干细胞用冷藏保存液的制作方法

1.本发明涉及一种用于以非冷冻状态保存细胞、组织、类器官、脏器等的保存液。特别涉及一种用于以比室温低的温度，例如2～15℃、2～8℃或2～6℃进行保存的冷藏保存液。另外，特别是涉及一种用于使人ips细胞等多能干细胞(pluripotent cells)以及其他干细胞(stemcells)、或由其得到的类器官等的衍生物、初期胚(初期胚胎)等悬浮或浸渍而进行保存的冷藏保存液。


背景技术：

2.简便、高效且稳定地保存/供给ips、es细胞等干细胞是再生医疗的基础研究和临床应用研究或药物开发研究领域中不可或缺的重要技术。人的ips细胞和es细胞的冷冻保存具有以下诸多问题：若为缓慢冷冻保存法，则保存后的生存率较低，或者作为用于冷冻保存的耐冻材料的dmso具有细胞毒性、分化诱导性等。细胞的非冷冻低温保存作为从短期(例如一天～两周)到中期(例如半个月～三个月)的保存法，是非常有魅力的技术，不仅如此，在考虑到分化诱导的细胞的保存、类器官的保存等再生医疗技术的产业化或在药物开发中的应用的情况下，其优点很大。但是，使用作为脏器的低温保存液而被广泛使用的uw液(uw_sln；belzeruw(注册商标)coldstorage solution)，对含有人的ips细胞的多能干细胞等进行低温保存是很困难的，需要开发新的冷藏保存技术。
3.在肝脏、肾脏等移植中使用的脏器的冷藏保存中，广泛了使用uw液，其成为实质上的黄金标准(最佳基准)。在20世纪80年代(1980年代)开发的uw溶液是一种由细胞内型的低na离子和高k离子的盐类组成构成的溶液，其中包括乳糖酸(lactobionate)、棉子糖(raffinose)、谷胱甘肽(glutathion)、羟乙基淀粉(hydroxy-ethylstarch)等的相对简单的组成。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：pct/jp2009/002941(jp5726525b)
7.专利文献2：jp6220108b(jp2012-217342a)
8.专利文献3：wo2016/076317a
9.非专利文献
10.非专利文献1：compare belzer uwtm cold storage solution to viaspan https://bridgetolife.com/compare-belzer-uw-cold-storage-solution-to-viaspan/
11.非专利文献2：a novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells,scientific reports 4:3594doi:10.1038/srep03594
12.非专利文献3：cryopreservation and hypothermal storage of hematopoietic stem cellshttps://etd.ohiolink.edu/！etd.send_file？accession＝ucin1439307244&disposition＝inline
13.但是，在冷藏保存细胞等的情况下，uw液不能够充分抑制低温保存应力。本发明的发明人为了解决该问题，建立了以下的假说：采用介于以uw液为代表的细胞内型盐类组成，和在通常使用的培养基中常见的具有的高na离子低k离子浓度的细胞外型盐类组成之间的中间型的盐类组成是很重要的。另外，考虑到与脏器保存相比蛋白质等高分子的添加是很重要的，进行了uw液与细胞培养液的中间型的保存液的开发。
14.关于细胞的低温保存用的培养基的报告(报道)几乎没有。仅有少数利用近年开发的htsfrs(hypothermosol(注册商标)frs；biolifesolutions)的保存报告。存在该htsfrs可以低温保存人皮肤成纤维细胞或平滑肌细胞3～5天的报告，但没有关于人ips细胞等多能细胞的冷藏保存的报告。


技术实现要素：

15.本发明的发明人在尝试多种多样的组合的过程中，尝试了将mem-alpha(minimumessential medium eagle(mem)alphamodification)或stemfit(注册商标)ak02n(味之素(株))与上述uw液或es细胞用培养液(后述的以dmem：f12培养基为基础进行修改而得到液体；以下，适当地称为“escmedium”。)以约1/1～1/2的比率混合而成的液体。mem-alpha是以mem培养基为基础，含有非必需氨基酸、丙酮酸钠、硫辛酸、生物素和维生素b12的液体。
16.此外，在mem(eagle'sminimal essential medium)培养基中含有以下的成分(1)～(4)。
17.(1)氨基酸(l-精氨酸、l-胱氨酸、l-谷氨酰胺、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-苯丙氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸)；
18.(2)盐(氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠)；
19.(3)d-葡萄糖；以及
20.(4)维生素(叶酸、尼克酰胺(烟酰胺))、核黄素、b12、胆碱、肌醇、泛酸、磷酸吡哆醛、硫胺素)。
21.另一方面，uw液是细胞内液型组成的不含ca
2+
的液体，配合有：用于调整渗透压和抑制细胞膨胀的乳糖酸、羟乙基淀粉(hydroxy-ethylstarch；hes)、作为抗炎症、血管松弛和atp的前驱物质的腺苷、用于抗氧化的谷胱甘肽和别嘌醇(别嘌呤醇)、以及作为缓冲成分的磷酸盐缓冲液。
22.stemfit(注册商标)ak02n是人ips细胞用无饲养培养基(feederless culture medium)，由400ml的a液、100ml的b液以及2ml的c液构成，在临用前混合使用，但在该混合时，也混合有上述uw液或es细胞用培养液。此外，c液是将碱性成纤维细胞生长因子(bfgf；basicfibroblast growth factor)溶解于生理缓冲液中而得到的液体。
23.此外，在与mem-alpha进行比较时，stemfit(注册商标)ak02n可以说盐类组成相同，必需氨基酸组成大致相同，另外，非必需氨基酸组成大部分相同。如后述的实验结果所示的那样，在本技术发明的冷藏用保存液中，能够大致相同地使用mem-alpha和stemfit(注册商标)ak02n。认为这些共同部分，即盐类组成、必需氨基酸组成以及非必需氨基酸组成的主要部分在发挥本技术发明的作用效果上是很重要的。另一方面，mem-alpha与stemfit(注册商标)ak02n的主要的不同点在于，蛋白质和生长因子均仅包含在stemfit(注册商标)
ak02n中。推测这些成分在本技术发明的冷藏用保存液中不是必须的，或者几乎没有贡献。此外，相对于stemfit(注册商标)ak02n是用于ips细胞的培养液，mem-alpha即使添加有作为代表性的生长因子的bfgf，也不能够培养ips细胞。另外，对于es细胞用培养液(“escmedium”)来说也是相同地，如果没有饲养细胞，就不能够培养ips细胞。
24.另外，此处的形成es细胞用培养液(“escmedium”)的基础的dmem：f12培养基是将mem(eagle'sminimal essential medium)培养基和ham'sf12培养基以1/1的体积比混合而得到的培养基。ham'sf12培养基是含有腐胺(putrescine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)以及胸苷(thymidine)的无血清的基础培养基(basalmedia)。
25.基于本发明的优选的一个实施方式的冷藏用保存液具有下述a1～a6或a1～a9的特征。
26.a1.钾离子种的含量为20～90mmol/l或30～80mmol/l，钠离子种的含量为20～90mmol/l或30～80mmol/l。
27.a2.钠离子种的量相对于钾离子种的量的基于离子的摩尔比(na
+
/k
+
的比)为0.5～1.5、0.5～1.3或0.6～1.2。
28.a3.以0.5～10mm、1～8mm或2～7mm的浓度含有trolox或其类似物。
29.a4.以0.1～4.2mm、0.1～6mm、1～6mm、2～5mm或3～5mm的浓度含有腺嘌呤或其盐或衍生物。
30.a5.含有全部的必需氨基酸，或含有除了1种、2种或3种以外全部的必需氨基酸，必需氨基酸的总含量优选为50～250mg/l，特别优选为50～200mg/l或80～150mg/l。
31.a6.非必需氨基酸的总含量优选为100～500mg/l，特别优选为50～200mg/l或80～150mg/l。
32.a7.镁离子种(特别是硫酸镁)的含量为2～8mmol/l、2～5mmol/l或2～4mmol/l，钙的含量为0.2～1.5mmol/l、0.2～1mmol/l或0.3～0.8mmol/l。
33.a8.以0.5～10mmol/l的浓度含有葡萄糖或其他低分子多糖类(特别是麦芽糖等二糖类，或果糖等单糖类)。
34.a9.含有下述的维生素。但是，能够省略下述中的1种、2种、3种或4种。
35.叶酸、尼克酰胺(烟酰胺))、核黄素、b12、胆碱、肌醇、泛酸、磷酸吡哆醛、以及硫胺素。
36.基于本发明的优选的一个实施方式的冷藏用保存液，是含有：
37.(i)以内酯换算，30～100mmol/l(或10～40g/l)的乳糖酸或其盐(lactobionicacid or lactobionate)；(ii)10～30mmol/l(或5～20g/l)的棉子糖水合物；(iii)0.3～1mmol/l(或0.05～0.1g/l)的别嘌醇；(iv)1～3mmol/l的谷胱甘肽(总谷胱甘肽)；(v)2～10mmol/l(或0.3～0.9g/l)的腺苷；以及(vi)0.05～1μmol/l(或0.03～0.2mg/l)的硫辛酸；(vii)0.1～1mmol/l(或10～100mg/l)的丙酮酸钠；(viii)0.5～10mmol/l(或100～1000mg/l)的葡萄糖；(ix)0.03～0.3mmol/l的抗坏血酸、以及1～10mm的维生素e或其水溶性类似物/衍生物；(x)0.1～4.2mm的腺嘌呤或其盐或衍生物；(xi)其他维生素或其水溶性类似物/衍生物；(xii)总计50～200mg/l的必需氨基酸；(xiii)总计100～500mg/l的非必需氨基酸；(xiv)30～80mmol/l的钾离子种；(xv)20～90mmol/l的钠离子种的生理缓冲溶液，并且ph被设定为7～7.5。
38.该冷藏用保存液优选含有(xv)20～50g/l的羟乙基淀粉。另外，优选含有(xvi)4～40mg/l的核糖核苷和/或(xvii)4～40mg/l的脱氧核糖核苷。另外，优选含有(xviii)10～25mmol/l的磷酸二氢钾(potassiumdihydrogen phosphate)和磷酸二氢钠(sodiumdihydrogen phosphate)。
39.发明效果
40.在冷藏保存人ips细胞等多能细胞时，能够维持高生存率维持效果和再培养后的增殖能力。
附图说明
41.图1a是表示以单细胞状态在4℃下保存时的、将保存开始时的生存率设为1.0时的基于保存天数的相对生存率(relativeviability)的变化的图。此外，在图1～7f的实验中，使用将uw液和临床研究用培养基stemfit(注册商标)ak02n以2/1的比例混合而得到的冷藏保存培养基(“htm1”)。
42.图1b是表示从图1a的图求出50％生存率维持天数(st50)的结果的柱状图。
43.图2a是与图1a相同地表示以单细胞状态在4℃下保存时的、基于保存天数的生存率的变化的图。其中，与图1a相同，使保存开始时的生存率为1.0。
44.图2b是表示从图2a的图求出的80％生存率维持天数(st80)的结果的柱状图。
45.图2c是表示冷藏保存6天后，培养5天的集落形成能力的柱状图。
46.图3a是表示进行3天冷藏保存后立即发生的由细胞凋亡引起的细胞死亡的比率的柱状图。
47.图3b是与图3a相同地表示进行3天的冷藏保存后立即发生的由坏死引起的细胞死亡的比率的柱状图。
48.图4a是与图3a～3b相同地表示进行3天的冷藏保存后立即发生的细胞内活性氧种(ros)的浓度变化的柱状图。
49.图4b是与图3a～3b和图4a相同地表示进行3天冷藏保存后立即成为凋亡的指标的细胞内caspase3/7(半胱天冬酶3/7)的活性的变化的柱状图。
50.图5a总结表示实验中使用的自由基清除剂的化学式。
51.图5b是表示添加图5a所示的各种自由基清除剂时的、与图2b相同的80％生存率维持天数(st80)的柱状图。
52.图6a是表示使作为自由基清除剂的trolox的添加浓度变化时的与图2a相同的、基于保存天数的生存率的变化的图。
53.图6b是表示从图6a的图求出的80％生存率维持天数(st80)的结果的柱状图。
54.图6c是表示改变trolox的添加浓度的各培养基中的冷藏保存6天后再培养5天时的集落形成能力的结果的柱状图。
55.图6d是表示添加生育酚以及生育酚乙酸酯对保存6天、恢复培养1天后的相对生存率的影响的柱状图。
56.图7a是表示冷藏保存3天后再培养4天得到的集落的相位差图像。
57.图7b是将图7a的图像进行二值化而得到的图。
58.图7c是表示冷藏保存6天后再培养4天得到的集落的相位差图像。
59.图7d是将图7b的图像进行二值化而得到的图。
60.图7e是总结表示在冷藏保存3天以及6天后再培养4天的培养基中的集落的面积比率的柱状图。
61.图7f是以将不冷藏(非冷藏)保存而培养4天的非保存对照组设为1的比率表示在冷藏保存3天以及6天后再培养4天时的集落数的增加率的柱状图。
62.图8是表示图7f的结果、也包含不添加trolox等以及在5mm的trolox中使腺嘌呤为1.4～8.2mm的结果的柱状图。
63.图9是表示作为冷藏保存培养基，使用将uw液和mem-alpha以2/1的比例混合得到的冷藏保存培养基“htm-alpha”(uw液+mem-alpha，2：1)，冷藏保存7天后再培养4天时的集落数的增加率的、与图7f和图8相同的柱状图。此处，在“htm-alpha”和“htm1”中添加5mm的trolox和5倍浓度(x5；10mm)的glutamax(注册商标，gibco)。另外，也一并表示使用作为市售的冷藏保存培养基的htsfrs的结果。
64.图10是表示将小鼠的胚泡期胚(胚泡期胚胎)(体外受精后3.5天)在与图9相同的培养基中冷藏保存3天后，在两天的培养期间中从透明带逃逸的比率的柱状图。
65.图11是表示在与图10的实验相同的条件下，对腺嘌呤盐酸盐的添加浓度的影响进行研究的结果的、与图10相同的柱状图。
66.图12a是表示在与图6a的实验相同的条件下，使用聚乙烯醇(pva)代替羟乙基淀粉(hes)的情况下的保护效果的柱状图。
67.图12b是表示在与图12a实验相同的条件下，除了聚乙烯醇(pva)之外进一步添加甘露醇(mannitol)的效果的、与图12a相同的柱状图。
具体实施方式
68.基于本发明的优选的实施方式的冷藏用保存液是含有下述(i)～(vi)的生理缓冲液，ph被设定为7～7.5。
69.(i)以内酯换算，20～100mmol/l、30～100mmol/l、30～80mmol/l或30～60mmol/l、或者10～50g/l、10～40g/l、15～35g/l或20～30g/l的乳糖酸或其盐(lactobionicacid or lactobionate)。
70.(ii)10～40mmol/l、10～30mmol/l或10～20mmol/l、或5～20g/l或8～15g/l的棉子糖水合物。
71.(iii)0.3～2mmol/l、0.3～1mmol/l或0.4～0.8mmol/l、或0.03～0.15g/l、0.05～0.1g/l或0.06～0.08g/l的别嘌醇。
72.(iv)1～3mmol/l或1.5～2.5mmol/l、或0.3～1g/l、0.4～0.9g/l或0.4～0.8g/l的谷胱甘肽(总谷胱甘肽)。
73.(v)2～10mmol/l、2～8mmol/l或2～5mmol/l、或0.5～1.5g/l或0.5～1.3g/l的腺苷。
74.(vi)0.05～1μmol/l、0.1～0.5μmol/l或0.2～0.4μmol/l、或0.03～0.2mg/l或0.05～0.1mg/l的硫辛酸。
75.(vii)0.1～1mmol/l、0.1～0.7mmol/l或0.2～0.5mmol/l、或10～100mg/l或20～50mg/l的丙酮酸钠。
76.(viii)0.5～10mol/l、1～5mol/l或1～3mol/l、或100～1000mg/l或200～500mg/l的葡萄糖。
77.(ix)下述的抗氧化性的维生素、或其水溶性类似物/衍生物
78.(均可以采取盐的方式。根据情况，可以省略下述两种中的ix-1。)
79.ix-1.0.03～0.3mmol/l，0.05～0.2mmol/l或0.05～0.15mmol/l、或5～20mg/l或10～15mg/l的抗坏血酸。
80.ix-2.0.5～10mm、1～8mm或2～7mm的维生素e、trolox或其他水溶性维生素e类似物/衍生物。
81.(x)0.1～6mm、0.1～5mm、0.1～4.5mm、0.1～4.2mm或2～5mm腺嘌呤或其盐或衍生物。根据情况，为0.1～0.3mm或0.05～0.2mm。
82.(xi)上述其他维生素或其水溶性类似物/衍生物
83.(均可以采取盐的方式。另外，可以省略下述10种中的1～5种、1～4种或1～3种。)
84.xi-1.0.03～0.25μmol/l、0.05～0.2μmol/l或0.1～0.15μmol/l、或0.01～0.1mg/l或0.02～0.05mg/l的生物素。
85.xi-2.0.03～3μmol/l、0.05～2μmol/l或0.1～0.5μmol/l、或0.1～0.8mg/l或0.2～0.6mg/l的维生素b12。
86.xi-3.0.2～2μmol/l、0.3～1μmol/l或0.5～0.9μmol/l、或0.1～1mg/l或0.2～0.5mg/l的叶酸。
87.xi-4.0.5～8μmol/l、1～6μmol/l或1～4μmol/l、或0.03～0.2mg/l或0.05～0.1mg/l的烟酰胺。
88.xi-5.0.03～0.3μmol/l、0.04～0.2μmol/l或0.05～0.15μmol/l、或0.03～0.2mg/l或0.05～0.1mg/l的核黄素。
89.xi-6.0.05～1μmol/l、0.1～0.5μmol/l或0.1～0.4μmol/l、或0.1～1mg/l或0.2～0.5mg/l的胆碱。
90.xi-7.1～10μmol/l、1～8μmol/l或2～6μmol/l、或0.03～0.2mg/l或0.05～0.1mg/l的肌醇。
91.xi-8.0.02～0.2μmol/l、0.03～0.1μmol/l或0.04～0.08μmol/l、或0.1～1mg/l或0.2～0.5mg/l的泛酸。
92.xi-9.0.5～3μmol/l、0.1～2μmol/l或1～2μmol/l、或0.1～1mg/l或0.2～0.5mg/l的吡哆醛。
93.xi-10.0.3～3μmol/l、0.4～2μmol/l或0.5～1.5μmol/l、或0.1～1mg/l或0.2～0.5mg/l的硫胺素。
94.(xii)必需氨基酸总计为50～200mg/l或80～150mg/l。
95.在将表2中记载的含量除以3所得的值(下述实施例中的“htm-alpha”中的值)设为a时，各成分的量能够在a/3～3a的范围(即“htm-alpha”中的值的3分之1～3倍的值的范围)或a/2～2a的范围内适当地进行设定。对于后述的非必需氨基酸、上述维生素也是相同的。
96.xii-1.异亮氨酸
97.xii-2.亮氨酸
98.xii-3.赖氨酸
99.xii-4.蛋氨酸(甲硫氨酸)
100.xii-5.苯丙氨酸
101.xii-6.苏氨酸
102.xii-7.色氨酸
103.xii-8.缬氨酸
104.xii-9.组氨酸
105.(xiii)非必需氨基酸总计为100～500mg/l或150～400mg/l。
106.(均可以采取盐的方式。另外，可以省略下述10种中的1～5种、1～4种或1～3种。)
107.xiii-1.甘氨酸
108.xiii-2.丙氨酸
109.xiii-3.精氨酸
110.xiii-4.天冬酰胺
111.xiii-5.天冬氨酸
112.xiii-6.半胱氨酸
113.xiii-7.胱氨酸
114.xiii-8.谷氨酸
115.xiii-9.谷氨酰胺
116.xiii-10.脯氨酸
117.(xiv)20～90mmol/l、30～80mmol/l、40～80mmol/l或50～70mmol/l的钾离子种。即，为20mmol/l以上、30mmol/l以上、40mmol/l以上、或50mmol/l以上，且不足90mmol/l、不足80mmol/l、或不足70mmol/l。
118.(xv)20～90mmol/l、30～80mmol/l、40～80mmol/l或50～70mmol/l的钠离子种。即，为20mmol/l以上、30mmol/l以上、40mmol/l以上、或50mmol/l以上，且不足90mmol/l、不足80mmol/l、或不足70mmol/l。
119.该冷藏用保存液优选含有下述(xvi)～(xviii)中的至少一种。特别优选含有下述(xvi)～(xvii)和下述(xviii)。
120.(xvi)10～80g/l、20～50g/l或20～40g/l的羟乙基淀粉。
121.(xvii)3～100g/l、5～80g/l、5～50g/l、5～30g/l、5～25g/l或5～20g/l的聚乙烯醇。
122.(xviii)20～100mmol/l、30～90mmol/l或20～90mmol/l的甘露醇。
123.该冷藏用保存液优选含有下述(xix)和(xx)中的至少一种。
124.(xix)2～4种总计为4～40mg/l、5～30mg/l或10～15mg/l的核糖核苷。
125.(xx)2～4种总计为4～40mg/l、5～30mg/l或10～15mg/l的脱氧核糖核苷。
126.该冷藏用保存液优选含有下述(xxi)～(xxiii)。
127.(xxi)10～30mmol/l、10～25mmol/l或15～25mmol/l的磷酸二氢钾(potassiumdihydrogen phosphate)或磷酸二氢钠(sodiumdihydrogen phosphate)。
128.(xxii)2～8mmol/l、2～5mmol/l或2～4mmol/l的镁离子种(特别是硫酸镁)。
129.(xxiii)0.2～1.5mmol/l、0.2～1mmol/l或0.3～0.8mmol/l的钙离子种(特别是氯化镁)。
130.另外，在本发明的优选的一个实施方式中，钠离子种以摩尔比(na/k的离子的比)计可以为例如钾离子种的0.7～1.3倍、0.8～1.2倍或0.9～1.1倍。另外，在其他优选的一个实施方式中，钠离子种以摩尔比计可以为例如钾离子种的0.5～1.5倍、0.5～1.3倍或0.6～1.2倍。
131.如上所述，基于本发明的优选的实施方式的冷藏保存液以0.1mm以上、0.3mm以上、0.5mm以上、1mm以上、2mm以上、3mm以上、4mm以上或5mm以上，且10mm以下、8mm以下或6mm以下的浓度含有trolox或其他水溶性维生素类似物。
132.如上所述，基于本发明的优选的实施方式的冷藏保存液特别是以0.1mm以上、0.3mm以上、0.5mm以上、1mm以上、2mm以上、3mm以上，且8mm以下、6mm以下、5mm以下或4mm以下的浓度，例如0.1～4.2mm或1～4.2mm的浓度含有腺嘌呤或其盐。特别是，认为在保存细胞之间粘接而形成三维的块的胚胎、类器官时，腺嘌呤的添加示出了显著的效果。另外，在保存胚胎、类器官时，即使是比较低的浓度，例如0.01～0.2mm(10～200μm)或0.05～0.3mm(5～300μm)也能够观察到效果(图11)。另一方面，在不形成胚胎、类器官的状态下培养ips细胞等干细胞时，认为以例如0.5～6mm，特别是1～5mm或2～4mm的浓度添加腺嘌呤是特别有效的(图7a～图8)。
133.基于本发明的优选的实施方式的冷藏保存液进一步地以1～6mm、2～5mm或3～5mm的浓度含有l-丙氨酰-l-谷氨酰胺或其他二肽替代品或其盐。
134.基于本发明的优选的一个实施方式的冷藏保存液是将表1所示组成的uw液与表2所示组成的memalpha培养基以使uw液为memalpha培养基的1～3倍、优选为1.5～2.5倍、更优选为1.8～2.2倍的体积比进行混合而而得到的冷藏保存液。此外，对于由表1以及表2的组成以及由该混合比率得到的各成分的含量，可以在
±
50％的范围内、
±
40％的范围内、
±
30％的范围内或
±
20％的范围内适当增减。另外，在几个成分，特别是表2所列举的成分中，可以省略非必需氨基酸中的一部分(例如1～5种)、核糖核苷中的一部分(例如1～5种)、维生素的一部分(例如1～5种)、无机盐的一部分(例如1～3种)以及酚红。
135.基于本发明的优选的一个实施方式的冷藏保存方法，在上述任一冷藏保存液中，使多能细胞(pluripotentcells)成为1
×
103个/ml～1
×
109个/ml或1
×
104个/ml～1
×
108个/ml的方式分散成单细胞状态，进行例如1～10天或1～7天的冷藏保存。
136.基于本发明的优选的一个实施方式的冷藏保存方法，在装有上述任一冷藏保存液的培养容器中，将多能细胞(pluripotentcells)成为1
×
103个/cm2～1
×
109个/cm2或1
×
104个/cm2～1
×
108个/cm2的方式进行接种并在培养例如2～6天后，进行例如1～10天或1～7天的冷藏保存。
137.根据本发明的优选实施方式，作为冷藏保存对象的多能细胞或干细胞例如是es细胞、或ips细胞等人工多能干细胞这样的万能细胞，或者造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞、皮肤干细胞、生殖干细胞等。另外，作为冷藏保存对象的多能细胞可以来源于人，或者来源于灵长类、小鼠、豚鼠等哺乳类。
138.另外，根据其他实施方式，冷藏保存的对象可以是人或动物的胚胎，特别是牛、马、猪、山羊等家畜动物的胚胎。
139.实施例
140.1.冷藏保存实验用的细胞的准备
141.在无饲养条件下对从京都大学ips细胞研究获得的来源于健康人的人ips细胞株(253g1)进行维持培养。在该培养中，使用作为市售的临床研究用(人es/ips细胞用)培养基的stemfit(注册商标)ak02n(ajinomoto)，在培养开始第7天达到70～80％汇集(confluence)的时间点，用酶(使用0.5xtryple(注册商标)select)进行剥离，分散并洗涤。然后，悬浮在含有作为rock抑制剂的10μm的y27362(富士胶片和光纯药)的新的stemfit(注册商标)ak02n培养基中，再以使其浓度成为0.1μg/cm2的方式添加作为细胞培养底物的imatrix-511(matrixome,inc.)，以1.3e3/cm2(1.3
×
103/cm2)的浓度进行接种。在接种的第二天，更换为不含y27362的stemfit(注册商标)ak02n培养基，然后每隔3天更换培养基，在第7天用于继代或实验。
142.此外，在使用下述htm-alpha作为冷藏保存培养基的实验(图9)的情况下，使用与用于该htm-alph中的相同的mem-alpha培养基来代替stemfit(注册商标)ak02n，准备冷藏保存实验用的细胞。
143.另一方面，为了尝试小鼠胚胎的冷藏保存(图10～11)，在雌和雄的小鼠(均为icr)进行体外受精后，进行3.5天(84小时)的培养。此时，在受精用培养基中使用htf(富士胶片和光纯药)，在培养中使用ksom(arc resourc)。
144.此外，在本技术中，只要没有特别说明，则培养在37℃培养箱(5％co2)中进行。
145.2.冷藏保存液
146.准备下述3种冷藏保存液。为了方便，分别称为htm1、htm2和htm-alpha。
147.·
htm1：uw液+上述临床研究用培养基stemfit(注册商标)ak02n，混合体积比：2/1。
148.·
htm2：uw液+下述人es细胞培养液(“escmedium”)，混合体积比：2/1。
149.·
htm-alpha：uw液+mem-alpha(12571-memalpha，nucleosides，thermofisher scientific)，混合体积比：2/1。以成为5mm的方式添加trolox，并且以成为5倍浓度(x5；10mm)的方式添加glutamax(注册商标，gibco)而加以使用。
150.此外，使用下述3种冷藏保存液中的任一种作为比较例的冷藏保存液。
151.·
uw液(belzeruw(注册商标)coldstorage solution)
152.·
上述stemfit(注册商标)ak02n
153.·
htsfrs(hypothermosol(注册商标)frs，biolifesolutions)
154.人es细胞培养液(“esc medium”)是在dmem-f12(invitrogen21331-020)中添加下述物质而得到的。在下述中的％和mm表示相对于最终得到的人es细胞培养液的重量比率或摩尔浓度。
155.·
1％的非必需氨基酸(non-essentialamino acid(x100)，invitrogen11140)，
156.·
1％的200mm的l-谷氨酰胺(l-glutamine(x100)，invitrogen25030)，
157.·
20％的stemsure(注册商标)serumreplacement(ssr)(富士胶片和光纯药)，
158.·
0.1mm的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol(x1000；添加时的浓度)，
159.·
青霉素和链霉素(penicillin/streptomysin)。
160.uw液(belzeruw(注册商标)coldstorage solution)的组成根据上述非专利文献1，如下述表所示。
161.【表1】uw液的组成
[0162][0163]
具体而言，在“htm-alpha”中使用的memalpha培养基(12571-memalpha，nucleosides，thermofisher scientific)具有下述组成(https://www.thermofisher.com/jp/en/home/technical-resources/media-formulati on.94.html)。
[0164]
【表2】memalpha培养基的组成
[0165]
[0166]
[0167][0168]
添加到“htm-alpha”中的glutamax(注册商标，gibco)是将作为l-谷氨酰胺的二肽替代品的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺溶解在生理盐水(0.85nnacl)中得到的200mm溶液(“glutamax
tm
i(100
×
)”)而在市场上销售。以将其稀释为1/20而达到10mm(5
×
)的方式添加到“htm-alpha”中使用。
[0169]
对于上述uw液、htm1～htm2、htm-alpha、以及一般常用的培养液earlsbss(ebss-earle'sbalanced salt solution；thermofisherscientific)而言，将的钠离子、钾离子及这些的摩尔比一并示于下述表3。此外，即使是stemfit(注册商标)ak02n和mem-alpha，这些的离子浓度也与earlsbss相同。如果参照后述的实验结果，则认为na
+
/k
+
的摩尔比应该为1左右或者比其稍小的值。
[0170]
【表3】市售的培养基以及实施例的培养基中的na
+
/k
+
的摩尔比
[0171]
此外，如上所述，蛋白质、肽和生长因子包含在stemfit(注册商标)ak02n中，但不包含在mem-alpha中。因此，蛋白质、肽和生长因子包含在htm1中，但不包含在htm-alpha中。
[0172]
3.单细胞状态下的冷藏保存
[0173]
将上述“1.”中得到的人ips细胞加入到上述“2.”的冷藏保存液htm1和htm2中，以成为1e6cells/ml(浮游细胞数1
×
106个/ml)的方式以单细胞状态悬浮，然后加入到塑料管中，在4℃条件下静置保存。生存率是在台盼蓝染色后，对活细胞的数量进行计数而求出的。
[0174]
经时生存率测定的结果示于图1a和图2a。根据图1a的图，求出50％生存率维持天数(st50)，并且示于图1b。另外，根据图2a的图，求出80％生存率维持天数(st80)，并且示于图2b。
[0175]
本技术实施例中的统计学处理以如下方式进行。图1a和图2b的生存率的维持曲线是使用rver3.5.1与4变量逻辑曲线拟合而得到的。另外，单因素方差分析(one-way anova)及bonferoni检验以及dunnetts检验使用graphpadprism5.04进行计算。
[0176]
如图1a和图2a所示，与使用uw液时相比，在使用作为本技术实施方式的冷藏保存液的htm1(uw液+stemfit(注册商标)，2/1)和htm2(uw液+es细胞培养液(escmedium)，2/1)时，示出了更高的生存性维持效果。如图1a和图1b所示，与uw液相比，使用htm2进行保存时，生存性维持期间延长到约两倍。若对使用htm1时和使用htm2时进行比较，则50％生存率维持天数(st50)大致相等，与uw液相比，均示出了显著高的值。如图2a和图2b所示，在对80％的生存率维持天数(survivaltime80：st80)进行比较时，使用htm1时为4.6天，而与使用uw液时的2.1天相比，示出了2.2倍的显著高的值。
[0177]
htm1中使用的stemfit(注册商标)培养基不含动物来源成分(xenofree)，因此以后的实验使用htm1进行研究。此外，在将es细胞培养液(escmedium)直接用于冷藏保存用培养基时，生存性维持效果与uw液相比也显著降低。在以下的实验中也使用es细胞培养液(escmedium)，但仅在图中示出，省略说明或叙述。
[0178]
4.集落形成能力维持效果
[0179]
以如下方式验证冷藏保存后的细胞增殖能力。首先，将在上述“1.”中得到的人ips细胞加入到上述“2.”的冷藏保存液htm1中，以如上述“3.”的方式冷藏保存6天。接着，悬浮于含有10μm的y27362的stemfit(注册商标)ak02n培养基中，以成为0.1μg/cm2的方式添加imatrix-511，并以1.3e3/cm2的浓度进行接种。在培养的第5天，在对细胞进行固定碱性磷酸酶染色后，用集落计数器测定形成至一定大小以上的集落的数量。作为对照组，相同地，对不进行冷藏保存而以相同的方式培养5天时的集落的数量进行测定。然后，将冷藏保存后的5天的培养中得到的集落数除以该对照组中的集落数，以获得集落形成能力(相对集落效率(relativecolony efficiency))。
[0180]
如图2c所示，在使用htm1时，示出了使用uw液保存时的6.7倍的显著高的值。由以上可知，新细胞低温保存液htm1具有在人ips细胞的低温保存中维持较高的生存性维持效果和再培养后的增殖能力的效果。此外，在使用stemfit(注册商标)ak02n时，未观察到集落形成。
[0181]
5.凋亡细胞的检测和测定
[0182]
将在上述“1.”中得到的人ips细胞加入到上述“2.”的冷藏保存液htm1中，以如上述“3.”的方式冷藏保存3天，使用annexinv/ethd-iii对其后立即发生的细胞死亡进行分类。即，为了区分凋亡细胞和坏死细胞，首先，使用apoptotic/necroticcells detection kit(takara)按照方案进行染色。然后，在荧光显微镜下观察/测定并确定annexinv-fitc阳性细胞(凋亡)和乙锭同型二聚体iii阳性细胞(坏死)、hoechst33342(dojin)信号(全细胞)。
[0183]
通过图3a和图3b的柱状图来示出该结果。如图3a所示，已知与使用uw液时相比，在使用htm1时显著地将凋亡的引导抑制得较低。由于这种保存后立即抑制凋亡的效果，认为htm1具有比uw液高的增殖能力(集落形成能力)。
[0184]
6.细胞内ros测定
[0185]
在低温保存中维持低温保存期间的生存性也是很重要的，但抑制保存后再培养时发生的细胞死亡则是更重要的。为了弄清该低温保存/再培养开始后发生的细胞死亡的原因，使用氨基苯基荧光素(aminophenylfluorescein；apf)对细胞内活性氧种(ros)进行测定。具体而言，以如下的方式进行测定。首先，将aminophenylfluorescein(apf)(五稜化药)以最终浓度成为5μm的方式添加到与上述“5.”相同地冷藏保存3天后的培养基中，此时，在37℃培养箱(5％co2，5％o2)内导入30分钟。然后，在更换培养基的同时添加10μm的hoechst33342(dojin)进行反染色后，用荧光显微镜观察，拍摄照片。各细胞的荧光信号使用图像解析软件imagej进行定量。
[0186]
其结果如图4a所示。发现细胞内ros浓度具有在再培养开始90分钟内急剧上升，然后逐渐下降的倾向。
[0187]
7.细胞内caspase活性的测定
[0188]
对于与上述“5.”相同地冷藏保存3天后的细胞，测定作为凋亡指标的细胞内caspase3/7的活性。首先，使用cellevent
tm caspase-3/7greendetectionreagent(thermofisher)，按照方案进行染色。然后，使用图像解析软件imagej对各细胞的荧光信号进行定量。
[0189]
在图4b中示出其结果。发现作为凋亡的指标的caspase-3/7活性在90分钟后逐渐上升。该结果表明，在低温保存/再培养开始时，细胞内活性氧种(ros)暂时上升，由此诱导凋亡。
[0190]
8.抗氧化物质或者自由基清除剂的添加试验
[0191]
将抗氧化物质或自由基清除剂以各种浓度添加到htm1中，以如上述“3.”的方式用于冷藏保存试验。添加的抗氧化物质或自由基清除剂如图5a及以下所示。trolox(trx；trolox，wako)、egcg(teavigo(注册商标)dsm)n-乙酰半胱氨酸(nac；n-acetylcysteine，东京化成)、l-抗坏血酸(aa；l-ascorbicacid，wak)和依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazoline-5-one)，edaravone：sigma)。
[0192]
图5b表示以与图2a～2b相同的方式求出80％生存率维持天数并进行比较而得到的结果。如图5b所示，效果最好的是添加作为水溶性维生素e类似物的trolox(5mm)，将生存率延长至uw液的9.5倍、单独htm1的4.4倍，并在约20天内维持80％以上的生存率(st80：20.11天)。发现了已知为强力自由基抑制剂的edaravone具有次于trolox的效果，egcg、n-乙酰半胱氨酸(nac；n-acetylcysteine)具有次于edaravone的效果。与trolox协同作用的l-抗坏血酸(aa；ascorbicacid)则几乎没有观察到效果。根据以上的结果，以通用性高且能够以低价利用的trolox的添加为中心，实施了以后的实验。
[0193]
9.trolox的添加浓度
[0194]
对于生存性维持效果最好的trolox的效果，使添加浓度变化为0.1mm～0.5mm，进一步进行研究。图6a以与图2a重叠的形式示出了以与图2a相同的方式获得的生存率随时间的变化。另外，在图6b中，与上述图2b以及图5b相同地，示出求出80％生存率维持天数的结果。如图6b所示，可知80％生存率维持天数大致随着trolox的浓度的增大而增大。与不添加htm1相比，80％生存率维持天数在添加0.5mm以上时示出了显著高的值。
[0195]
接着，为了验证冷藏保存/再培养后的增殖能力，与上述“4.”相同地，对冷藏保存6天的细胞进行接种，比较培养第5天的集落形成能力。如图6c所示，可知以与上述“4.”相同的方式评价的集落形成能力也依赖于trolox的浓度而上升。效果最好的5.0mm的trolox添加区的集落形成能力达到单独htm1时的2.3倍，达到未冷藏保存的未保存对照组的41.2％。该值是与按照常规方法放入-80℃的冷冻机中缓慢冷冻保存的值大致同等的值。这表明通过在htm1中添加5mm的trolox，直至6天为止能够维持与冷冻保存同等以上的增殖能力。
[0196]
9a.与添加维生素e以及维生素e衍生物的比较
[0197]
使用在上述“2.”中记载的htm-alpha(uw液+mem-alpha，2：1)且添加了trolox和glutamax(注册商标，gibco)前的液体，按照与图6a和图2a的情况相同的步骤，对添加生育酚(维生素e)和生育酚乙酸酯(维生素e衍生物)时的冷藏保存中的效果进行研究。以与trolox相同的方式添加生育酚、生育酚乙酸酯以使其成为0.04mm～5.0mm，并进行冷藏保存。此时，也同时对添加2.0mm的作为水溶性维生素e类似物的trolox的样品进行试验。图6d中总结表示保存6天后、恢复培养1天后的相对生存率。由该结果，发现了与trolox相比，生育酚(维生素e)、生育酚乙酸酯在冷藏保存中的效果均较低。
[0198]
10.粘接状态下的冷藏保存(1)
[0199]
使用以与上述“1.”相同的方式得到的人ips细胞。其中，在培养的最后阶段，以比上述“1.”的维持培养稍小的浓度(1.0e3/cm2)进行接种并培养，在该接种的第二天，更换为不含y27362的stemfit(注册商标)ak02n培养基，然后在接种后的第4天除去培养基。
[0200]
接着，更换为作为冷藏保存用的培养基的htm1并在4℃条件下静置保存3天或6天。即，在细胞相互凝集/粘接，或粘接于培养容器的状态下进行3天或6天的冷藏保存。在作为该冷藏保存用的培养基的htm1中添加5mm的trolox而加以使用。另外，以使腺嘌呤盐酸盐(adeninehydrochloride；东京化成)分别成为0mm、1.4mm和4.1mm的方式添加到这样的培养基中并加以使用。此外，作为比较例的冷藏保存培养基，使用uw液(belzeruw(注册商标)coldstorage solution)。
[0201]
冷藏保存后的细胞在除去冷藏保存培养基后，用培养用培养基轻轻洗涤。接着，加入stemfit(注册商标)ak02n培养基，培养4天。在该培养结束的时间点，通过酶(使用
0.5xtryple(注册商标)select)剥离细胞，使其分散并测定活细胞数。然后，与冷藏保存开始时的细胞数进行比较。另外，在对培养结束以及开始时的相位差图像进行拍摄后，用imagej进行图像处理，进行集落区域的提取二值化，通过测定集落面积，从而评价增殖能力。
[0202]
上述实验的目的在于，对粘接ips细胞的状态下的冷藏保存法加以开发，通过在冷藏保存3天或6天后，培养4天，从而评价增殖能力。在图7a～7f以及图8中示出了实验的结果。图7a～7b表示在冷藏保存3天后再培养4天而得到的集落的图像，图7c～7d表示在冷藏保存6天后再培养4天而得到的集落的图像。在此，图7a以及图7c是相位差图像，图7b和图7d是将这些分别进行二值化而得到的图像。
[0203]
另外，图7e的柱状图总结表示在冷藏保存3天以及6天之后再培养4天的培养基中的集落的面积比率。进一步地，在图7f和图8的柱状图中，以将不冷藏保存而培养4天的非保存对照组设为1的比率表示在冷藏保存3天以及6天后再培养4天时的集落数的增加率。此外，在图8的柱状图中也一并表示对于冷藏保存6天时，直接使用htm1(不添加trolox等)以及使用在htm1中以使trolox成为8.2mm的方式进行添加而得到的冷藏培养基的实验结果。
[0204]
如图7a～7d各自的左上部分所示，在用uw液进行冷藏保存的情况下，在冷藏保存3天或6天后再培养时，几乎观察不到增殖。在使用在htm1中添加了5mm的trolox的冷藏保存培养基而冷藏保存3天的情况下，如图7a～7b各自的右上部分所示，观察到显著的增殖，如图7f的左部分所示，冷藏保存3天后的再培养中的细胞增殖率示出了与非保存对照组大致同等的值。另一方面，在使用在htm1中添加了5mm的trolox的冷藏保存培养基而冷藏保存6天的情况下，如图7c～7d各自的右上部分所示，观察到一些增殖，如图7f的右部分所示，冷藏保存6天后再培养时的细胞增殖率仅为在非保存对照组的10％左右。
[0205]
另一方面，如图7a～7d的各自的左下和右下部分所示，通过在htm1中添加5mm的trolox的同时进一步添加腺嘌呤(adenine)，可以提高增殖率。特别是如图8所示，发现了在将处于粘接(粘附)状态的细胞冷藏保存6天的情况下，除了添加5mm的trolox以外，再添加2.8mm和4.2mm的adenine，由此可以显著提高再培养时的增殖率。发现了到腺嘌呤(adenine)的浓度增加到4.2mm为止，随着腺嘌呤(adenine)的添加而增殖率增大，但若添加到8.2mm，则增殖率反而降低。
[0206]
11.粘接状态下的冷藏保存(2)
[0207]
使用上述“2.”中记载的htm-alpha(uw液+mem-alpha，2：1)，通过与上述“10.”相同的操作，对粘接状态下的冷藏保存进行评价。其中，并非在6天而是在7天冷藏保存后再培养后进行评价。在此，如上所述，在htm-alpha中添加了5mm的trolox和5倍浓度(x5；10mm)的glutamax(注册商标，gibco)。另外，通过同时在同一条件下使用htm1和htsfrs来进行比较。此外，与htm-alpha相同地，在htm1中添加了5mm的trolox和5倍浓度(x5；10mm)的glutamax(注册商标，gibco)而加以使用。
[0208]
在图9的图中示出其结果。在图9的柱状图中，与图7e和图8相同地，以将不冷藏保存而培养4天的非保存对照组设为1的比率表示。如图9的图所示，在使用htm-alpha(中央的培养基)作为冷藏保存培养基时，与使用htm1时相比，示出了显著高的增殖率。另外，与使用作为市售的冷藏保存液的htsfrs时相比，示出了非常高的增殖率。
[0209]
由该结果可以认为，stemfit(注册商标)ak02n的c液中所含有的成纤维细胞生长
因子(fgf)不是必须的，或者几乎没有贡献。另外，认为stemfit(注册商标)ak02n中所含的成分中的不包含在htm-alpha中的成分不是必须的。特别是，由于htm-alpha是无蛋白质的培养基，因此认为蛋白质不是必须的，或者最好没有。
[0210]
12.小鼠胚胎的冷藏保存
[0211]
如上所述，直接使用体外受精后3.5天的胚泡期胚进行冷藏保存实验。详细而言，对于该胚泡期胚，将培养基置换成在上述“11.”中使用的htm-alpha、htm1和htsfrs以及uw液后，放入塑料管中，在4℃条件下静置并保存3天(72小时)。此外，与上述“11.”相同地，此处的htm-alpha和htm1均为添加了5mm的trolox和5倍浓度(x5；10mm)的glutamax(注册商标，gibco)的液体。
[0212]
图10表示进一步培养2天，在该2天的培养期间中从透明带逃逸的胚胎的比率。图10中一并表示对未进行冷藏保存的未保存对照组(f_control)也相同进行冷藏保存以及培养的结果。
[0213]
如图10所示，在htm1和htm-alpha中，都示出了与未保存对照组(f_control)同等的逃逸率，但在uw液和htsfrs中都示出了显著低的逃逸率。
[0214]
接着，与图7e～7f相同地，对添加腺嘌呤盐酸盐(adeninehydrochloride；东京化成)的效果进行研究。即，在与图10的实验相同的条件下，求出以使腺嘌呤盐酸盐(adeninehydrochloride；东京化成)成为各浓度的方式添加时的从透明带逃逸的胚胎的比率。图11表示从左开始依次表示添加未保存对照组(f_control)以及以使腺嘌呤盐酸盐(adeninehydrochloride；东京化成)分别成为1.4mm(1400μm)、140μm、14μm以及0mm的方式添加时的结果。由图11可知，在5天和7天的低温保存中，adenine浓度为14μm～140μm(0.014～0.14mm)时，示出了较高的透明带逃逸率。
[0215]
13.聚乙烯醇(pva；polyvinylalcohol)添加的效果
[0216]
如上述表1所示，由于在uw液中添加5.0％的羟乙基淀粉(hes；hydroxyethyl starch)，所以在上述“2.”中记载的htm-alpha(uw液+mem-alpha，2：1)中含有3.3％的羟乙基淀粉(hes)。在此，研究了添加聚乙烯醇(pva)来代替羟乙基淀粉(hes)时的效果。在此，使用从上述表1的uw液的组成中除去羟乙基淀粉(hes)后，其他与htm-alpha(uw液+mem-alpha，2：1)相同的冷藏保存液，使用以0.25％～2.5％(重量)的范围含有聚乙烯醇(pva)的冷藏保存液。然后，以与上述图6d的情况相同的方式评价细胞生存性。即，通过与图6a和图2a的情况相同的步骤，研究了基于聚乙烯醇(pva)的保护效果。此时，同时也对羟乙基淀粉(hes)的浓度为5％(重量)的样品进行了试验。在图12a中总结表示保存6天后、恢复培养1天后的相对生存率。由该结果可知，聚乙烯醇(pva)在任何浓度范围内都示出了与5％羟乙基淀粉(hes)同等的保护效果。此外，认为聚乙烯醇(pva)比羟乙基淀粉(hes)更廉价，并且对生物体组织的安全性也更高。
[0217]
14.甘露醇(mannitol)的添加效果
[0218]
接着，以与上述“13.”相同的方式，同时添加聚乙烯醇(pva)和甘露醇(mannitol)，并验证其协同效果。即，在从htm-alpha(uw液+mem-alpha，2：1)中省去羟乙基淀粉(hes)后的液体中，以0.5％～5％范围添加聚乙烯醇(pva)，并且添加被认为具有细胞膜非透过性的渗透压调整效果的0、30、60、90mm的甘露醇(mannitol)而加以使用。另外，通过与图6a和图2a的情况相同的步骤，研究保护效果。在图12b中，与图12a的情况相同，总结表示保存6天
后、恢复培养1天后的相对生存率。根据图12b的结果可知，如果在添加0.5％的聚乙烯醇(pva)的同时添加30mm～90mm的范围内的甘露醇，则与以5％浓度含有羟乙基淀粉(hes)的情况相比，冷藏保存后的细胞的生存性得以提高。
[0219]
15.实验结果的总结
[0220]
在使用将uw液和市售的临床研究用培养基stemfit(注册商标)ak02n以2/1的比例混合而得到的本技术实施方式的细胞低温保存用培养基htm1时，如图1b和图2b所示，与广泛用作组织的冷藏保存液的uw液相比，在人ips细胞的4℃低温保存中，可以将生存性维持时间延长两倍左右。另外，如图6c所示，冷藏保存6天而再培养后的细胞增殖能力提高到uw液的约7倍。
[0221]
另外，认为通过在htm1中添加抗氧化物质/自由基清除剂，可以抑制冷藏保存后再培养的开始时产生的ros浓度的急剧上升，在添加5mm的trolox时，如图6a和6b所示，可以使80％生存率的维持时间为20天以上，与未添加trolox的htm1相比，约为其4倍。另外，如图6c所示，确认了具有将低温保存/再培养后的集落形成率提高到无添加区的约2倍的效果。
[0222]
一方面，如图7a～7f以及图8所示，可知在以粘接状态下直接进行低温保存时，除了trolox的添加以外，adenine的添加也提高其后的增殖率。
[0223]
另一方面，在使用将uw液和memalpha混合而得到的特别优选的实施方式的细胞低温保存用培养基“htm-alpha”(uw液+mem-alpha，2/1)时，如图9所示，认为与htm1(uw液+stemfit(注册商标)ak02，2/1)相比，维持细胞增殖能力的效果更大。
[0224]
ips细胞的冷藏保存技术与冷冻保存相比，虽然保存期间被限定(限制)，但其是可以在培养状态(粘接)下直接保存，或对不可冷冻的诱导分化的类器官进行保存以及输送，或药物开发中所需的细胞供给等应用范围非常广的技术。因此，能够保存人ips细胞的本技术是非常重要的。
[0225]
本技术实施方式的细胞低温保存用培养基“htm-alpha”对小鼠胚胎的冷藏保存能发挥效果，因此认为对人和各种动物的胚胎性或非胚胎性的干细胞，或含有这些的组织的冷藏保存也能发挥效果。