctgaatctg
[0596]
seq id no.67igj2-2(orf)
[0597]
》ighj2-2*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0598]
ctgctgggacatggatctctggggccagcgcaccccggtcaccgtgtccttgggga
[0599]
seq id no.68igj2-3(orf)
[0600]
》ighj2-3*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0601]
caatgcttttgactcctggggccagcgcgccccggtctccatctcctcag
[0602]
seq id no.69igj2-4(f)
[0603]
》ighj2-4*01|家牛_荷斯坦牛|f|j-region|
[0604]
actacgtcgatgcctggggccaaggactcctggtcaccgtctcctcag
[0605]
seq id no.70igj2-5(p)
[0606]
》ighj2-5*01|家牛_荷斯坦牛|p|j-region|
[0607]
taacaactggctcaagcactggggtcgggaagcctgggcactgtctgctc
[0608]
seq id no.71igj2-6(orf)
[0609]
》ighj2-6*01|家牛_荷斯坦牛|orf|j-region|
[0610]
attactatagtatatatgtttgcggccgagggatcgaggtcaccgtctcctcag
[0611]
表2.牛科动物igk基因座
[0612]
种系vk序列
[0613]
seq id no.72igkv1-1(orf)
[0614]
》igkv1-1*01|家牛_海福特牛|orf|v-区|
[0615]
gacatccaggtaacccagtctccatcctccttgtctgcatctctaggagacagagtctccatcacttgccaggccagtcagagcattgacactaaattagcctggtatcaacagaaaccagggaaagctcctaagctcctcatctatgcaatacccaggtcgccttcctggttcccttcccagttcagtggcagtggatttggggcagatttcaccctcaccatcagcagtctgaaggctgatgatattgcaacttactactgtcagcaggatcacggtttacctac
[0616]
seq id no.73igkv1-4(f)
[0617]
》igkv1-4*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0618]
gacatccaggtgacccagtctccctcctacctgtctgcttctctaggagacagagtctccatcacttgccaggccaatcagagcgttagccactacttaaactggtatcaacagaaaccaggggaagctcctaagctcctgatctattatgcaaccagccggtacaccagagtcccatcccgattcagtggcagtggatctgggacagatttcaccctcaccatcagcagcctggaggctgacgatgctgcaaattattactgtcaacaggattatagtacacctcc
[0619]
seq id no.74igkv1＝5(p)
[0620]
》igkv1-5*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0621]
ggcatccagatgactcagtctccatcctccttgtctgcctctctaggagacagagcatccatcatttgctgggccaattaaagcattagcaaatggttagacagatatgagcagaaaccagggcaagttcctaagctcctgttctatgcagcatccaatttgggaactggggtcccatcccggttcagtggcagtagatctgggacagatttcactgtcaccactctcacctggaggctgaagatgctgcaacttattactgtctacaaactgatagtacacctcc
[0622]
seq id no.75igkv1-21(p)
[0623]
》igkv1-21*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0624]
gacctccagatgattcagtctctatcttccctgtctgcatctctaggagacagagtctccatcacttgtcgggccagtcaaagcgttagaaataatttacagtggtatcaagagaaaccagggaaagctcctaagttcctcatctatgacagaaccagtgtgtacacaggggtcccatcccatttcagtggcagtggatctgggacagattataccttca
ccaccagcagcctgggctgatgattttgcaacttattactgtaaacaggataacagtagacctcc
[0625]
seq id no.76igkv1-25(p)
[0626]
》igkv1-25*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0627]
gacctccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctctaggagacagaatctccatcacttgccgggccagagcgttagcaactacttagcctggtatcaacagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatcacgaatccagattgcacacaggggtcccatcccggttcagtggcagtggatgtgggacagattacaccctcaccatcagcaggctggagtctgacgatgctgcaaattattactgtcagcagtataatagtacacctcc
[0628]
seq id no.77igkv2-6(f)
[0629]
》igkv2-6*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0630]
gatgttgtgctgacccagactccactctccctgtctatcatccctggagagatggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctggtacacagtgatggaaaaacctatttgaattggattcaatataaaccaggccaatcaccacagggtctgatctatcaggtttccaaccgttactctggggtctcagacaggttcactggcagtgggtcagggacagatttcacacttacaatcagcagagtgcaggctgaggatgctggagtctattactgttaccaaggtacagaagatcctcc
[0631]
seq id no.78igkv2-7(p)
[0632]
》igkv2-7*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0633]
gctactatgcagacccagactctacgctccctgtctgtcatcccgggagagatggcctccatctcctgcagagccagtcagagcgttcaaaatagatatggagacaattttttgcactggtatgtgcagaagcccagccagtctccacagctcctgatttatagggcttctaactgggagtcttgggtcccagacaggttcacaagcagtgggttgggaacacatttcatcctcataatcagcagggtggagtctgaggatgctggagtttattactgccagcagagtttacaagcacctcc
[0634]
seq id no.79igkv2-9(f)
[0635]
》igkv2-9*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0636]
gatgttgtgctgacccagactcccctctccctgtctgtcatccctggagagacggtcaccatctcctgcaagtctactcagagtctgaaatatagtgatggaaaaacgtatttgcaatggtttcaacataaaccaggccagtctccacggctattgatctatcagatttccaaccgttacactggggtcccagacaggttcactggcagtgggtcagagacagatttcacacttacaatcagcagtgtgcaggctgaggatgctggagtctattactgtcttcaaagatcatatgctcctcg
[0637]
seq id no.80igkv2-10(p)
[0638]
》igkv2-10*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0639]
ggctattatgcagaaccaactatacgctccctgtctgtcatccctggagagactgccttcatctcctgcagagccagtcagagcattcaatatagatagggagacaatttttttgcactggtatgtgcagaagcccagccagtctccacagctcctgatttatagggcttctaactgggagtcttgggtcccagacaggttcacaagcagtgggttgcgaacagatttcatcctcataatcagcagggtggaggctgaggatgctggagtttattactgccagcagagtttacaagcacctcc
[0640]
seq id no.81igkv2-12(orf)
[0641]
》igkv2-12*01|家牛_海福特牛|orf|v-区|
[0642]
gatgttgtgctgacccagactcccctctccctgtctgtcatccctggagagacggtctccatctcctgcaagtctactcagagtctgaaatacagtgatggaaaaacctatttgtaccggcttcaacataaaccaggccaatca
ccacagagtttgatctattatgtttccaaccgttacactggggtcccagacaggttcactggcagtgggtcagagacagatttcacacttacgatcagcagtgtgcaggctgaggatgctggagtctattactgttttcaaggcacacaggttcctcc
[0643]
seq id no.82igkv2-13(p)
[0644]
》igkv2-13*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0645]
gctataaggcagacccagactctacgctccctgtctgtcatccctggagagacggcctccgtctcctgcagagccagtcagagcgttcaaaatagatatggagacaatttttttgcattggtatgtgcagaagcccagccagtctccacagctcctgatctatggagcttctaaccaggcctctggagtctgagacaggttcactggcagtgggtcagggacagacttcaccctcaaaagcagcagggtcggggctgaggatgctggagtttattattgccaccaaagtaaagaaactcctcc
[0646]
seq id no.83igkv2-15(f)
[0647]
》igkv2-15*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0648]
gatgttgtgctgacccagactcccctctccctgtctgtcatccctggagagacggtctccatctcctgcaagtctactcagagtctgaaatatagtgatggaaaaacctatttgcgttgggttcaacataaaccaggccaatcaccacagggtgtgatctatcaggtttccaaccgtaatactggggtcccagacaggttcactggcagtgggtcagaaacagatttcacacttacaatcagcagtgtgcaggctgaggatgctggagtctattactgttttcaaggtacatatgaacctcc
[0649]
seq id no.84igkv2-16(p)
[0650]
》igkv2-16*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0651]
gctataatgcagacccagactctacgctccctgtctgtcatccctggagagacggcctccatctcctgcagagccagtcagagcgttcaaaatagatatggagacaatttttttgcattggtatgtgcagaagcccagccagtctccacagctcctgatctatggagcttttaaccaggcctctggagtctgagacaggttcaccggcagtgggtcagggacagatttcaccttcaaaaccagcagggtgggggctgaggatgctggagtttattattgccaccaaagtaaagaaactcctcc
[0652]
seq id no.85igkv2-18(f)
[0653]
》igkv2-18*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0654]
gatgttgtgctgacccagactcccctctccctgtctgtcatccctggagagacggtctccatctcctgcaagtctactcagagtctgaaatatagtggaaaaacctatttgcgttggcttcaacataaaccaggccaatcaccacagagtctgatctatcaggtttccaaccgttacactggggtcccagacaggttcactggcagtgggtcagagacagatttcacacttacgatcagcagtgtgcaggctgaggatgctggagtctattactgtgttcaagagacacatgatcctcg
[0655]
seq id no.86igkv2-19(p)
[0656]
》igkv2-19*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0657]
gctattgttctgacccagactccacgctccctgtctgtcatccctggagagacggcctccatctcctgcagatccagtcagagcattcaaaatagatatggagacaatcttttgcactggtatgtgcagaagcccagccagtctccacagctcctgatctatggaacttctaaccaggcctctggagtctgagacaggttcaccggcagtgggtcagggacagatttcaccctcaaaaccagcagggtggaggctgaggttgctggagtttattattgcaggaaagtaaagaaactccttc
[0658]
seq id no.87igkv2-22(p)
[0659]
》igkv2-22*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0660]
gatgtagtgctgacccagactccactctccttgtctgtcatccctggtgagacggcctccatctcctgcaagtcaagtcagagcctcctgcatagtgatggaaaaacctatttgaactggtttcaacataaaccaggccagtctccacagtgactgatctatcaggcttccaaccgtgacactggggtctcagagaggttcactggcagtgggtcagggacagatttcacacttaaaatcagcagagtgcagattgagtatgctggcatctattactgttttcagcatacatatgatcctcc
[0661]
seq id no.88igkv2-23(p)
[0662]
》igkv2-23*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0663]
gacattgtgctgacccagactccactctccttgtctgtcttccctggagagacggcgtccatctcctgcagaaccagtcagagccttgaagatagttatggagacacttatttgagttggcacttgcagaagcctagccagtctccacagcttctgatctatttggtttccaatagagcctctggggtcccagacaggttcactggcagtgggtcaggaacagatttcacctttaaaatcagcagggtggaggctgaggatgctggagtttattactgccaacagagtatacaagcacctcc
[0664]
seq id no.89igkv3-24(p)
[0665]
》igkv3-24*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0666]
gaaattatgttaacgcagtctccagcctccctgtctttgactccaggggaaatagccaccctcacctgcagggccagtcaaagtattagtagctacttaagactggtaccagcagaagcctgggaaggcccccagattcttcatctatgctgcctccagcagggcctctggcatcccagcccggttcggtgacagttgggtcagggacagactttactctcaccatcagcagcctggagcctgaagatgctgcagttcattcctagtgctagcataatagcgggaa
[0667]
seq id no.90igkv8-3(f)
[0668]
》igkv8-3*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0669]
gaggctgtgctctaccagactccagcctacatcgctgcatccctaggagagagcatctccatcacttgcagagccaatcaaagcattagtgattacttaagctggtataagcagaaacctggccaggctcctatgattctcatctatgatgctgataatcgttataatggtgtcccagagaggttcactgcgactcaatctgagacagaatttgttttcacaatcagccaagtagaggctgatgatgctgccatgtattactgccagcaggattatgcacttcctcc
[0670]
seq id no.91igkv(ii)-2(p)
[0671]
》igkv(ii)-2*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0672]
gacatcatgatgacccagtctcgaagttccttggctgagtctgcaggagaggaaggtcatcatcatctacagatccagccagaatcttctatacttcaaccagaaaacctagtttgcctggtaccagcagaaactgtg
[0673]
seq id no.92igkv(ii)-8(p)
[0674]
》igkv(ii)-8*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0675]
gctgctgtactgactccatctcctccctctggcctgtggccatggagggagcgtcgccatctcctgaaggccatctcttcccatccacagtaatggacacacctgcccgccgtgattcgggcacaaaccacacactctcctcaaccactgatcatagggattcccaggctcctgaggtcccagcctggctcagtgattgtgggtctggatggatttcacacttacactcaccagggtggcgtcccttcatgtgacttctgtgtacagaaccctcactgggaccac
[0676]
seq id no.93igkv(ii)-11(p)
[0677]
》igkv(ii)-11*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0678]
actgctgtgctgactccatctctccctctggcctgtggccatggagggagcgtcgccatctcctgaaggccatctcttctcatccacagtaatggacacaccttcccgccatgcttctggcacaaaccacacactctcctcaac
cactgaccatagagggtcaccaggctcttgaggtcccagcctggctcagtgattgtgggtctggatagatttcacactcacactcaccagggtggggtccctacatgtgacttctgtgcacagaaccctcacttggaccac
[0679]
seq id no.94igkv(ii)-14(p)
[0680]
》igkv(ii)-14*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0681]
gctgctgtgctgacttcatctctccctctggcctgtggccatggagggagcatcgccatctcctgaaggccatctcttctcatccacagtaatggacacacctgcccgccatgcttctggcaaaaaccacacactctcctcaaccactgatcataggtggtccccaggcttcaggggtccaagcctggctcagtgactgtgggtctgggacggatttcacacttacacttaccagggtggggtccctacatgtgacttctgtgcacagaaccctcactgggaccac
[0682]
seq id no.95igkv(ii)-17(f)
[0683]
》igkv(ii)-17*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0684]
gctgaggagactccatctcctccctctggcctgtggccatggagggagcgccgccatctcctgaaggccatctcttctcatccacagtaatggacacacctgcccaccatgtttccggcacaaaccacacactctcctcaaccactgatcatagggcttccccaggcttcaggggtcccagcctggctcagtgactgtgggtctgggatggatttcacacttacactcaccagggtggggtctctacatgtgacttctgtgcacagaaccctcactgggaccac
[0685]
seq id no.96igkv(ii)-20(p)
[0686]
》igkv(ii)-20*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0687]
gctgctgtgctgactccgtcccctccctctggtctgcagtcgtggaaagaggcatctccatctcctgcaaggccatcccatctcatccatagaaatgaatacacctgtcctccctccttccagaacaaaccacacactctcctcacccattgacataggggtcccccaggctcctggggtcccatcctggctcagtggccatggatctgggacggatttcacactcacactcaccactgtggagactggggaccctgaatgtgacttctgtgcacagagccttcaatgggaact
[0688]
种系jk序列
[0689]
seq id no.97igkj1(orf)
[0690]
》igkj1*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0691]
atggacgttaggtcaaggaaccaagctggaagtcaaac
[0692]
seq id no.98igkj2(f)
[0693]
》igkj2*01|家牛_海福特牛|f|j-区
[0694]
taaatactttcggccaaggaaccaaggtagagatcaaaa
[0695]
seq id no.99igkj3(f)
[0696]
》igkj3*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0697]
gttcactttcgggccaaggaccagagtggagatcaaat
[0698]
seq id no.100igkj4(orf)
[0699]
》igkj4*01|家牛_海福特牛|orf|j-区||
[0700]
aattacgttcggcggcgggaccaaggtggaaatcaatc
[0701]
seq id no.101igkj5(orf)
[0702]
》igkj5*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0703]
gatcatctttggccaagggacacgtctggagattagac
[0704]
表3.牛科动物igl基因座
[0705]
种系v
λ
序列
[0706]
seq id no.102iglv1-12(f)
[0707]
》iglv1-12*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0708]
caggctgtgctgactcagccgccctccgtgtccgggtccctgggccagacggtcaccatctcctgcaccggaagcagcaacaacatcgggattttgggtgtgagctggtaccaacagatcccaggatcggcccccagaaccctgatctataatagtaacaaacgaccctcgggggtccccgaccgattctctggcaccaagtccggcaacacaggcaccctgaccatcgcttcgctccaggctgaggacgaggctgattattactgtgcgtctgctgacctcagtcttactagtcc
[0709]
seq id no.103iglv1-14(p)
[0710]
》iglv1-14*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0711]
caggctgtgctgactcagcagccctccgtttccgggtccctgggccagagggtctccatctcctgctctggaagcagcagcaacattgggcatggttatggtacctggtaccaacagatcccaggatcggcccccagaatgctcatctatggtgcgaccagtcgagcctccggtccccgaccgattctccggctccaggtctggcaacacagcgactctgaccatcagctcgctccaggctgaggatgaggcggattatttctgtgcagcttatgacagtagcagtggtcc
[0712]
seq id no.104iglv1-16(p)
[0713]
》iglv1-16*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0714]
caggatgtgctgactcagccgtcctccgtgtccgggtccctgggtcagaaggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaacgttggatatgccaattatgtgagctggcaccaacagaaaccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgcgaccagtcgagcctcgggggtccctgaccaattctccggctccaagtctggcaacacagcgactctgaccatcagctcgctccagcctgaggacgaggctgattattactgttcatcttatgacagtagcagcaatattgg
[0715]
seq id no.105iglv1-17(p)
[0716]
》iglv1-17*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0717]
caggctgtgctgactcagccgccctccgtgtctgggactttgggtcagagggtcaccctctcctgcactggaagcagcagcaacactggggtctttatgtgagctggtaccaacagctcccaggaaggcccccagagtcctgacctatgaaaatagcaaacgaacctcaggactcccagattgattctctggctccaagtctggcagctcggccgcactgaccacctcagttcagtctgaggacgacactgattattactgtttctcatgggctgatggattgaaagtttg
[0718]
seq id no.106iglv1-18(p)
[0719]
》iglv1-18*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0720]
caggctgtgctgactcagccgccctccgtgtccaggactttgggtcagagggtcaccctctcctgcactggaagcagcaacaaccctggggttattctgtgagctggtaccaacagctcccaggaaaggcccccacacttctcatctatgaaaatagcacacgaccctcagcactcccagattgattctctggctccaagtctggcaagtcggtctctctgaccacctcagttcagtctgaggacgacactgattattactgtttctcatgggctgacggattgaaagtttg
[0721]
seq id no.107iglv1-21(f)
[0722]
》iglv1-21*01|家牛_海福特牛|f|v-区|
[0723]
caggctgtgctgactcagccgtcctccgtgtccggctccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcaacaacatcggtagttatggtgtgggctggtaccaacaggtcccaggatcgggcctcagaaccatcatctatggtagtagcagtcgaccctcgggggtccccgaccgattctccggctccaagtctggcaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcggattatttctgtgcaactgttgactacagtagcagtactgt
[0724]
seq id no.108iglv1-22(p)
[0725]
》iglv1-22*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0726]
caggctatgctgactcagctgccctccatgtccgggactttgggtcagagggtcaccctctcctgcac
tgaaagcagcagcaaccctggggtctttatgtgagctggtaccaacagctcccaggaaaggcccccagagtcctgacctgtgaaaatagcaaacgaccctcaggggtcccagattgattctctggctccaagtctggcaacagcctctcttaccacctcagttcatgctgaggatactgattactactgtttctcatgggctgacggcttgaaagtttg
[0727]
seq id no.109iglv1-26(f)
[0728]
》iglv1-26*01|家牛|f|v-区|
[0729]
caggctgtgctgactcagccgtcctccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacgtgctctggaagcagcagcaacgttggatatggcaattatgtgagctggttccaagacatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgacaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcagattatttctgtgcatcttatcagagtggtaacacag
[0730]
seq id no.110iglv1-28(p)
[0731]
》iglv1-28*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0732]
caggctgtgctgactcagccatcatccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaatgttggaaatggatatgtgagctggtaccaactgatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgacaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcagattatttctgtgcatctgctgaggatagtagcagtaatgc
[0733]
seq id no.111iglv1-29(p)
[0734]
》iglv1-29*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0735]
caggctatgctgactcagccgccctccatgttcgggactttgggtcagagggttaccctctccttcactggaaggagcagcaacactgggggtctttatgtgagctggtaccaacagctcccaggaaaggcccctagactcctgacatatgaaaatagcaaacgaccctcaggggtcccagattgattctctggctccaagcctgccaactcagcctctctgaccacctcagttcatgctgaacgatactgattattactgtttctcatgggctgatggcttgaaagtttg
[0736]
seq id no.112iglv1-31(f)
[0737]
》iglv1-31*01|家牛|f|v-区|
[0738]
caggctgtgctgactcagccgtcctccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaacgttggaactggcaattatgtgagctggttccaacagatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgcgaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcagattatttctgtgcatcttatcagagtggtaacacag
[0739]
seq id no.113iglv1-26(orf)
[0740]
》iglv1-36*01|家牛|orf|v-区|
[0741]
caggctgtgctgactcagccgtcctccatgtccgggtccctgggccagagggtctccatcaccagctctggaagcagcagcaacgttggatatggcatttatgtgaaccagtaccaaaaaatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgccaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgagaacgaggcagattatttctgtgcagcttatgacagcagtagcagtgatgg
[0742]
seq id no.114iglv1-40(f)
[0743]
》iglv1-40*01|家牛|f|v-区|
[0744]
caggctgtgctgactcagccgtcctccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaacgttgggcttggtaattatgtgagctggttccaacagatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgcgaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagcca
ccctgaccatcagctcgctccaggccgaggacgaggcggattatttctgtgcatctcctgacagtagtagcagtagtta
[0745]
seq id no.115iglv1-41(p)
[0746]
》iglv1-41*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0747]
caggctatgctgactcagccgccctccatgttcgggactttgggtcagagggttaccctctccttcactggaaggagcagcaacactgggggtctttatgtcagctggtaccaacagctcccaggaaaggcccctagactcctgacatatgaaaatagcaaacgaccctcaggggtcccagattgattctctggctccaagcctggcaactcagcctctctgaccacctcagttcatgctgaacgatactgattattactgtttctcatgggctgatggcttgaaagtttg
[0748]
seq id no.116iglv1-43(f)
[0749]
》iglv1-43*01|家牛|f|v-区|
[0750]
caggctgtgctgactcagccgtcctccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacgtgctctggaagcagcagcaacgttggatatggcaattatgtgagctggttccaagagatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgacaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcagattatttctgtgcatcttatcagagtggtaacacag
[0751]
seq id no.117iglv1-46(p)
[0752]
》iglv1-46*01|家牛|p|v-区|
[0753]
caagctgtgctgactcaaccgccctccatgtctgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaacgttggaactggcaattatgttggctggtaccaaatgatcccaggatcggcccccagaaccctcatctaccgtgctaccagtcgactctcgggggtccccgactgattctccgtctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgcaccaggctgaggacgaggctgattattactgtgtatcttaggacagcagtatcagtggtgc
[0754]
seq id no.118iglv1-47(f)
[0755]
》iglv1-47*01|家牛|f|v-区|
[0756]
caggctgtgctgactcagccatcatccgtgtccgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaatgttggaaatggatatgtgagctggtaccaactgatcccaggatcggcccccagaaccctcatctatggtgacaccagtcgagcctcgggggtccccgaccgattctccggctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgctccaggctgaggacgaggcagattatttctgtgcatctgctgaggatagtagcagtaatgc
[0757]
seq id no.119iglv1-48(p)
[0758]
》iglv1-48*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0759]
caggctatgctgactcagccgccctccatgttcgggactttgggtcagagggttaccctctccttcactggaaggagcagcaacactgggggtctttatgtgagctggtaccaacagctcccaggaaaggcccctagactcctgacatatgaaaatagcaaacgaccctcaggggtcccagattgattctctggctccaagcctgccaactcagcctctctgaccacctcagttcatgctgaacgatactgattattactgtttctcatgggctgatggcttgaaagtttg
[0760]
seq id no.120iglv1-51(p)
[0761]
》iglv1-51*01|家牛|p|v-区|
[0762]
caagctgtgctgactcaaccgccctccatgtctgggtccctgggccagagggtctccatcacctgctctggaagcagcagcaacgttggaactggcaattatgttggctggtaccaaatgatcccaggatcggcccccagaaccctcattgaccgtgctaccagtcgactctcaggggtccccgactgattctccgtctccaggtctgggaacacagccaccctgaccatcagctcgcaccaggctgaggacgaggctgattattactgtgtatcttacgacagcagtatcagtgg
tgc
[0763]
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》iglv(i)-35*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0890]
tatggacgctcagccacactcgcctgcctgggaacagcaacactgttggcaccaagggggcgacttggctgccgtctcagtcgtgctgagtcccaagctctgagcacaggagtcacaacccacccgcagggtctcagcgaggcctgagggctccgggtcaggtggggccacctgaccatctctgggctccagcctgacgccaaggctgattgttcctgctcagctgggactcagccctgctgtt
[0891]
seq id no.164iglv(iv)-15(p)
[0892]
》|iglv(iv)-15*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0893]
tgcaccctgagcagtgacatcagtgtcggctgctctgctgttactggaacaagcagcagccagggagccctcttcggtcctctggtcctaccactcagactccagtaagaaccaggctctggggtccccgtgggttttctggat
ccaaagatgccttggccaacgtggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctgactctcaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0894]
seq id no.165iglv(iv)-20(p)
[0895]
》iglv(iv)-20*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0896]
tgtaccctgagcagtgacatcagtgtcggccactctgctgttactggagccggcagaagccagcgagccctcctcggtcctccggtcctaccgctcagactccagtaaggaccaggctccagggtccccgtgggttttctggatccaaagatacctcggccaacgtgggcctcctgctcatctctgggctgcagcctgagcatgaagctgactctgaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0897]
seq id no.166iglv(iv)-25(p)
[0898]
》iglv(iv)-25*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0899]
tgcaccccgagcagtgacatcagtgttggctgctctgctgttactggaaccagcagaagccagcgagccctccttagtcctccagtcctaccactcagactccagtaagaaccagtctttggggtccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaacgcggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctatctctaaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0900]
seq id no.167iglv(iv)-30(p)
[0901]
》iglv(iv)-30*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0902]
tgcaccctgagcagtgacatcaatgttggctgctctgctgttactggaaccagcagaagccagcgagccctccttagtcctccggtcctaccactcagactccagtaagaaccagtctttggggtccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaacgcggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctatctctaaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0903]
seq id no.168iglv(iv)-33(p)
[0904]
》iglv(iv)-33*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0905]
tgcaccctgagcagtgacatcagtgtcggccgctctgctgttactggaaccagcagaagccagcgagccctcctcggtcctccggtcctaccactcagattccagtaagaaccaggctccggggtccccatgggttttctggatccaaagatgcctcggccaatgcggggctcctgctcgtctctgggctacagcttgaggatgaggctgactctgaccatgcaggctggtgcaacagggctcct
[0906]
seq id no.169iglv(iv)-34(p)
[0907]
》iglv(iv)-34*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0908]
tgcacccggagcagtgacatcagtgtcggccgctctgctgttactagaaccagcagaagccagtgagccctccttggtcctccagttctaccactcagactccagtatgaaccgggctccaggatcccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaacgcagggctccttcttgtctctgggctgcagcctgagcacgaggctgactctgaccgtgcaggctggtgcaacagggcttct
[0909]
seq id no.170iglv(iv)-39(p)
[0910]
》iglv(iv)-39*01|家牛_海福特牛|p|v-区||
[0911]
tgcaccctgcgcagtgacatcagtgtcggccactctgctcttactggaaccagcagaagccagcgagccctcctcggtcctctggtcctaccactgagactccagtaagaatcaggctccggggtcccccgtgggttttctggatccaaagatgcctcggccaatgtagggctcctgctcttctctgggctgcagcccgaggacgaggctgactctgaccgtgcaggctggtgcaacagggcttct
[0912]
seq id no.171iglv(iv)-42(p)
[0913]
》iglv(iv)-42*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0914]
tgcaccctgagcagtgacatcaatgttggctgctctgctgttactggaaccagcagaagccagcgagccctccttagtcctccggtcctaccactcagactccagtaagaaccagtctttggggtccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaacgcggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctatctctaaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0915]
seq id no.172iglv(iv)-56(p)
[0916]
》iglv(iv)-56*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0917]
tgcaccccgagcagtgacatcagtgtcagtcgctctgctgttactagaaccagcagaagccagcgagccctccttagtcctccggtcctaccactcagaccccagtaagaaccagtctttggggtccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaacgcggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctgactctgaccatgcaggctggtgcaacagggcttct
[0918]
seq id no.173iglv(iv)-65(p)
[0919]
》iglv(iv)-65*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0920]
gttactggaaccagcagaagccagtgagccctcctccgccctccgatcctaccactcagactccagtaagaaccaggctccggggtcctcgcaggttttctggatccaaagatgcctcggccaatgcagggctcctgctcgtctccgggctgcagcctgaggatgaggctgactctgaccgtgcaggctggtgcaacagggcttct
[0921]
seq id no.174iglv(iv)-68(p)
[0922]
》iglv(iv)-68*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0923]
tgttactggaaccagcagaagccagcgagccctccttagtcctccggtcctaccactcagactccagtaagaaccagtcggggtccccgcgggttttctggatccaaagatgcctcagccaaggggctcctgctcgtctctgggctgcagcctgaggatgaggctactctaaccatgcaggctggtgcaacagggctt
[0924]
seq id no.175iglv(iv)-69(p)
[0925]
》iglv(iv)-69*01|家牛_海福特牛|p|v-区|
[0926]
gttactggaaccagcagaagccagtgagcctcctccgccctccgatcctaccactcagactccagtacagaaccaggctccggggtcctcgcaggttttctggatccaaagatgcctcggccaatgcagggctcctgctcgtctccgggctgccacctgaggataggctggactctgaccgtgcaggctggtgcaacagggcttct
[0927]
种系j
λ
序列
[0928]
seq id no.176iglj1(orf)
[0929]
》iglj1*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0930]
ttttgtcttaggcggcgggacctgggtcaccgtcctgg
[0931]
seq id no.177iglj2(f)
[0932]
》iglj2*01|家牛_海福特牛|f|j-区|
[0933]
tgatcttttcggcggcgggaccagagtgaccgtcctgg
[0934]
seq id no.178iglj3(f)
[0935]
》iglj3*01|家牛_海福特牛|f|j-区|
[0936]
tgatcttttcggcggcgggaccacagtgaccgtcctgg
[0937]
seq id no.179iglj4(f)
[0938]
》iglj4*01|家牛_海福特牛|f|j-区|
[0939]
tgctgttttcggcagcgggaccacactgaccgtcctgg
[0940]
seq id no.180iglj5(orf)
[0941]
》iglj5*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0942]
tcctattttcattggcaggaccaggctgactgtcctgg
[0943]
seq id no.181iglj7(f)
[0944]
》iglj7*01|家牛_海福特牛|f|j-区|
[0945]
tgctgttttcggcagcgggaccacactgaccgtcctgg
[0946]
seq id no.182iglj8(f)
[0947]
》iglj8*01|家牛_海福特牛|f|j-区|
[0948]
tgctgttttcggcagcgggaccacactgaccgtcctgg
[0949]
seq id no.183iglj9(orf)
[0950]
》iglj9*01|家牛_海福特牛|orf|j-区|
[0951]
tcctattttcattggcaggaccaggctgactgtcctgg
[0952]
表4.牛科动物恒定区基因
[0953]
ighc
[0954]
如果可用，genbank登录号加下划线。
[0955]
igha(f)
[0956]
seq id no.184
[0957]
》igha*01|家牛_荷斯坦牛|f|ch1|nagagtgaaaccagccccagcatcttcccgctgagccttgggaacaacgacccagccgggcaggtggtcatcggctgcctggtccagggcttcttcccgtcggcacccctgagcgtgacctggaaccagaatggcgacagcgtgtccgtcaggaacttccctgccgtgctggccgggagcctgtacaccatgagcagccagctgaccttgccggccagcctgtgcccaaaaggccagtccgtgacctgccaagtgcagcacctctccaaagccagcaagaccgtggccgtgccctgcataattcaa
[0958]
seq id no.185
[0959]
》igha*01|家牛_荷斯坦牛|f|h-ch2|
[0960]
gactcaagttcatgttgcgtgccgaactgcgagcccagcctgtccgtgcagccaccagccctcgaggacctgctcctgggctccaacgccagcctcacgtgcacactgagtggcctgaaaagcgccgagggcgccagcttcacctggaacccgacaggtgggaagaccgccgtccaggggtcgcccaagcgtgactcctgtggctgctacagcgtgtccagcgtcctgccgggctgtgccgatccctggaacagtggacagactttctcctgctctgtcacccaccccgagtccaagagttcactgaccgccaccatcaagaaagactta
[0961]
seq id no.186
[0962]
》igha*01|家牛_荷斯坦牛|f|ch3-chs|
[0963]
gggaacacgttccggcctcaggtccacctgctgccgccgccgtcggaggagctggccctcaacgagctggtgacgctgacgtgcctggtgcggggattcagccccaaggaggtgctggtgcgttggctgcagggcaatcaagagctgccccgcgagaagtatctgacctggggccccctgcccgaggctggccagagcgtcaccaccttcgccgtgaccagcgtgctacgcgtggacgccgaggtctggaagcagggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgcccctggccttcacccagaagaccatcgaccgcctggcgggtaaacccacccacgtgaacgtgtccgtggtcatgtcagaggtggatggggtctgctac
[0964]
seq id no.187
[0965]
》igha*01|家牛_荷斯坦牛|f|m|
[0966]
gaacatcagccctggctggtgctggacctgatgcagagcagccccgaggaggacagcccagaggccagcctgtggcccacgaccgtcaccctgctcaccctcttcctgctgagcctcttctacagcacagcactgactgtgacgagcatccggaccacgccggacagccgggaggtcccccagtac
[0967]
ighd(p)
[0968]
seq id no.188
[0969]
》af411244|ighd*01|家牛|p|ch1|
[0970]
aaggtgaatcacacctgagagtcttccccctggtgtcctgcgtgagctccccatccgatgagagcacggtggccctgggctgcctggcccgggacttcgtgcccaattcagtcagcttctcctggaagttcaacaacagcacagtcagcagcgagagattctggaccttccccgaagtcctgagggacggcttgtggtcggcctcctctcaggtggtcctgccctcctcaagcgcctttcaagggccggatgactacctggtgtgtgaagtccagcaccccaagggaggaaagaccgtcggaaccgtgagggtggtccccagag
[0971]
seq id no.189
[0972]
》|ighd*01|家牛|p|h1|
[0973]
catcgactccaaccccgaccactccattgccttctctgatatccgggtcagagggctccaacaaggcggtcagcacgcagagcagcccag
[0974]
seq id no.190
[0975]
》ighd*01|家牛|p|h2|
[0976]
cactgaccaccagccacagacagacagaagcccagacactggcgtgtccaaaggaaccctgcagag
[0977]
seq id no.191
[0978]
》ighd*01|家牛|p|ch2|
[0979]
agtgtcagaaccacacccaggcccccagagtccacctgctgcccccaaccccccagggcctttggctcctggacaaggccgagttcacctgcctggccacgggggaggccccgctggatgcccacttctcctgggaggtgtacgggcagccccacggcggggccttggaggagggacccaccaggcacataaacagctcctggagccagagcagccgcctggccctgcccaggtccctgtgggcctcgggctccaacgtcacctgcacactgagcagccctggcctgcagtcgccggtgaccctgacggctcagagagaacatg
[0980]
seq id no.192
[0981]
》ighd*01|家牛|p|ch3|
[0982]
ccgcctcagtgcctggcaatctgaccctccgcactgtgaccgcgcctggccccttctcccctgcctggctcctgtgcgaggtgtccggcttctcacccgtggacatcctcctcacgtggctggagagccagcaagaagtggagccttcccagtttgccacggcgcacaccacggcccaggctgggcgtgcctcatcccacacctggagtgtcctgcgtgtctccagccccctggaccacgcgggggccacctacacctgtgtggtcagccacgaggcctcccggacgctcctcaatggcagctgcagcctggacactggtg
[0983]
seq id no.193
[0984]
》ighd*01|家牛|p|m1|
[0985]
gtctggccacctggccaccggtggagcccaggacgagaagcagcgattgacggcacggatgtggaggatgccagcccactctggctcaccttcctggccctcttcctcgtcactgtggtctacggcggcttcgtcaccttcatcaag
[0986]
seq id no.194
[0987]
》ighd*01|家牛|p|m2|
[0988]
gtgaag
[0989]
ighdd1p(p)
[0990]
seq id no.195
[0991]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch1|
[0992]
aaggtgaatcgctcccgagagtcttccccttggtgtcctgcatgagctccccgtctgatgagagaatggtggccctgggctgcctggcccggatcttcatacccaattcgttcagcttctcctggaagttaaacaacagcacagtcagcagcgagagattctggaccttccccgcagtcctgagggacggcttgtggtcggcctcctctcaggtggccctgtcctcctcgagcgcctttcaagggccggatgactacctggtgtgtgaagtccagcaccccaagggaggaaagaccctcggccccgtgagggtgggccccagag
[0993]
seq id no.196
[0994]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|chs|
[0995]
ctcctgcctgtcattcacaggagctctcctgtgcgtctgagaagacctccctgacctccatggctgggccatggggcagctgggacccctggcctttacccgaacggagctcatccagggggtcctgtcatcgcatttagccgcctcaccggccccagaccactcacgcctgcattccatgtgtc
[0996]
seq id no.197
[0997]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|h1|
[0998]
catcgactccaaccccgaccactccattgccttctctgatatccgggtcagagggctccaacaaggcggtcagcacgcagagcagcccag
[0999]
seq id no.198
[1000]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|h2|
[1001]
cgccggccaccagccacagacagacagaagcccggacactggcatgtccaaaggacccctgcagag
[1002]
seq id no.199
[1003]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch2|
[1004]
agtgtcagaaccacacccaggcccccagcgtccacctactgcccccaaaacccgcagggcctctggctcctggacaaggccgagttcacctgcctggccatgggggaggccccaccggatgtccacttctcctgggaggtgaacgggcagccccacggcgcggccttggaggagggacccacctggcacatgaacggctcctggagccagagcagccgcctggccctgcccaggtccctgtgggcctcaggctccaacgtcacctgcacactgagtggccccggcctgcggtcgccggtgaccctgatggctcagagagaacatg
[1005]
seq id no.200
[1006]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch3|
[1007]
ccgcctcagtgcctggcaatctgaccctccgcactgtgaccgcgcctggccccttctcccctgcctggctcctgtgcgaggtgtccggcttctcacccgtggacatcctcctcacgtggctggagggccagcaagaagtggagccttcccagtttgccacggcacacaccacagcccaggctgggcacgcctcatcccacacctggagtgtcctgcgtgtctccagccccctggaccacgtgggggccacctacacctgtgtggtcagccacgaggcctcccggacgctcctcaatggcagctgcagcctggacactggtg
[1008]
seq id no.201
[1009]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m1|
[1010]
gtctggccacctggccgccctggagccaggatgagagcagcgacgacggcacggatgtggaggatgccagcccactctggctcaccttcctggccctcgtcctcatcactgtggtctacggcggctttgtcaccttcatcaag
[1011]
seq id no.202
[1012]
》ighdd1p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m2|344061..344066|6nt|1|||||6+0＝6|||
[1013]
gtgaag
[1014]
ighdd2p(p)
[1015]
seq id no.203
[1016]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch1|
[1017]
ttctcaagcacctttcaagggccggatgactacctggtgtgcgaagtccagcaccccaagggaggaaagaccgttggaaccgtgagggtggtccccagag
[1018]
seq id no.204
[1019]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|chs|
[1020]
ctcctgcctgtcattcacacgagctctcctgtgcgtctgagaagacctccctgactccatggctgggccatggggcagccgggacccctggcctttacccgaacggagctcatccagggggtcctgtcatcgcatttagccgcctcaccggccccagaccactcacccctgcattccatgtgtc
[1021]
seq id no.205
[1022]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|h1|
[1023]
catcgactccaaccccgaccacttcagtgccttctctgatatccgggtcagagggctccatcaaggccgtcagcacgcagagcagcccag
[1024]
seq id no.206
[1025]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch2|
[1026]
agtgtcagaaccacacccaggcccccagcgtccacctgctgcccccaaccccccagggcctctggctcctggacaaggccgagttcacctgcctggccacgggggaggccccgctggatgcccgcttctcctgggaggtgaatgggcagccccacggcggggccttggaggagggacccacctggcacatgaacagctcctggagccagagcagccgcctggccctgcccaggtccctgtgggcctcaggctccaacgtcacctgcacactgagtggcccctgcctgcggtcaccggtgaccctgatggctcagagagaacatg
[1027]
seq id no.207
[1028]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch3|
[1029]
ccgcctcagtgcccggcaatctgaccctccgcactgtgaccgcgcctggccccttctcccatgcctggctcctgtgcaaggtttccggcttctcacccgtggacatcctcctcacgtggctggagagccagcaagaagtggagccttcccagtttgccacggcgcacaccacggcccaggctgggcatgcctcatcccacacctggagtgtcctgcgtgtctccagccccctggaccacgcgggggccacctacacctgtgtggtcagccacgaggcctcccggacgctcctcaatggcagctgcagcctggacactggtg
[1030]
seq id no.208
[1031]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m1|
[1032]
gtctggccacctggccaccgtggagccaggacgagagcagcgacgacggcacggatgtggaggatgccagcccactctggctcaccttcctggccctcttcctcgtcactgtggtctacggcggcttcgtcaccttcatcaag
[1033]
seq id no.209
[1034]
》ighdd2p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m2|
[1035]
gtgaag
[1036]
ighdd3p(p)
[1037]
seq id no.210
[1038]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch1|
[1039]
ttctcaagcacctttcaagggccggatgactacctggtgtgcgaagtccagcaccccaagggaggaaagaccgttggaaccgtgagggtggtccccagag
[1040]
seq id no.211
[1041]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|chs|
[1042]
ctcctgcctgtcattcacacgagctctcctgtgcgtctgagaagacctccctgactccatggctgggccatggggcagccgggacccctggcctttacccgaacggagctcatccagggg
[1043]
gtcctgtcatcgcatttagccgcctcaccggccccagaccactcacccctgcattccatgtgtc
[1044]
seq id no.212
[1045]
》kt723ghdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|h1|4534
[1046]
catcgactccaaccccgaccacttcagtgccttctctgatatccgggtcagagggctccatcaaggccgtcagcacgcagagcagcccag
[1047]
seq id no.213
[1048]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch2|
[1049]
agtgtcagaaccacacccaggcccccagcgtccacctgctgcccccaaccccccagggcctctggctcctggacaaggccgagttcacctgcctggccacgggggaggccccgctggatgcccgcttctcctgggaggtaaatgggcagccccacggcggggccttggaggagggacccacctggcacatgaacagctcctggagccagagcagccgcctggccctgcccaggtccctgtgggcctcaggctccaacgtcacctgcacactgagtggcccctgcctgcggtcaccggtgaccctgatggctcagagagaacatg
[1050]
seq id no.214
[1051]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|ch3|
[1052]
ccgcctcagtgcccggcaatctgaccctccgcactgtgaccgtgcctggccccttctcccatgcctggctcctgtgcgaggtgtccggcttctcacccgtggacatcctcctcacgtggctggagagccagcaagaagtggagccttcccagtttgccacggcgcacaccacggcccaggctgggcgtgcctcatcccacacctggagtgtcctgcgtgtctccagccccctggaccacgcgggggccacctacacctgtgtggtcagccacgaggcctcccggacgctcctcaatggcagctgcagcctggacactggtg
[1053]
seq id no.215
[1054]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m1|
[1055]
gtctggccacctggccaccgtggagccaggacgagagcagcgacgacggcacggatgtggaggatgccagcccactctggctcaccttcctggccctcttcctcgtcactgtggtctacggcggcttcgtcaccttcatcaag
[1056]
seq id no.216
[1057]
》ighdd3p*01|家牛_荷斯坦牛|p|m2|
[1058]
gtgaag
[1059]
ighe(f)
[1060]
seq id no.217
[1061]
》ighe*02|家牛_荷斯坦牛|f|ch1|
[1062]
ncctccatccaggctccatccatctaccccttgaggctctgttgcacagaagaagcccgtgtaaggctgggctgcctggtcaaggactacttgccagggtcagtgactgtgacctgggacacagtgcccctggatggaagcacc
ctgaccttccctagcatccaaatggcgagctccagtctctacattaccaccagccagctgaccatctcgggcgagcagcccaaggagttcacctgcagagttttacacgctgagaccaactccaacttgaataagaccatcagcact
[1063]
seq id no.218
[1064]
》ighe*02|家牛_荷斯坦牛|f|ch2|
[1065]
gagtgcgccaagaacttcagcgacccctcagtgaagctcttctactcctcctgcaaccccaatggcgacacccagaccaccatccacctcctgtgccggatctccggctacaccccgggcaaaatcaaggtcacctggctggtggatgggctcaagtccgaagagctgtatgcacgatccggccctgagatacaggagggcaatctgacctccacctacagtgaagtcaacatcacacagggccagtgggtgtccgagaaaacctacacctgccgggtcaactattacggctacaacttcgaaagccacgcccacaggtgcaca
[1066]
seq id no.219
[1067]
》ighe*02|家牛_荷斯坦牛|f|ch3|
[1068]
gccgagtccgagccccgcggcgtgagcgcctacctgagcccacccacccccctcgagctgtacgtcaacaagtcacccaagatcacctgcctggttgtggacctggccaacgagaagaacttgagcctgacctggtcgagggcaaacgggaagcctgtgcacgcaggcccccctgagatcaagcgtcagttcaacgggacggtcaccgtcacgtccaccctgccggtggacgtcactgactgggtagaaggcgagacctactactgcaaagtgagccacagcgacctgcccacggacatccagcgatccatctccaaggatgtt
[1069]
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seq id no.271iglc6(p)
[1233]
》iglc6*01|家牛_海福特牛|p|c-区|
[1234]
gtcagcccaagttcacaccctcgtcactgtttccgcccacctccaaggagagccagcaccaacaaggccaacccctgtgtgtctcatcagcgacttctaccccggtagtcgtacccgggtcagaaggcagaacggcaaccatct
acccacaacgtggagaccacccggccccaaacagagcaccagcaagtaacgcggccgagcactacccacctgagcctgatggcagcgacggaaaatcgaaaggctagttacagcgcgagttcagcacgaaggggagcacgtgacgaaacatgaagcctcagagtgttcct
[1235]
seq id no.272iglc7(p)
[1236]
》iglc7*01|家牛_海福特牛|p|c-区|
[1237]
gtcagcccaagtccccaccctcgtcaccctgttcccgccctccacggaggagctcaacggcaacaaggccaccctggtgtgtctcatcagcgacttctacccgggtagcgtgaccgtggtctggaaggcagacggcagcaccatcacccgcaacgtggagaccacccgggcctccaaacagagcaacagcaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgagcagcgactggaaatcgaaaggcagttacagctgcgaggtcacgcacgaggggagcaccgtgacgaagacagtgaagccctcagagtgttct
[1238]
seq id no.273iglc8(f)
[1239]
》iglc8*01|家牛_海福特牛|f|c-区|
[1240]
ggtcagcccaagtccccaccctcggtcaccctgttcccgccctccacggaggagctcaacggcaacaaggccaccctggtgtgtctcatcagcgacttctacccgggtagcgtgaccgtggtctggaaggcagacggcagcaccatcacccgcaacgtggagaccacccgggcctccaaacagagcaacagcaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgagcagcgactggaaatcgaaaggcagttacagctgcgaggtcacgcacgaggggagcaccgtgacgaagacagtgaagccctcagagtgttct
[1241]
seq id no.274iglc9(p)
[1242]
》iglc9*01|家牛_海福特牛|p|c-区|
[1243]
gtcagcccaagtccacaccctcggtcaccctgttcccgccctccaaggaggagctcagcaccaacaaggccaccctggtgtgtctcatcagcgacttctacccgggtagcgtgaccgtggtctagaaggcagacggcagcaccatcacccacaacgtggagaccacccgggcctccaaacagagcaacagcaagtacgcggccagcagctacctgagcctgatgggcagcgactggaaatcgaaaggcagttacagctgcgaggtcacgcacgaggggagcaccgtgacgaagacagtgaagcctcagagtgttct
[1244]
表5.pcr引物
[1245]
seq id no.275 1f:acataatacactgaaatggagccc
[1246]
seq id no.276 1r:gtccttggtcaacgtgaggg
[1247]
seq id no.277 2f:cataatacactgaaatggagccct
[1248]
seq id no.278 2r:gcaacagtggtaggtcgctt
[1249]
表6.其他序列数据
[1250]
前dj
[1251]
这是ighd-5 dh基因上游的21609bp片段。前dj序列可以见于小家鼠(mus musculus)c57bl/6j品系第12号染色体，组装：grcm38.p4，注释版本106，序列id:nc_000078.6上
[1252]
整个序列位于如下所示的两个100bp序列之间：
[1253]
ighd-5 d基因区段的上游，对应于nc_000078.6中的位置113526905-113527004：
[1254]
atttctgtacctgatctatgtcaatatctgtaccatggctctagcagagatgaaatatgagacagtctgatgtcatgtggccatgcctggtccagacttg(seq id no.279)
[1255]
adam6a基因上游2kb，对应于nc_000078.6中的位置113548415
–
113548514：
[1256]
gtcaatcagcagaaatccatcatacatgagacaaagttataatcaagaaatgttgcccataggaaacagaggatatctctagcactcagagactgagcac(seq id no.280)
[1257]
adam6a
[1258]
adam6a(解整联蛋白和金属肽酶结构域6a)是参与雄性生育力的基因。adam6a序列可以见于小家鼠c57bl/6j品系第12条染色体，组装：grcm38.p4，注释版本106，序列id：nc_000078.6上，处于位置113543908-113546414处。
[1259]
adam6a序列id:ottmusg00000051592(vega)
[1260]
表7.嵌合牛科动物/小鼠ig基因序列。
[1261]
igk版本a
[1262]
小鼠igkv 1-133上游的序列(seq id no.281)
[1263]
gcattgaataaaccagtataaacaagcaagcaaagatagatagatagatagatagatagatagatagatacatagatagatagatagatagatagatgatagatagatagatagatagatagatttttacgtataatacaataaaaacattcattgtccctctattggtgactactcaaggaaaaaaatgttcatatgcaagaaaaaatgttatcattaccagatgatccagcaatctagcaatatatatattgtttattcacaaaacatgaatgaaccttttaagaagctgttacagtgtaaaaattaagttaaatcactgaagaacatatactgtgtgatttcattcaaatgaaatttgagaagtaaatatatatgtatatatatatatatgtaaaaaatataagtctgaactacaaaaattcaatttgtttgatatgtaagaataagaaaaattgacccccaaaatttgttaataattaggtatgtgtatttttatgaatatataagtataataatgcttatagtatacactattctgaatcacatttattccctaagtgtgttcccttgattataattaaaagtatattttttaaatacagagtcagagtacagtcaataaggcgaaaatatagttgaatgatttgcttcagcttttgtaatgtactagagattgtgagtacaaagtctcagagctcattttatccctgacaataaccagctctgtgcttcaagtacatttccatctttctctgaaatttagtcttatatagatagacaaaatttaagtaaatttcaaactacacagaacaactaagttgttgtttcatattgataatggatttgaactgcattaacagaactttaacatcctgcttattctcccttcagccatcatattttgctttattattttcactttttgagttatttttcacattcagaaagctcacataattgtcacttctttgtatactggtatacagaccagaacatttgcatattgttccctggggaggtctttgccctgttggcctgagataaaacctcaagtgtcctcttgcctccactgatcactctcctatgtttatttcctcaaa
[1264]
来自loc100294952的奶牛外显子1(前导)(seq id no.282)
[1265]
atgagattctctgctcagctcctggggctcctcctgctctgggtcccag
[1266]
来自loc100294952的奶牛内含子1(seq id no.283)
[1267]
gtaagtacagagagggatgagaaggaggatgggggtgagttctggggcagcactgctctccacatgtgttctctgttagatgtgtatgacttgtcctgcagatgagcatgggaaccttagatcaatgatagtgaggaatgttccagaaggaagaaggtcctgtgctctggtcaggactgtgacaggggaagtggggatgatgtaggggatgtttagaggtctctttatacttcacagatatcaagttcattattgtgattgtacaattttgctgtatgatcacagacaatgtgagtaatacaaagtagtattaatgttttagctaaaataaatcagaaaatggaaacaataaaaatggttgctaatatttgtagctttctaattctctgtcattcctttag
[1268]
来自loc100294952的奶牛v
κ
(seq id no.284)
[1269]
gatccagtggggatgttgtgctgacccagactccactctccctgtctatcatccctggagagatggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctggtacacagtgatggaaaaacctatttgaattggattcaatataaaccaggccaatcaccacagggtctgatctatcaggtttccaaccgttactctggggtctcagacaggttcactggcagtgggtcagggacagatttcacacttacaatcagcagagtgcaggctgaggatgctggagtctattactgttaccaa
ggtacagaagat
[1270]
小鼠rss七聚体(seq id no.285)
[1271]
cacagtg
[1272]
小鼠rss七聚体下游序列(seq id no.286)
[1273]
atacagactctatcaaaaacttccttgcctggggcagcccagctgacaatgtgcaatctgaagaggagcagagagcatcttgtgtctgtgtgagaaggaggggctgggatacatgagtaattctttgcagctgtgagctctg
[1274]
igk形式b
[1275]
小鼠igkv 1-133上游的序列(seq id no.287)
[1276]
gcattgaataaaccagtataaacaagcaagcaaagatagatagatagatagatagatagatagatagatacatagatagatagatagatagatagatgatagatagatagatagatagatagatttttacgtataatacaataaaaacattcattgtccctctattggtgactactcaaggaaaaaaatgttcatatgcaagaaaaaatgttatcattaccagatgatccagcaatctagcaatatatatattgtttattcacaaaacatgaatgaaccttttaagaagctgttacagtgtaaaaattaagttaaatcactgaagaacatatactgtgtgatttcattcaaatgaaatttgagaagtaaatatatatgtatatatatatatatgtaaaaaatataagtctgaactacaaaaattcaatttgtttgatatgtaagaataagaaaaattgacccccaaaatttgttaataattaggtatgtgtatttttatgaatatataagtataataatgcttatagtatacactattctgaatcacatttattccctaagtgtgttcccttgattataattaaaagtatattttttaaatacagagtcagagtacagtcaataaggcgaaaatatagttgaatgatttgcttcagcttttgtaatgtactagagattgtgagtacaaagtctcagagctcattttatccctgacaataaccagctctgtgcttcaagtacatttccatctttctctgaaatttagtcttatatagatagacaaaatttaagtaaatttcaaactacacagaacaactaagttgttgtttcatattgataatggatttgaactgcattaacagaactttaacatcctgcttattctcccttcagccatcatattttgctttattattttcactttttgagttatttttcacattcagaaagctcacataattgtcacttctttgtatactggtatacagaccagaacatttgcatattgttccctggggaggtctttgccctgttggcctgagataaaacctcaagtgtcctcttgcctccactgatcactctcctatgtttatttcctcaaa
[1277]
小鼠igkv 1-133外显子1(前导)(seq id no.288)
[1278]
atgatgagtcctgcccagttcctgtttctgttagtgctctggattcagg
[1279]
小鼠igkv 1-133内含子1(seq id no.289)
[1280]
gtaaggagttttggaatgtgagggatgagaatggggatggagggtgatctctggatgcctatgtgtgctgtttatttgtggtggggcaggtcatatcttccagaatgtgaggttttgttacatcctaatgagatattccacatggaacagtatctgtactaagatcagtattctgacatagattggatggagtggtatagactccatctataatggatgatgtttagaaacttcaacacttgttttatgacaaagcatttgatatataatatttttaaatctgaaaaactgctaggatcttacttgaaaggaatagcataaaagatttcacaaaggttgctcaggatctttgcacatgattttccactattgtattgtaatttcag
[1281]
小鼠igkv 1-133外显子2(前导)的5’部分(seq id no.290)
[1282]
aaaccaacggt
[1283]
来自loc100294952的奶牛vκ(seq id no.291):
[1284]
gatccagtggggatgttgtgctgacccagactccactctccctgtctatcatccctggagagatggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctggtacacagtgatggaaaaacctatttgaattggattcaatataaaccaggccaatcaccacagggtctgatctatcaggtttccaaccgttactctggggtctcagacaggttcactggcagtgggtcagggacagatttcacacttacaatcagcagagtgcaggctgaggatgctggagtctattactgttaccaa
ggtacagaagat
[1285]
小鼠rss七聚体(seq id no.292)
[1286]
cacagtg
[1287]
小鼠rss七聚体下游序列(seq id no.293)
[1288]
atacagactctatcaaaaacttccttgcctggggcagcccagctgacaatgtgcaatctgaagaggagcagagagcatcttgtgtctgtgtgagaaggaggggctgggatacatgagtaattctttgcagctgtgagctctg。