1.本发明属于猪繁殖技术领域，具体涉及一种适用于中国地方猪精液冷冻保存剂及其应用。
背景技术：
2.精液冷冻保存技术的发展解决了新鲜精液无法长期保存的问题，使采精和受精在时间和空间上得以分离，很大程度上延长了精子的体外储存时间，提高优良种畜的利用率，便于珍贵遗传物质的保存。精子对温度变化比较敏感，在冷冻降温的过程中，精子容易遭受冷冻损伤，主要包括物理性损伤、化学性损伤和氧化性损伤。跟新鲜精液相比，冷冻
‑
解冻后的精子其活力、线粒体活性、顶体完整率显著降低，畸形率显著上升。而精子质量的好坏，与妊娠率、分娩率和窝产仔数等密切相关。冷冻精液在牛上应用已经比较成熟，而猪精子对于冷冻刺激更为敏感，解冻后精子复苏率低，异常精子多，受胎率低于正常受胎率，故猪精子冷冻还处于试验阶段。
3.辅酶q10是一种脂溶性的类维生素，具有广泛的生化和药理学效应，包括参与细胞呼吸和能力代谢、细胞的抗氧化功能、稳定细胞膜结构和抑制细胞凋亡等。它具有很强的抗氧化作用，能有效清除细胞内产生的ros，防止脂蛋白和dna受到氧化破坏，清除细胞体内的自由基。维生素e在细胞中起着抗氧化作用，能阻断脂质过氧化在质膜上的传播，保持膜的完整性。
4.目前尚未见到有关辅酶q10或维生素e在中国地方猪精液冷冻保存剂中的应用。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于中国地方猪精液冷冻保存剂及其应用，以解决现有技术对中国地方猪精子冷冻以及解冻后活力降低问题。
6.本发明的技术方案如下所述：
7.一种适用于中国地方猪精液冷冻保存剂，所述精液冷冻保存剂含有辅酶q10和/或维生素e，所述精液冷冻保存剂为下列配方中的一种：
8.(1)在每100ml精液冷冻保存剂中包括下列成分：辅酶q10 0.5mg
‑
10mg，三羟甲基氨基甲烷2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，20％质量的鸡蛋黄和 5％质量的甘油，或
9.(2)每100ml冷冻精液保存剂中包括下列成分：维生素e 20mg
‑
80mg，三羟甲基氨基甲烷 2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，20％质量的鸡蛋黄和 5％质量的甘油，或
10.(3)每100ml精液冷冻保存剂中包括下列成分：辅酶q10 0.5mg
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2.5mg，维生素e 40mg
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60mg，三羟甲基氨基甲烷2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，20％质量的鸡蛋黄和5％质量的甘油。
11.本发明的猪精液冷冻保存剂可在中国地方猪繁殖中的中的应用。
12.具体的技术方案
13.本发明的猪精液冷冻剂的主要成分包括一种辅酶q10和/或维生素e。
14.在冷冻过程中，需要利用常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等。特别要强调的是中国地方猪精液冷冻保存剂添加甘油的量的体积比(或称质量)为5％。
15.在猪精液冷冻剂在冷冻过程中，需要完全溶解于常规冷冻基础液的配方中，按实物量计算为：三羟甲基氨基甲烷2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素 0.1g，以及双蒸水100ml。
16.具体地，每100ml中国地方猪精液冷冻保存剂中的辅酶q10添加量为0.5mg
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10mg，和/ 或维生素e的添加量20mg
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80mg。
17.进一步地优选方案为，每100ml所述中国地方猪精液冷冻保存剂中辅酶q10添加量为 0.5mg
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2.5mg，和/或维生素e添加量40mg
‑
60mg。
18.本发明的主要优点为：
19.本发明将辅酶q10和维生素e分别单独添加或联合添加用于中国地方猪精液冷冻保存剂，其效果可靠，易于推广，适用于中国地方猪冷冻精液人工授精及精液冷冻保存后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高地方猪精液冷冻
‑
解冻后精子活力，线粒体活性和顶体完整率，能显著降低株精子畸形率，保持精子的受精能力。本发明的猪精液冷冻保存剂的经济成本低，便于推广应用。
具体实施方式
20.实施例1：
21.在本实施例中，涉及一种常温稀释液(betsville thawing solution，简称bts)，其配方为：按实物量计算：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，乙二胺四乙酸0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，用双蒸水混匀，并定容至100ml。调整该常温稀释液ph至7.2，渗透压为310mosm/l。
22.本发明的中国地方猪精液冷冻保存剂主要成分为辅酶q10，其在冷冻过程中，像其他常规冷冻途径一样，也需要添加常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等成分。上述的中国地方猪精液冷冻保存剂中添加甘油的量的体积比(或称质量)为5％。
23.上述冷冻基础液的配方为：按实物量计算：辅酶q10 0.5mg
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10mg，三羟甲基氨基甲烷 2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，和双蒸水100ml。
24.一种中国地方猪精液冷冻保护剂的制备方法，包括如下步骤：
25.步骤一，配制冷冻基础液：按配方量称取三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸和葡萄糖，先将它们在装有80ml双蒸水的烧杯内混合，于37℃水浴20min，待上述物质完全溶解并降温后，再取稀释液加入青霉素和硫酸链霉素，再加双蒸水定容至100ml；于4℃冰箱中保存备用，即为冷冻基础液。
26.步骤二，准确量取上步冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，混匀后即得到本发明的中国地方猪精液冷冻保存剂i液。
27.步骤三，在中国地方猪精液冷冻保存剂i液的基础上，添加体积比(或称质量)为5％的甘油，过滤灭菌，冷却至室温，即可得到本发明的猪精液冷冻保存剂(简称中国地方猪精液冷冻保存剂ii液)，将其放入4℃冰箱中备用留做以下试验测试。
28.本发明试验对象为中国地方猪品种(例如品种为湖北白猪，太湖猪、通城猪和二花脸，这些品种为国内常用地方猪品种，下同)，利用本发明制备精液冷冻保存稀释液进行了如下试验：
29.(1)猪精液的采集
30.采用手握法采精：待公猪爬跨后，对其包皮和周围部分进行清洗消毒，再用生理盐水冲洗并擦干。采精人员带上灭菌用的乳胶手套，待公猪阴茎从包皮内伸出时立即抓握阴茎的螺旋状龟头，手呈拳状有节奏的对阴茎施加压力，待阴茎充分勃起后，顺势向前牵引引起公猪射精，另一只手用带有4层纱布的集精瓶手工采集并过滤精液。
31.(2)猪精液处理与冷冻
32.将检查合格的猪精液样品加入等温等体积的常温稀释液(即bts液稀释)，配方同本实施例1)，在17℃的恒温箱中平衡2
‑
3h，同时要每隔20min轻轻晃动精液数次，防止精子因为长时间静置进入假死状态。将平衡后的精液分装到10m l离心管中，在17℃下离心，以 2400rcf/min速率离心3min后取出，弃去上清液。
33.采用两步稀释法稀释猪精液：向离心后的沉积中缓慢加入提前预冷的i液(80％tcg+20％卵黄)，按体积比(质量)1:2比例稀释，用纱布包裹后放入 4℃冰箱平衡1.5～2h，使其缓慢下降到到4℃。然后再等体积缓慢加入预冷过的ii液，并用纱布包裹后在4℃继续平衡1.5～2h。用自制注射器吸取到0.25ml细管内，放到液氮上方3cm 处熏蒸10min，然后转入液氮中保存。
34.(3)细管冻精的解冻和精子质量评定
35.1)猪精子活力测定
36.将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻30s，收集于1.5ml离心管内，37℃继续孵育10min，取10μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，放置于200
×
倒置显微镜下，在精子密度分析仪中分析精子活力。
37.2)猪精子线粒体活性测定
38.线粒体活性采用罗丹明123和碘化丙啶(pi)联合染色法来检测。首先吸取100μlhepes/bsa，放置于37℃下预热10min，然后各加入1μl的罗丹明123和1μl的pi，两者充分混匀后在黑暗条件下孵育10min，作为精子染料。取50μl解冻后的精液与100μl配制好的染料充分混匀。放入37℃水浴锅中，避光孵育30min，然后在荧光显微镜下观察精子染色情况。pi能够进入死精子的细胞核内，与dna结合生成红色荧光，而罗丹明123则可以特异地和线粒体结合发出绿色荧光，因此带有绿色荧光的精子被认为具有完整的线粒体。
39.3)猪精子顶体完整率的测定
40.取1ml丙酮(需事先在—20℃下预冷)中加入500ul中国地方猪(品种同上)的精液，于4℃固定5min，离心(500r/min，6min)后弃上清，沉淀经磷酸盐缓冲液(pbs，常规缓冲液)洗2次后用hepes/牛血清白蛋白(bsa)封闭30min，再加入异硫氰荧光素标记的花生凝集素(常规)50ul，于37℃孵育30min，离心(500r/min，6min)，沉淀经pbs洗2次，取10ul 悬液滴于载玻片中央，再滴加少量增光剂(常规，商购)，盖片，用无色指甲油封片，用荧光显微镜下观察、计数。
41.4)猪精子畸形率测定
42.猪精子畸形率采用常规吉姆萨染色法检测。将解冻后的精液，吸取10ul滴于载玻
片的一端，将样品涂抹均匀，风干。将风干后的抹片滴上几滴甲醇，固定2
‑
3min，风干。将风干后的抹片置于吉姆萨染色缸中，染色30min后用水缓慢冲洗载玻片，置于试验台上待其自然晾干。将制备好的载玻片在400
×
光学显微镜下进行观察，数左、右两个区域200个以上的精子计算。
43.(5)猪精子质量的评定结果
44.应用本发明的中国地方猪精液冷冻保护剂以及精液冷冻
‑
解冻方法，评定结果如表1所示。
45.表1中国地方猪用精液冷冻保护剂以及精液冷冻
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解冻方法的评定可
46.处理精子活力线粒体活性顶体完整率畸形率对照组31.09％30.02％29.84％12.56％处理组136.90％35.42％36.16％9.78％处理组234.64％37.38％37.219.24％处理组331.46％33.15％34.75％8378％实施例142.43％44.29％39.96％8.57％
47.实施例2：
48.在本实施例中，涉及常温稀释液(betsville thawing solution，简称：bts)，其配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，乙二胺四乙酸0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，用双蒸水混匀，并定容至100ml，调整ph至7.2，渗透压为310mosm/l。
49.本实施例的中国地方猪精液冷冻保存剂主要成分为维生素e，其次在冷冻过程中，像其他常规冷冻途径一样，也需要添加常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等。上述的中国地方猪精液冷冻保存剂中添加甘油的量的体积比(质量)为5％。
50.冷冻基础液的配方为维生素e 20mg
‑
80mg，三羟甲基氨基甲烷2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，补充双蒸水100ml。
51.本发明提供来了一种适用于中国地方猪精液冷冻保护剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
52.步骤一，配制冷冻基础液。冷冻基础液的制备方法为：首先称取三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸和葡萄糖，先将它们在装有80ml双蒸水的烧杯内混合，37℃水浴20min，待上述物质完全溶解并降温后，再取稀释液加入青霉素和硫酸链霉素，加双蒸水定容至100ml，4℃冰箱保存备用。
53.步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，混匀即得到本发明的一种中国地方猪精液冷冻保存剂(简称冷冻保存剂i液)。
54.步骤三，在冷冻保存(冷冻保存剂i液)的基础上，添加体积比(质量)为5％的甘油，过滤灭菌，冷却至室温，即可以得到本发明的猪精液冷冻保存剂(简称冷冻保存剂ii液)，放入 4℃冰箱中备用留做以下试验测试。
55.对地方猪精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验：
56.(1)猪精液的采集
57.手握法采精：待公猪爬跨后，对其包皮和周围部分进行清洗消毒，再用生理盐水冲洗并擦干。采精人员带上灭菌乳胶手套，待阴茎从包皮内伸出时立即抓握阴茎的螺旋状龟
头，手呈拳状有节奏的对阴茎施加压力，待阴茎充分勃起后，顺势向前牵引引起公猪射精，另一只手用带有4层纱布的集精瓶手采集并过滤精液。
58.(2)猪精液的处理与冷冻
59.将检查合格的猪精液样品加入等温等体积的bts液稀释，在17℃的恒温箱中平衡2
‑
3h，同时要每隔20min轻轻晃动精液数次，防止精子因为长时间静置进入假死状态。将平衡后的精液分装到10m l离心管中，在17℃下离心，以2400rcf/min速率离心3min后取出，弃去上清液。
60.采用两步稀释法稀释精液：向离心后的沉积中缓慢加入提前预冷的冷冻保存剂i液(80％tcg+20％卵黄)，按质量(体积比)1:2比例稀释，用纱布包裹后放入4℃冰箱平衡1.5～2h，使其缓慢下降到到4℃。然后再等体积缓慢加入预冷过的冷冻保存剂ii液，并用纱布包裹后在4℃继续平衡1.5～2h。用自制注射器吸取到0.25ml细管内，放到液氮上方3cm处熏蒸10min，然后转入液氮中保存。
61.(3)猪细管冻精的解冻和猪精子质量评定
62.1)精子活力的测定
63.将猪细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻30s，收集于1.5ml离心管内，37℃继续孵育10min，取10μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，放置于200
×
倒置显微镜下，在精子密度分析仪中分析精子活力。
64.2)精子线粒体活性的测定
65.线粒体活性测定采用罗丹明123和碘化丙啶(pi)联合染色法来检测。首先吸取100μlhepes/bsa，放置于37℃下预热10min，然后各加入1μl的罗丹明123和1μl的pi，将两者充分混匀后在黑暗条件下孵育10min，作为精子染料。取50μl解冻后的精液与100μl 配制好的染料充分混匀。放入37℃水浴锅中，避光孵育30min，然后在荧光显微镜下观察精子染色情况。pi能够进入死精子的细胞核内，与dna结合生成红色荧光，而罗丹明123则可以特异地和线粒体结合发出绿色荧光，因此带有绿色荧光的精子被认为具有完整的线粒体。
66.3)精子顶体完整率测定
67.取1ml丙酮(事先经—20℃预冷)中加入500ul中国地方猪精液，于4℃固定5min，离心(500r/min，6min)后弃上清，沉淀经pbs洗2次后用hepes/bsa封闭30min，再加入异硫氰荧光素标记的花生凝集素(商购)50ul，于37℃孵育30min，离心(500r/min，6min)，沉淀经pbs洗2次，取10ul悬液滴于载玻片中央，再滴加少量增光剂(常规，商购)，盖片，无色指甲油封片，荧光显微镜下观察、计数。顶体完整的猪精子，可见顶体呈绿色荧光且边缘光滑。
68.4)猪精子畸形率的测定
69.精子畸形率采用吉姆萨染色法检测。将解冻后的精液，吸取10ul滴于载玻片的一端，将样品涂抹均匀，风干。将风干后的抹片滴上几滴甲醇，固定2
‑
3min，风干。将风干后的抹片置于吉姆萨染色缸中，染色30min后用水缓慢冲洗载玻片，置于试验台上待其自然晾干。将制备好的载玻片在400
×
光学显微镜下进行观察，数左、右两个区200个以上的精子计算。
70.5)猪精子质量评定结果
71.应用的中国地方猪用精液冷冻保护剂以及精液冷冻
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解冻方法的评定结果如表2。
72.表2应用本发明的中国地方猪用精液冷冻保护剂以及精液冷冻
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解冻方法
73.处理精子活力线粒体活性顶体完整率畸形率对照组30.50％33.39％30.66％13.25％处理组131.70％32.79％32.89％13.03％处理组234.31％34.56％33.10％9.15％处理组330.47％31.63％32.74％10.01％实施例238.35％39.1％38.75％9.16％
74.实施例3：
75.在本实施例的技术方案中，涉及常温稀释液(betsville thawing solution，bts)，其配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，乙二胺四乙酸0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水混匀定容至100ml，调整ph至7.2，渗透压为310mosm/l。
76.本实施例的中国地方猪精液冷冻保存剂主要为辅酶q10和维生素e，其次在冷冻过程中，像其他常规冷冻途径一样，也需要添加常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等。上述的中国地方猪精液冷冻保存剂中添加甘油的量的体积比为5％。
77.冷冻基础液的配方为辅酶q10 0.5mg
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2.5mg，维生素e 40mg
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60mg三羟甲基氨基甲烷 2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.1g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
78.本发明地方猪精液冷冻保护剂的制备方法，包括如下步骤：
79.步骤一，配制冷冻基础液，冷冻基础液的制备方法为：首先称取三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸和葡萄糖，先将它们在装有80ml双蒸水的烧杯内混合，37℃水浴20min，待上述物质完全溶解并降温后，再取稀释液加入青霉素(0.06g)和硫酸链霉素(0.1g)，加双蒸水定容至 100ml，4℃冰箱保存备用。
80.步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，混匀即得到本发明的一种地方猪精液冷冻保存剂i液。
81.步骤三，在冷冻保存(冷冻保存剂i液)的基础上，添加体积比(质量)为5％的甘油，过滤灭菌，冷却至室温，即可以得到本发明的猪精液冷冻保存剂(冷冻保存剂ii液)，放入4℃冰箱中备用留做以下试验测试。
82.对本发明的中国地方猪精液冷冻保存稀释液使用进行了如下试验：
83.(1)猪精液的采集
84.手握法采精：待公猪爬跨后，对其包皮和周围部分进行清洗消毒，再用生理盐水冲洗并擦干。采精人员带上灭菌乳胶手套，待阴茎从包皮内伸出时立即抓握阴茎的螺旋状龟头，手呈拳状有节奏的对阴茎施加压力，待阴茎充分勃起后，顺势向前牵引引起公猪射精，另一只手用带有4层纱布的集精瓶手采集并过滤精液。
85.(2)猪精液处理与冷冻
86.将检查合格的猪精液样品加入等温等体积的bts液稀释，在17℃的恒温箱中平衡2
‑
3h，同时要每隔20min轻轻晃动精液数次，防止精子因为长时间静置进入假死状态。将平衡后的精液分装到10m l离心管中，在17℃下离心，以2400rcf/min速率离心3min后取出，弃去上清液。
87.采用两步稀释法稀释精液：向离心后的沉积中缓慢加入提前预冷的i液(80％tcg+20％卵黄)，按体积(质量)比为1:2比例稀释，用纱布包裹后放入4 ℃冰箱平衡1.5～2h，使
其缓慢下降到到4℃。然后再等体积缓慢加入预冷过的ii液，并用纱布包裹后在4℃继续平衡1.5～2h。用自制注射器吸取到0.25ml细管内，放到液氮上方3cm 处熏蒸10min，然后转入液氮中保存。
88.(3)猪精子质量评定结果
89.中国地方猪用精液冷冻保护剂以及精液冷冻
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解冻方法，评定结果间表3。
90.表3中国地方猪用精液冷冻保护剂以及精液冷冻
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解冻方法的检测结果
91.处理精子活力线粒体活性顶体完整率畸形率对照组31.30％31.56％30.83％14.08％处理组142.89％33.89％37.20％11.17％处理组245.99％39.75％36.97％11.44％处理组344.45％36.69％38.24％10.46％实施例351.86％45.16％43.67％9.68％
92.(4)细管冻精的解冻和猪精子质量评定
93.1)猪精子活力的测定
94.将细管猪冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻30s，收集于1.5ml离心管内，37℃继续孵育10min，取10μl精液于载玻片上，盖上盖玻片，放置于200
×
倒置显微镜下，在精子密度分析仪中分析猪精子活力。
95.2)猪精子线粒体活性测定
96.猪线粒体活性采用罗丹明123和碘化丙啶(pi)联合染色法来检测。首先吸取100μlhepes/bsa，放置于37℃下预热10min，然后各加入1μl的罗丹明123和1μl的pi，两者充分混匀后在黑暗条件下孵育10min，作为精子染料。取50μl解冻后的精液与100μl配制好的染料充分混匀。放入37℃水浴锅中，避光孵育30min，然后在荧光显微镜下观察猪精子染色情况。pi能够进入猪死精子的细胞核内，与dna结合生成红色荧光，而罗丹明123则可以特异地和线粒体结合发出绿色荧光，因此带有绿色荧光的猪精子被认为具有完整的线粒体。
97.3)猪精子畸形率的测定
98.猪精子畸形率采用吉姆萨染色法检测。将解冻后的猪精液，吸取10ul滴于载玻片的一端，将样品涂抹均匀，风干。将风干后的抹片滴上几滴甲醇，固定2
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3min，风干。将风干后的抹片置于吉姆萨染色缸中，染色30min后用水缓慢冲洗载玻片，置于试验台上待其自然晾干。将制备好的载玻片在400
×
光学显微镜下进行观察，数左、右两个区200个以上的猪精子计算。
99.4)精子顶体完整率的测定
100.取1ml丙酮(事先在—20℃下预冷)中加入500ul猪精液，于4℃固定5min，离心 (500r/min，6min)后弃上清，沉淀经pbs洗2次后用hepes/bsa封闭30min，再加入异硫氰荧光素标记的花生凝集素50ul，于37℃孵育30min，离心(500r/min，6min)，沉淀经pbs 洗2次，取10ul悬液滴于载玻片中央，再滴加少量增光剂，盖片，无色指甲油封片，荧光显微镜下观察和计数。发现顶体完整的猪精子，可见顶体呈绿色荧光且边缘光滑。