黄酮苷类化合物用于抗烟草花叶病毒的应用及其制备方法

1.本发明属于植物保护与植物化学技术领域，具体涉及黄酮苷类化合物用于抗烟草花叶病毒的应用及其制备方法。


背景技术：

2.植物病毒病是植物病害中的“癌症”，是继植物真菌病害后的第二大病害，至今仍未取得重大突破。以宁南霉素为代表的胞嘧啶核苷肽型抗生素虽在烟草花叶病毒病(tobacco mosaic virus,tmv)上取得了登记，但文献报道的治疗效果在30％～60％。因此，以tmv为代表的植物病毒病的防治仍然是我国乃至国际上研究的热点与难点。发现高活性的抗植物病毒先导化合物是从源头上创制植物病毒剂的关键。
3.铁线莲属植物富含三萜皂苷、黄酮苷、木脂素苷等多种活性成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等活性。毛蕊铁线莲clematis lasiandra maxim.是毛茛科铁线莲属的一种常见草质藤本植物，在中国山东东部、辽宁东部均有分布，朝鲜、日本等地也有分布。其根具有祛瘀、利尿、解毒等功效，具有很好的药用价值。发明人在试验过程中，首次从毛蕊铁线莲中提取出3种黄酮苷类化合物，分别为：山奈酚
‑3‑
o
‑
α
‑
鼠李糖苷(化合物i)、异牡荆素6
”‑
o
‑
e
‑
p
‑
香豆酸(化合物ii)和槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
葡萄糖醛酸(化合物iii)，其结构式具体见具体实施方式记载。
4.目前已有文献报道这三者化合物在医学领域具有显著的抗病毒活性，如文献“zhou zl,yin wq,zou xp,huang dy,zhou cl,li lm,chen kc,guo zy,lin sq.flavonoid glycosides and potential antivirus activity of isolated compounds from the leaves of eucalyptus citriodora.j korean soc appl biol chem(2014)57(6),813
‑
817.”报道了化合物i在医学领域具有抑制呼吸道合胞病毒；文献“du z
‑
z,yang xw,han h,cai x
‑
h,luo xd.a new flavone c
‑
glycoside from clematis rehderiana.molecules 2010,15,672
‑
679.”中报道了化合物ii具有抗氧化活性；文献“veljkovic v,mouscadet j f,veljkovic n,et al.simple criterion for selection of flavonoid compounds with anti
‑
hiv activity[j].bioorganic&medicinal chemistry letters,2007,17(5):1226
‑
1232.”中报道了化合物iii具有抗hiv等作用，但未见其在植物抗病毒方面的应用。


技术实现要素：

[0005]
基于上述目的，本发明提供了上述三种黄酮苷类化合物(i、ii、iii)用于抗烟草花叶病毒的应用及新的制备方法，具有抗tmv活性和诱导寄主对tmv产生系统抗病性的能力，可广泛应用于制备抗烟草花叶病毒防控剂和抗烟草花叶病毒免疫诱抗剂。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
[0007]
本发明公开了以下三种黄酮苷类化合物用于抗烟草花叶病毒的应用，所述黄酮苷类化合物为化合物i、化合物ii、化合物iii中的任一种，
[0008][0009]
具体的，所述黄酮苷类化合物作为烟草花叶病毒防控剂或抗烟草花叶病毒免疫诱抗剂。
[0010]
本发明还公开了上述黄酮苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
步骤1，采集新鲜毛蕊铁线莲，干燥、粉碎，粉碎物用溶剂冷浸提取，所述溶剂为乙醇或甲醇，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，提取液合并浓缩，得到提取物；
[0012]
步骤2，将提取物分散于水中，调制呈混悬状态，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0013]
步骤3，所述乙酸乙酯萃取物进行正相梯度洗脱，洗脱剂包括二氯甲烷和甲醇，其中，二氯甲烷和甲醇的体积比为100：1～1：1，获得馏分1；
[0014]
所述正丁醇萃取物通过正相柱层析，洗脱剂包括二氯甲烷、甲醇和水，所述二氯甲烷、甲醇、水的体积比为100：1：0～1：1：0.5，得馏分3；
[0015]
步骤4，馏分1通过正相柱层析，洗脱剂依次为石油醚和二氯甲烷，最终得馏分2；
[0016]
步骤5，对馏分2和馏分3分别进行凝胶柱层析，洗脱剂包括二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1；馏分2对应得到化合物i和化合物ii，馏分3对应得到化合物iii。
[0017]
优选的，所述步骤1中冷浸提取时毛蕊铁线莲的粉碎物与甲醇或乙醇的体积比为1：2～1：3。
[0018]
优选的，粉碎后的毛蕊铁线莲过30～50目筛，得到粉碎物。
[0019]
优选的，所述步骤2中，萃取过程具体为：先用石油醚萃取2～3次，再将石油醚萃取后的下层液用乙酸乙酯萃取3～4次，最后将乙酸乙酯萃取后的下层液用正丁醇萃取3～5次。
[0020]
优选的，所述步骤2中石油醚、乙酸乙酯、正丁醇的体积与分散于水中的提取物的体积比均为1:1。
[0021]
优选的，所述步骤3中正相梯度洗脱采用普通硅胶或diol填料。
[0022]
优选的，所述步骤5中凝胶柱层析采用葡聚糖凝胶sephadex lh
‑
20填料。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0024]
(1)本发明公开了三种黄酮苷类化合物对tmv表现出了良好的钝化、保护和治疗效果，经过实验发现，这三种化合物对tmv的钝化效果均优于商品药剂宁南霉素，另外，化合物ii在普通烟草上对tmv的系统抗性效果优于宁南霉素；可作为植物源抗病毒剂与植物免疫诱抗剂。
[0025]
(2)本发明还给出了一种从毛蕊铁线莲中提取这三种化合物的方法，本发明提取
方法减少了乙醇的使用量，节约了成本，同时也具有更好的环境相容性。
附图说明
[0026]
图1所示为实施例2中化合物i、化合物ii、化合物iii、宁南霉素在新叶烟上对tmv的钝化效果图，其中，(a)图为化合物i，(b)图为化合物ii，(c)图为化合物iii，(d)图为宁南霉素。
具体实施方式
[0027]
本发明中，“防控剂”是用于直接与病毒作用产生抗病毒效果，“免疫诱抗剂”是用于诱导植物产生抗体。
[0028]
本发明提出三种黄酮苷类化合物i、化合物ii、化合物iii中的任一种可用于抗烟草花叶病毒的应用，化合物i为山奈酚
‑3‑
o
‑
α
‑
鼠李糖苷、化合物ii为异牡荆素6
”‑
o
‑
e
‑
p
‑
香豆酸、化合物iii为槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
葡萄糖醛酸，其结构式分别为：
[0029][0030]
上述三种化合物可通过现有方法提取或合成，优选本发明提供的以下方法，具体包括以下步骤：
[0031]
步骤1，采集新鲜毛蕊铁线莲，干燥、粉碎，粉碎物用溶剂冷浸提取，溶剂为60％～80％的乙醇或60％～80％的甲醇，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，提取液合并浓缩，得到提取物；
[0032]
冷浸提取时毛蕊铁线莲的粉碎物与甲醇或乙醇的体积比为1：2～1：3。
[0033]
步骤2，将提取物分散于水中，调制呈混悬状态，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0034]
本步骤中的乙酸乙酯萃取物是指依次用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到的浓缩物，正丁醇萃取物是指依次用石油醚、乙酸乙酯、经正丁醇萃取后得到的萃取物。
[0035]
萃取时，优选的先用石油醚萃取2～3次，再将石油醚萃取后的下层液用乙酸乙酯萃取3～4次，最后将乙酸乙酯萃取后的下层液用正丁醇萃取3～5次。优选的，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇的体积与分散于水中的提取物的体积比均为1:1。
[0036]
步骤3，乙酸乙酯萃取物进行正相梯度洗脱，洗脱剂包括二氯甲烷和甲醇，其中，二氯甲烷和甲醇的体积比为100：1～1：1，得馏分1。本发明的具体实施例中，在二氯甲烷：甲醇的体积比为10：1洗脱时可检测出馏分1，而其他体积比例用于去除杂质。
[0037]
正丁醇萃取物通过正相柱层析，洗脱剂包括二氯甲烷、甲醇和水，其中，二氯甲烷、甲醇、水的体积比为100：1：0～1：1：0.5，得馏分3。同样，本发明的具体实施例中，当二氯甲
烷：甲醇：水的体积比为8：2：0.2洗脱时得馏分3，其他体积比例用于去除杂质。
[0038]
步骤4，将馏分1通过正相柱层析，洗脱剂依次为石油醚和二氯甲烷，即馏分1依次经过石油醚、二氯甲烷进行洗脱，最终得馏分2；其中石油醚用于除去脂溶性杂质。
[0039]
步骤5，对馏分2和馏分3分别进行凝胶柱层析，洗脱剂包括二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1；
[0040]
最终馏分2对应得到化合物i和化合物ii，馏分3对应得到化合物iii。
[0041]
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本技术技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
[0042]
下述实施例中，所使用的乙醇、甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮均为市售，乙醇为工业纯，其余为分析纯。
[0043]
实施例1
[0044]
本实施例公开了三种黄酮苷类化合物i、化合物ii、化合物iii的制备方法，具体包括以下步骤：
[0045]
步骤1：新鲜采集的毛蕊铁线莲地上部分阴干后，用植物粉碎机粉碎，过40目筛，用60％～80％乙醇冷浸提取，毛蕊铁线莲粉碎物与乙醇的体积比为1：2～3，每4～7天更换一次溶剂，共提取3～4次，最后合并浓缩，得到粗提物。
[0046]
步骤2：将粗提物分散于水中，调制呈混悬状态，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3～4次，合并萃取物、减压浓缩得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。
[0047]
步骤3：乙酸乙酯萃取物上正相硅胶柱层析，用二氯甲烷：甲醇按体积比为100：1～1：1的比例进行梯度洗脱，得馏分1；
[0048]
正丁醇萃取物用二氯甲烷：甲醇：水按体积比为100：1：0～1：1：0.5的比例进行梯度洗脱，得馏分3。
[0049]
步骤4：馏分1继续上正相硅胶柱，分别用石油醚和二氯甲烷依次进行梯度洗脱，二氯甲烷洗脱时得馏分2。
[0050]
步骤5：馏分2上sephadex lh
‑
20葡聚糖凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按照体积比为1：1混合的混合物，得化合物i和化合物ii；
[0051]
馏分3也上sephadex lh
‑
20葡聚糖凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇按照体积比为1：1混合的混合物，得化合物iii。
[0052]
以下对三种化合物进行波谱分析，三种化合物的波谱鉴定数据分别如表1、表2和表3所示。
[0053]
表1.化合物i在氘代甲醇中的1h nmr(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)
[0054][0055]
表2.化合物ii在氘代甲醇中的1h nmr(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)
[0056]
[0057][0058]
表3.化合物iii在氘代甲醇中的1h nmr(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)
[0059]
[0060][0061]
化合物i的核磁共振氢谱和碳谱数据(表1)与文献“何红平，朱伟明，沈月毛，杨小生，左国营，郝小江.小叶臭黄皮的黄酮甙成分.云南植物研究，2001,23:256
–
260.”中报道的山奈酚
‑3‑
o
‑
α
‑
鼠李糖苷的波谱数据一致，鉴定化合物i为山奈酚
‑3‑
o
‑
α
‑
鼠李糖苷。
[0062]
化合物ii的核磁共振氢谱和碳谱数据(表2)与文献“du zz,yang xw,han h,cai xh and luo xd.a new flavone c
‑
glycoside from clematis rehderiana.molecules,2010,15:672
–
679”中报道的异牡荆素6
”‑
o
‑
e
‑
p
‑
香豆酸一致，故鉴定化合物ii为异牡荆素6
”‑
o
‑
e
‑
p
‑
香豆酸。
[0063]
化合物iii的hresims(+)m/z 479.0802[m+h]
+
(calcd for c
21
h
19
o
13
,479.0826)，501.0622[m+na]
+
(calcd for c
21
h
18
o
13
na,501.0645)提示化合物的分子式为c
21
h
18
o
13
，其核磁共振氢谱和碳谱数据(表3)与文献“rolando cand kajjout m.regiospecific synthesis of quercetin o
‑
β
‑
d
‑
glucosylated and o
‑
β
‑
d
‑
glucuronidated isomers.tetrahedron,2011,67:4731
–
4741.”中报道的槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
葡萄糖醛酸一致，故鉴定化合物iii为槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
葡萄糖醛酸。
[0064]
三种化合物的结构式分别如下式所示：
[0065][0066]
实施例2
[0067]
本实施例对实施例1制备的三种化合物进行抗tmv活性实验：
[0068]
采用半叶枯斑法，以宁南霉素为阳性对照，测试了化合物i、化合物ii、化合物iii在新叶烟nicotiana glutinosa l.上对tmv的钝化、保护和治疗效果，具体结果见表4。
[0069]
表4.三种化合物在新叶烟n.glutinosa上对tmv的抗病毒活性
[0070][0071]
表4中，宁南霉素为阳性对照，同一行数值不同字母a、b、c、ab表示经duncan’s新复极差法检验，在p<0.05水平上的差异显著。
[0072]
图1所示为化合物i、化合物ii、化合物iii在新叶烟上对tmv的钝化效果，优于商品药剂宁南霉素。图1的a、b、c、d图中叶片的左侧为不同药剂(化合物i、化合物ii、化合物iii、宁南霉素)处理后的结果，叶片的右侧为清水对照。
[0073]
结合表4和图1的结果可以看出，在500μg/ml浓度下，化合物i、化合物ii、化合物iii对tmv的钝化效果为64.62％～82.54％。其中，钝化活性是评价药剂抗tmv活性的一项非常重要的指标，是进行抗tmv活性药剂筛选的重要手段。
[0074]
化合物i、化合物ii对tmv的保护效果和治疗效果分别为57.44％～59.00％和41.17％～43.92％，保护效果与治疗效果几乎与宁南霉素相当。化合物iii的保护效果与治疗效果低于宁南霉素，效果较一般。
[0075]
实施例3
[0076]
本实施例对实施例1制备的三种化合物进行系统抗病性实验：
[0077]
以宁南霉素为阳性对照，测试了化合物i、化合物ii、化合物iii在新叶烟n.glutinosa和普通烟草nicotiana tabacum cv.k326(k326)上对tmv的系统抗病效果。
[0078]
三种化合物诱导新叶烟n.glutinosa对tmv的抗性效果见表5。
[0079]
表5.三种化合物诱导新叶烟n.glutinosa对tmv的抗性效果
[0080]
[0081][0082]
表5中，宁南霉素为阳性对照，同一行数值不同字母a、b、ab表示经duncan’s新复极差法检验，在p<0.05水平上的差异显著。
[0083]
表5结果表明，化合物i、化合物ii在500μg/ml浓度下，在新叶烟上对tmv的抗性效果分别为43.98％和41.20％，效果略低于宁南霉素。
[0084]
表6.三种化合物诱导普通烟草k326对tmv的抗性效果
[0085][0086]
表6中，宁南霉素为阳性对照，同一行数值不同字母a、b、c、ab等表示经duncan’s新复极差法检验，在p<0.05水平上的差异显著。
[0087]
表6所示为三种化合物诱导普通烟草k326对tmv的抗性效果，结果表明：化合物ii在125～500μg/ml浓度下，在普通烟草k326上对tmv的抗性效果分别为30.64％～44.77％，效果优于商品药剂宁南霉素，可开发为植物免疫诱抗剂。
[0088]
综合以上实验结果，化合物i、化合物ii、化合物iii在新叶烟n.glutinosa和普通烟草k326上对tmv具有显著的抗病毒效果，作用方式涉及钝化、保护和治疗，且可引起寄主对tmv产生系统抗病性。因此，可作为有效成分用于开发植物抗病毒剂和植物免疫诱抗剂。