4-乙基苯酚在防治烟草黑胫病中的应用

本发明涉及烟草黑胫病防治技术领域，具体涉及4-乙基苯酚在防治烟草黑胫病中的应用。

背景技术：

烟草黑胫病是烟草的毁灭性病害，烟草黑胫病具有分布广、发病率高、危害重、防治难等特点，现已遍布全国，成为我国烟草上最严重的病害之一。1950年该病在中国的黄淮地区首次发现，并且连续多年严重危害烟草的生产。

烟草黑胫病的致病病原菌为烟草疫霉菌(phytophthoraparasiticavar.nicotianae)，该病原菌属于腐霉科(pythiaceae)疫霉属(phytophthora)。烟草疫霉菌产生的卵孢子和厚垣孢子在适宜的环境条件下会形成孢子囊，孢子囊通过释放出游动孢子去侵染烟株，烟株在感染病菌后可产生分解寄生细胞的“毒素”，该毒素主要为多元半乳糖醛酶，该酶通过分解烟株组织内的中胶层和导管壁，产生能够阻塞根部水分上升的果胶碎块，最终导致烟株因缺水而发生萎焉。

烟草疫霉菌的卵孢子和厚垣孢子对不良环境具有很强的抵御能力，通常情况下，卵孢子和厚垣孢子在土壤中能够存活3年以上；而且，烟草疫霉的游动孢子形成速度快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染；此外，该病有时还与其他病害混合发生；因此，烟草黑胫病的防治难度较大。

长期以来，对该病害采取种植抗病品种和化学防治为主、栽培措施为辅的综合防治方法。但随着连作烟田面积扩大以及连作年限的增长，加之化学药剂的长期不合理使用，抗病品种抗性的丧失，病原菌的变异分化以及抗药性的产生，烟草黑胫病普遍具有加重流行的趋势。

目前，生产上为了减轻该病造成的损失，不断尝试综合运用化学防治、农业防治、抗病育种、生物防治等多种方法控制烟草黑胫病，其中化学药剂的依赖程度依然较高，但由于其所用药剂作用机制和作用位点相近，很容易产生耐药性，生产上急需替代药剂。由于生物防治相较于化学药剂防治，具有无污染、无残留等优点，已成为黑胫病防治研究的热点之一。

目前防治烟草黑胫病的药物主要是甲霜灵、乙磷铝及乙磷铝锰锌、烯酰吗啉、全瑞毒霉、敌克松、恶霜灵锰锌、代森锰锌等杀菌剂。但近年来发现，这些药物逐渐出现药效下降的问题。一方面可能是用户使用不当，另一方面，疫霉菌对大多数化学农药已经产生抗药性。因此，高效、低毒、低残留且对环境友好的植物源杀菌剂开始成为研究热点。

四乙基苯酚是一种可从许多植物中挥发出来的酚类物质，生活中一般用作酚醛树脂、橡胶防老化剂、塑料抗老化剂、表面活性剂、非离子乳化剂、合成香料、农药原料、有机合成中间体及化学试剂。目前学术界主要以降低其在酒类、水中的含量以提升口感为主要研究方向。还没有关于将4-乙基苯酚用于防治烟草疫病的相关报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供4-乙基苯酚在防治烟草黑胫病中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供4-乙基苯酚在如下(1)或(2)中的应用；

(1)防治烟草黑胫病；

(2)制备防治烟草黑胫病的药物。

本发明的第二方面，提供4-乙基苯酚在防治烟草疫霉菌中的应用。

上述应用中，所述4-乙基苯酚通过如下(1)-(3)至少一项途径防治烟草疫霉：

(1)抑制烟草疫霉菌菌丝径向生长；

(2)抑制烟草疫霉菌游动孢子囊及游动孢子产生；

(3)抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发。

本发明的第三方面，提供一种防治烟草黑胫病的方法，包括以下步骤：

在烟草种植前采用4-乙基苯酚对种植烟草的土壤进行处理；

和/或，在烟草苗床期将4-乙基苯酚与水混合，均匀喷洒至烟草表面。

优选的，在烟草种植前2-3天，将4-乙基苯酚按1-2kg/亩的用量施入，翻土，将4-乙基苯酚与土壤混合均匀。

优选的，在烟草移栽后7天，将4-乙基苯酚按照1-2kg/亩的用量与水按照重量比1：50混合，均匀喷洒至烟草表面。

本发明的第四方面，提供4-乙基苯酚在制备烟草疫霉菌杀菌剂中的应用。

本发明的第五方面，提供一种烟草疫霉菌杀菌剂，所述烟草疫霉菌杀菌剂是以有效量的4-乙基苯酚为活性成分。

本发明的有益效果：

本发明首次研究发现，从抗病和感病大豆挥发物中测得的4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝径向生长、对烟草疫霉菌游动孢子囊产生及游动孢子的产生和萌发具有明显的抑制作用，4-乙基苯酚能够对土壤及烟草中的烟草疫霉菌起到有效的防治作用，对防治烟草疫病(烟草黑胫病)有巨大意义。

附图说明

图1为本发明感病大豆气态挥发物中4-乙基苯酚的质量色谱图。

图2为本发明抗病大豆气态挥发物中4-乙基苯酚的质量色谱图。

图3为本发明4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝径向生长的抑制图。

图4为本发明4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝形态的影响图。

图5为本发明4-乙基苯酚对烟草疫霉菌游动孢子萌发的抑制图。

图6为本发明4-乙基苯酚对烟草疫病防效盆栽实验的防效图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前防治烟草黑胫病的药物主要是甲霜灵、乙磷铝及乙磷铝锰锌、烯酰吗啉、全瑞毒霉、敌克松、恶霜灵锰锌、代森锰锌等杀菌剂。但近年来发现，这些药物逐渐出现药效下降的问题。一方面可能是用户使用不当，另一方面，疫霉菌对大多数化学农药已经产生抗药性。

本发明经过实验发现，在抗病和感病大豆挥发物中测得4-乙基苯酚(如图1和2所示)。4-乙基苯酚，英文名4-ethylphenol，分子式c8h10o，其结构式如下：

4-乙基苯酚主要是用作食品香料、酚醛树脂和抗氧剂等；目前还未见有4-乙基苯酚在防治烟草疫霉菌方面的应用。本发明意外的发现，4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝径向生长、对烟草疫霉菌游动孢子囊产生及游动孢子的产生萌发具有明显的抑制作用，对防治烟草疫病有巨大意义，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：4-乙基苯酚购自上海源叶生物科技有限公司；烟草疫霉菌菌株来自南京农业大学。

实施例1：4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝径向生长的影响

菌种活化：将低温保存的烟草疫霉菌切块置于v8固体培养基平板上25℃培养7d后，将其烟草疫霉菌菌落切成小块于v8固体或液体培养基平板上，25℃培养3d。

固体v8培养基配方：v8饮料100.0ml，琼脂15.0g，水900.0ml。

液体v8培养基配方：v8饮料100.0ml，水900.0ml。

将一定量4-乙基苯酚加入到10％的固体v8培养基，配制成4-乙基苯酚终浓度为30mg/l、60mg/l、90mg/l、120mg/l、150mg/l的含药培养基，将菌种活化后的烟草疫霉菌打若干菌饼放置培养基上，以4-乙基苯酚终浓度为0mg/l的培养基作为对照，每个处理3个重复，放置在25℃培养箱中黑暗培养，如图3所示。实验中各个处理的菌落直径，我们采用十字交叉法来测量。计算各浓度4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝半最大效应浓度(ec50)、95％最大效应浓度(ec95)、99％最大效应浓度(ec99)见表1。

疫霉菌菌丝生长抑制率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％

表1：4-乙基苯酚对菌丝径向生长ec50、ec95、ec99

实施例2：4-乙基苯酚对烟草疫霉菌游动孢子囊及游动孢子产生的影响

取活化后相同菌丝量的液培，用无菌的自来水漂洗3～4次，最后分别加入4-乙基苯酚至终浓度为30mg/l、60mg/l、90mg/l、120mg/l、150mg/l，以4-乙基苯酚浓度为0mg/l的v8培养基作为对照，每个处理3个重复，25℃培养4h后，在10倍显微镜下随机取5个视野，观察记录游动孢子囊数量。计算4-乙基苯酚对烟草疫霉菌游动孢子囊形成的抑制率。

疫霉菌游动孢子囊形成抑制率(％)＝(对照组游动孢子囊数―处理组游动孢子囊数)/对照组游动孢子囊数×100％

取活化后相同菌丝量的液培，用无菌的自来水漂洗3～4次，最后加入等体积的无菌自来水，每个处理3个重复，25℃培养3h后，加入4-乙基苯酚至终浓度为30mg/l、60mg/l、90mg/l、120mg/l、150mg/l，以4-乙基苯酚浓度为0mg/l的v8培养基作为对照，每个处理3次重复，静置3h后，在每个处理中取5μl游动孢子悬浮液，在显微镜下观察记录游动孢子数量，计算4-乙基苯酚对烟草疫霉菌游动孢子产生的抑制率，见表2。

疫霉菌游动孢子产生抑制率(％)＝(对照组游动孢子数―处理组游动孢子数)/对照组游动孢子数×100％。

表2：4-乙基苯酚对游动孢子囊及游动孢子产生的抑制率

实施例3：4-乙基苯酚对烟草疫霉菌菌丝形态的影响

取两份活化后的烟草疫霉菌液培菌丝体，一个加入4-乙基苯酚后静置6h，另一个不做任何处理为对照，在显微镜下观察菌丝形态。

4-乙基苯酚处理过的菌丝与对照组菌丝相比，对照组菌丝生长自然舒展，无末端分枝增多现象，菌丝生长点均匀一致，分枝的形成距离顶端较远，游动孢子囊数量较多。4-乙基苯酚处理后的菌丝生长杂乱，末端分支明显增多，分支形成距离顶端较近，并且抑制了游动孢子囊的形成，如图4所示。

实施例4：4-乙基苯酚对烟草疫霉菌游动孢子萌发的影响

游动孢子悬浮液的制备：取活化的烟草疫霉菌液培，将液体v8培养基全部吸出，弃掉，向培养皿中加入灭菌的自来水，浸没菌丝块，每隔10min用灭菌自来水冲洗，冲洗3次后，最后一次换水，水不要加太多，能够刚刚浸没菌丝即可，将平板于25℃黑暗放置6h。

通过血球计数板计数的方法来控制游动孢子悬浮液浓度达到4×103/ml，配制使4-乙基苯酚终浓度为80mg/l、100mg/l、120mg/l、140mg/l、160mg/l的含药培养基，以4-乙基苯酚浓度为0mg/l的v8培养基作为对照，每个处理3次重复，加入1ml游动孢子悬浮液，用涂布器均匀涂布，观察所有处理培养基的孢子萌发情况，如图5所示。从图5可知，当4-乙基苯酚浓度达100mg/l时，显著抑制了游动孢子的萌发。

表3：4-乙基苯酚对游动孢子萌发的影响

注：“+”有游动孢子萌发；“-”无游动孢子萌发

实施例5：4-乙基苯酚对烟草疫病防效盆栽实验

模拟病土：将活化后的液培烟草疫霉菌菌丝与土壤混匀，分装到多个小盆。

土壤处理：将装有模拟病土的小盆中加入不同浓度的4-乙基苯酚粉末混匀，配置成0.01g/dm²、0.02g/dm²、0.03g/dm²、0.04g/dm²、0.05g/dm²，分别记为1、2、3、4、5，处理盆中土壤2～3d；

将装有模拟病土的小盆中不加入4-乙基苯酚处理，记为ck1，作为对照组。

将装有无烟草疫霉菌的普通土壤的小盆，记为ck0，作为空白对照组。

移栽烟草：将烟草种在普通土壤中生长14天后，将长势一致的烟草移栽在处理过的土壤中。

处理烟草：移栽7d后，将4-乙基苯酚按照0.01g/dm²、0.02g/dm²、0.03g/dm²、0.04g/dm²、0.05g/dm²的用量与水按重量比1:50混合，分别喷洒至标记1～5的盆中，7d后观察烟草黑胫病的发病状况，如图6所示。计算病情指数和防治效果，参照标准gb/t23222-2008的分级标准进行病情分级及统计分析。

病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高级数值)]×100

防治效果＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％

表4：4-乙基苯酚对烟草黑胫病的防治效果

说明：本试验为盆栽试验，通过调控模拟病土中所加入的烟草疫霉菌的量，可以实现对照组的病情指数为100。另外，为保证防治效果的可比较性，对照组和处理组1-5所采用的模拟病土是相同的。

综上可知，4-乙基苯酚对烟草疫霉菌具有明显的抑制作用，可以广泛应用防治烟草疫霉菌中。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。