一种利用微生物菌剂处理提高小麦对铜胁迫耐受性的方法

1.本发明涉及环境生物修复技术领域，具体涉及一种利用微生物菌剂处理以提高小麦对铜胁迫耐受性的方法。


背景技术：

2.铜是植物的必需痕量元素，它作为许多酶的辅助因子，参与了植物生长和发育过程中的各种代谢生理过程，包括光合作用、反应性氧代谢和激素信号传导等。然而在过去几十年中，随着铜矿开采、污水灌溉和含铜杀真菌剂的广泛使用，越来越多的铜进入土壤而导致严重的铜污染。一项国家调查显示铜是农田的主要污染物之一，中国2.1％的土壤受到铜的污染。过量的铜会对植物产生很多不良的影响，包括种子萌发率的降低、根系和芽的发育不良、矿物质养分的缺乏、氧化应激和dna损伤等，这些不良反应会导致作物收益减少并阻碍可持续农业的生产。因此，铜污染对作物的生长和粮食安全已经构成了重大威胁，是一个广受关注的环境和农业问题。
3.镁是植物细胞中含量最高的游离二价阳离子，是叶绿素的重要组成成分，是植物体内多种酶的活化剂，参与植物的多种生理过程如光合作用，对于植物的生长和发育过程有重要意义。而除了超镁铁岩石风化形成的蛇纹石土壤中生长的植物容易受到过量镁毒害，在全球范围内暂未发现广泛发生的土壤镁污染情况，相比于土壤镁过量，镁缺乏是一个更广泛存在并受到关注的问题。有研究表明，镁离子能降低铜离子对小麦根部的毒性。
4.小麦是全世界各地广泛种植的主食作物。据报道，由于受污染土壤中含有过量的铜，小麦产量大大降低。为了减轻甚至避免包括小麦在内的植物中的铜毒性，研究发现部分微生物可以保护植物免受生物和非生物胁迫(包括重金属污染)并促进植物生长，这些微生物称为植物生长促进细菌，已被用作生物制剂以增强包括小麦等植物的金属耐受性，它们被广泛应用于土壤修复，且多项研究表明根际微生物在调节作物生长和抗逆性方面起着重要作用。有研究表明bacillus sp.通过提高sod、cat和pod的活性，降低超氧化物基团和h2o2，来降低小麦种子中的铜毒性。因此，特殊细菌的应用可以提供一种缓解土壤或水体植物铜毒害的有效措施。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用微生物菌剂处理来降低土壤或水体环境铜离子污染对小麦毒害作用的方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供了保藏号为cctcc no:m 2016754的嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh在调控小麦对铜胁迫耐受性中的应用。
8.进一步的，所述应用包括：将嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh与小麦共培养，提升小麦对铜离子胁迫的耐受能力。
9.本发明研究表明，嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh与小麦共培养，可以
显著消减铜胁迫对小麦植株尤其发芽及幼苗期所受铜毒害作用。
10.进一步的，所述共培养包括：先将嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh发酵培养后制得发酵菌液，再将发酵菌液加入到铜离子污染的小麦培育土壤或水体中，与小麦进行共培养。
11.进一步的，嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh发酵培养的方法包括：先将kocuria rosea的细胞接种到种子培养基中旋转培养至od
600
＝0.8
‑
1.0；之后将kocuria rosea的种子培养物转移到发酵培养基中旋转培养至od
600
＝2.5
‑
3.0；
12.所述种子培养基组成包括：酪蛋白水解物5g/l，柠檬酸钠10g/l，酵母提取物3g/l，kcl 2g/l，蛋白胨5g/l，硫酸镁10g/l，ph 7.0；
13.所述发酵培养基组成包括：酪蛋白水解物3
‑
7g/l，柠檬酸钠5
‑
15g/l，酵母提取物1
‑
5g/l，氯化钾0
‑
8g/l，蛋白胨3
‑
8g/l，硫酸镁3
‑
80g/l，ph 6.8
‑
7.2。
14.所述种子培养基和发酵培养基的旋转培养条件均为：20
‑
25℃、100
‑
150rpm培养36
‑
60h。
15.所述发酵菌液的添加量为30
‑
40l/m3。
16.进一步的，将预发芽的小麦种子接种于含有嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh的培育基质中进行共培养。
17.小麦种子预发芽方法包括：将干燥保存的小麦种子用次氯酸钠消毒，接种到浸泡有ms培养基的纱布中(放到无菌培养皿中)进行预发芽。
18.所述次氯酸钠的浓度为3％；所述消毒时间为5min；所述小麦种子接种后进行预发芽的时间为48h。
19.所述共培养的条件为20
‑
25℃、48
‑
52％相对湿度，5800
‑
6200lux光照强度，12h/12h明暗循环。
20.进一步的，本发明针对嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh提升小麦对铜离子胁迫耐受能力的作用机制进行研究，结果表明，一方面，嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh通过增强小麦对镁离子的吸收来抵御铜胁迫的毒性作用；另一方面，嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh促进小麦的抗氧化作用来抑制铜胁迫的毒性作用，具体的，所述抗氧化作用为降低小麦根部h2o2含量、提高小麦根部谷胱甘肽(gsh)含量、提高小麦根部过氧化物酶(pod)活性中的一种或多种。
21.本发明具备的有益效果：
22.本发明首次公开嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh在提高小麦对铜胁迫耐受能力方面的用途，具体的，通过微生物菌剂与小麦共培养，可以减缓土壤或水体中的铜离子污染对小麦发芽及其幼苗的毒害作用，能够提高铜胁迫下小麦的根系干生物量和谷物产量。本发明提供了一种利用微生物菌剂处理以提高小麦对铜胁迫耐受性的方法，操作简单、成本低廉、环境友好，为缓解土壤对小麦铜毒害提供了一项有效措施。
附图说明
23.图1为不同cu
2+
浓度下小麦幼苗的生长情况。
24.图2为不同cu
2+
浓度下小麦幼苗芽和根的长度。
25.图3为不同cu
2+
浓度下kocuria rosea的细胞存活情况。
26.图4为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗生长的影响，其中kr
‑
表示不加kocuria rosea的共培养组，kr+表示加入kocuria rosea的共培养组，下同。
27.图5为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗芽和根长度的影响。
28.图6为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗芽和根干重的影响。
29.图7为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗芽和根中铜含量的影响。
30.图8为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗芽和根中镁含量的影响。
31.图9为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗根h2o2含量的影响。
32.图10为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗根gsh含量的影响。
33.图11为100μmol/l cu
2+
下kocuria rosea对小麦幼苗根pod活性的影响。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
35.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
36.嗜盐玫瑰色库克菌(kocuria rosea)zjuqh分离自青海茶卡盐湖，于2016年12月15日保藏于位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m 2016754。申请号为201710077208.7的中国专利公开了该菌株。
37.菌株培养基
38.初始斜面培养基组成包括：酪蛋白水解物5g/l，柠檬酸钠10g/l，酵母提取物3g/l，氯化钾2g/l，蛋白胨5g/l，硫酸镁10g/l，琼脂20g/l，ph 7.0。
39.种子培养基组成包括：酪蛋白水解物5g/l，柠檬酸钠10g/l，酵母提取物3g/l，kcl 2g/l，蛋白胨5g/l，硫酸镁10g/l，ph 7.0。
40.液体发酵培养基组成包括：酪蛋白水解物3
‑
7g/l，柠檬酸钠5
‑
15g/l，酵母提取物1
‑
5g/l，氯化钾0
‑
8g/l，蛋白胨3
‑
8g/l，硫酸镁3
‑
80g/l，ph 6.8
‑
7.2。
41.小麦种子来自浙江大学农业与生物技术学院功能型农业生物技术实验室。小麦采用液体培养，使用不含琼脂的ms培养基，装入480ml组培瓶高压灭菌后方可接种。
42.ms培养基组成包括：磷酸二氢钾170mg/l，硫酸镁370mg/l，二水氯化钙440mg/l，硝酸钾1900mg/l，硝酸铵1650mg/l，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，硫酸锰22.3mg/l，硫酸锌8.6mg/l，钼酸钠0.25mg/l，硫酸铜0.025mg/l，氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，硫酸亚铁27.8mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，烟酸硫胺素0.1mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l。
43.实施例1小麦幼苗对铜离子胁迫的耐受能力
44.1、小麦种子培养条件：将干燥保存的种子用3％次氯酸钠消毒5min后，接种到浸泡有ms培养基的纱布中(放到无菌培养皿中)48h进行预发芽，然后接种到灭菌后装有150ml ms培养基的480ml组培瓶。
45.2、在480ml组培瓶配置含不同浓度铜离子的ms培养基：0、10、100、200、400μmol/l，将预发芽后的种子接种到组培瓶中，于戳孔了的滤纸片之上，每瓶接种十粒种子，每组做3
个平行。在培养箱内培养，条件为22
±
0.5℃、50
±
3％相对湿度，6000lux光照强度，12h/12h明暗循环，培养一周，每3天换一次营养液(ms培养基)。培养一周后测量小麦根和芽的长度，结果如图1和2所示。
46.由图1和2可知，随着铜离子浓度的增加，小麦幼苗的生长受到了明显的抑制，与对照组(不添加额外的铜离子)相比，暴露于100μmol/l及以上的cu
2+
显著降低了小麦幼苗根和芽的长度，而在400μmol/l浓度下小麦种子则无法正常发芽。由于200μmol/l条件下也有一定数量的种子未发芽，为了数据可靠性，且100μmol/l的cu
2+
浓度已经有明显的抑制作用，因此选取100μmol/l作为后续实施例的铜离子胁迫浓度。
47.实施例2 kocuria rosea对铜离子胁迫的耐受能力
48.1、菌种培养条件：将来自斜面培养的kocuria rosea的细胞接种到250ml锥形瓶中的100ml新鲜种子培养基中，并在25℃、130rpm下在旋转摇床上培养36
‑
60h。然后将5％(v/v)的种子培养物转移到250ml锥形瓶中的100ml发酵培养基中，在130rpm的旋转摇床上25℃培养36
‑
60h。
49.2、将5％(v/v)的种子培养物接种到分别添加0、100、400、1000、2000、4000μmol/l cuso4的发酵培养基中，25℃培养72h，测定用cck
‑
8试剂盒测定各浓度cu
2+
下的细胞存活情况，以0μmol/l cuso4添加量组为对照。
50.由图3可知，当cu
2+
浓度低于400μmol/l时，kocuria rosea的细胞存活随着cu
2+
浓度的增加而稍有提升；kocuria rosea在100和400μmol/l cu
2+
浓度下还是可以保持较好的生存状态的。当cu
2+
浓度继续提高，kocuria rosea的生存则受到明显抑制，当cu
2+
浓度达到4000μmol/l时kocuria rosea的细胞存活率降低至对照组的35.7％。
51.实施例3铜离子胁迫下kocuria rosea对小麦幼苗生长的影响
52.1、水体共培养条件：选取合适的铜离子胁迫浓度，取5ml培养48h的菌液加到接种组组培瓶ms培养基中，对照组接种等量不含菌种的已灭菌发酵培养基，将预发芽后的种子接种到组培瓶中，于戳孔了的滤纸片之上，每瓶接种十粒种子，每组做3个平行。在培养箱内培养，条件为22
±
0.5℃、50
±
3％相对湿度，6000lux光照强度，12h/12h明暗循环，培养一周，每3天换一次营养液(ms培养基)。
53.2、选择100mm为铜离子胁迫浓度，实验组按上述方法接种菌液和小麦种子，对照组接种等量的空白发酵培养基。培养一周后，测量小麦根和芽的长度以及干重，结果如图4、5和6所示。
54.由图可知，暴露于100μmol/l的铜胁迫，添加了kocuria rosea的共培养组相比对照组，生长状态有明显的改善，小麦幼苗芽和根的长度分别增长95.73％和48.26％，干重分别增加59.69％和78.41％，说明kocuria rosea对小麦幼苗受到的铜毒性具有较好的减缓作用。
55.实施例4铜离子胁迫下kocuria rosea对小麦幼苗芽和根中铜和镁离子含量的影响
56.根据实施例3的实验操作进行培养，在80℃下干燥过夜后，每个样品根和芽取0.2g，用55ml hno3‑
h2o2混合物(v/v 8：3)用微波消解器在180℃下消解1h，然后使用消解液通过等离子体质谱仪测量铜和镁的离子水平。根据标品计算组织中cu
2+
和mg
2+
的含量，并以μg/g
·
dw表示，结果如图7和8所示。
57.由图可知，暴露于100μmol/l的铜胁迫，添加了kocuria rosea的共培养组相比对照组，芽和根的cu
2+
含量没有显著变化，而mg
2+
的含量有明显的提高，说明kocuria rosea可能通过增强小麦幼苗对mg
2+
的吸收来抵御铜胁迫的毒性作用。
58.实施例5铜离子胁迫下kocuria rosea对小麦幼苗根部h2o2含量的影响
59.根据实施例3的实验操作进行培养，使用过氧化氢(h2o2)含量检测试剂盒。根据说明书，称取0.1g小麦根组织，加入1ml丙酮进行冰浴匀浆，于8000rpm、4℃离心10min，收集所有上清液置冰上待测。使用分光光度计，检测波长为415nm，标准溶液为1μmol/ml h2o2。
60.h2o2含量(μmol/g质量)＝＝δa测定
÷
δa标准
÷
w
61.δa测定＝a测定管
‑
a空白管，δa标准＝a标准管
‑
a空白管
62.由图9可知，在100μmol/l cu
2+
胁迫下kocuria rose使小麦种子根中h2o2含量降低了30.14％，说明kocuria rosea可以降低小麦幼苗根中h2o2含量，有利于小麦清除ros以抵御铜胁迫引起的氧化损伤。
63.实施例6铜离子胁迫下kocuria rosea对小麦幼苗根部gsh含量的影响
64.根据实施例3的实验操作进行培养，使用谷胱甘肽(gsh)测定试剂盒。根据说明书，称取0.1g小麦根组织，加入0.9ml生理盐水进行冰浴匀浆，于8000rpm、4℃离心10min，收集所有上清液置冰上待测。使用分光光度计，检测波长为420nm。
65.由图10可知，在100μmol/l cu
2+
胁迫下kocuria rosea使小麦种子根中gsh含量提高了45.96％，说明kocuria rosea的接种可能通过刺激小麦幼苗体内gsh的生成以抑制cu
2+
的毒性作用。
66.实施例7铜离子胁迫下kocuria rosea对小麦幼苗根部pod活性的影响
67.根据实施例3的实验操作进行培养，使用过氧化物酶(pod)测试盒。根据说明书，称取0.1g小麦根组织，加入0.9ml生理盐水进行冰浴匀浆，于8000rpm、4℃离心10min，收集所有上清液，置冰上待测。使用分光光度计，检测波长为420nm。
68.由图11可知，在100μmol/l cu
2+
胁迫下kocuria rosea使小麦种子根中pod活性增强了83.86％，说明kocuria rosea处理可以提高小麦幼苗根中pod活性，有利于小麦清除ros以抵御铜胁迫引起的氧化损伤。