一种食蟹猴肥胖症模型的建立方法及其应用与流程

1.本发明涉及非人灵长类实验动物疾病模型技术领域，具体涉及一种食蟹猴肥胖症模型的建立方法及其应用。


背景技术：

2.肥胖症是指机体脂肪总含量过多和/或局部含量增多及分布异常，是由遗传和环境等因素共同作用而导致的慢性代谢性疾病。临床上采用体重指数(bmi)作为判断肥胖症的常用简易指标。根据《中国成人超重和肥胖症症预防控制指南》的标准，bmi(kg/m2)≥28.0诊断为肥胖症。肥胖症病因复杂，是遗传因素、环境因素等多种因素相互作用的结果。按发病机制及病因，肥胖症可分为单纯性和继发性两大类。单纯性肥胖症又可分为体质性肥胖症(幼年起病性肥胖症)和获得性肥胖症(成年起病性肥胖症)。此外，依据脂肪积聚部位肥胖症尚可分为中心型肥胖症(腹型肥胖症)和周围型肥胖症(皮下脂肪型肥胖症)。肥胖症患者常合并血脂异常、脂肪肝、高血压、糖耐量异常或糖尿病，还可伴随或并发阻塞性睡眠呼吸暂停、胆囊疾病、胃食管反流病、高尿酸血症和痛风、骨关节病、静脉血栓、生育功能受损(女性出现多囊卵巢综合征，男性多有阳痿不育、类无睾症)及社会和心理问题。肥胖症症患者某些肿瘤(女性乳腺癌、子宫内膜癌，男性前列腺癌、结肠和直肠癌等)发病率增高，且麻醉或手术并发症增多。近年来，随着超重和肥胖症患病率的迅速攀升，肥胖症问题已成为中国公共卫生的主要问题之一。2020年中国居民营养与慢性病状况报告显示，城乡各年龄组居民超重/肥胖症率继续上升，有超过二分之一的成年居民超重或肥胖症，6
‑
17岁、6岁以下儿童青少年超重/肥胖症率分别达到19％和10.4％。2019年，超重和肥胖症导致的死亡在非传染性疾病相关死亡中占比11.1％。超重和肥胖症相关的年均医疗花费高达243.5亿元人民币。目前中国减重药物种类单一，仅有奥利司他获批用于肥胖症治疗。然而，胃肠道不良反应和脂溶性维生素吸收障碍，限制了该药的广泛使用。此外，奥利司他的长期心血管风险尚不明确。因此市场迫切需要更多副作用更小的新药来缓解超重和肥胖症对人们健康的威胁。
3.为了减轻超重和肥胖症在人群中愈演愈烈的流行趋势，人们迫切需要更安全、更有效的防治手段，建立良好的肥胖症动物模型是开展相关研究的前提。非哺乳动物,如斑马鱼、线虫、果蝇等,应用于肥胖症模型的研究具备全寿命周期短和高通量分析两大优势。这两点有利于研究肥胖症在遗传过程中的作用机制和全基因组数据库。但是它们独特的生理和解剖结构限制了该类模型在转化医学研究中的价值。哺乳动物中啮齿类，包括大鼠和小鼠，是研究代谢紊乱最广泛使用的临床前动物模型。与非哺乳动物相比，作为哺乳动物的小鼠和大鼠生理机能更接近于人类。近几十年来，60％的临床前动物研究是在小鼠模型上进行的。大量靶向或非靶向突变基因编辑工具可在小鼠上实现单核苷酸置换到染色体重排，有利于分析某些特定基因在肥胖症机制中的作用。此外，啮齿类动物体型小，繁殖率高(一只鼠每窝可产出大约6
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12只幼崽)，繁殖周期较短(出生后4
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8周内达到性成熟，妊娠期3周)，这些特征使其成为研究人员的经济选择。大动物模型(如狗、猪)在代谢研究中使用历
史悠久，其较大的体型便于进行慢性插管等复杂的实验操作。大动物一些组织器官(如胰腺和胰岛)及其生理机能特征比啮齿类更接近人类，因此借助于大动物肥胖症模型所取得的研究结论也更加接近于肥胖症患者的真实情况。近年来，对基因编辑猪的研究水平几乎接近啮齿类，这进一步拓展了大型动物在肥胖症基因研究中的作用。此外，大动物的药代动力学特征也更接近人类。因此，大动物模型的研发受到越来越多的关注。
4.非人灵长类动物在遗传信息和生理结构等方面最接近人类。例如，非人灵长类肝脏中的脂肪从头合成、脂蛋白亚类循环、生理产热、胰岛素介导的降糖作用等代谢机制与人类非常相似。高胰岛素
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正常血糖钳夹、糖耐量和间接测热法三种方式主要用于人体代谢水平评估的方式，同样适用于非人灵长类动物模型。非人灵长类动物的解剖结构也与人类接近，使其便于采血、内镜活检、腹腔镜取样和影像学检查。随着年龄增长，部分圈养的非人灵长类可自发肥胖症，其发病过程和病理改变与肥胖症患者极为相似。动物实验中，一般采用高脂和高果糖饮食来加速病理性肥胖症的进展，缩短研究时间。例如，恒河猴在标准饮食基础上，每日额外摄入高果糖饮料持续一年时间，可诱发体重增加、脂肪储积、甘油三酯升高、hdl降低等代谢综合征的表现，然而，高脂饲料油腻且适口性差，啮齿类动物食用高脂饲料尚可进行，但也会由于饲料硬度不足导致动物不喜食，且高脂饲料在长期试验中保存条件高，否则容易发霉变质。更为重要的是，这种喂食方法常常导致动物出现严重的肝脏损伤。有文献报道，自发性肥胖症恒河猴模型的诊断标准为bmi≥40kg/m2。但是，食蟹猴体型明显小于恒河猴，肥胖症恒河猴模型诊断标准并不适于食蟹猴。目前，对食蟹猴肥胖症模型诊断标准并没有明确报道。总之，建立非人灵长类动物模型对新型疗法的评估有重要意义。


技术实现要素：

5.目前，用于建立啮齿类肥胖症动物模型的主要方法是通过高果糖高脂肪饮食喂养或自发形成。然而，这种方法得到的动物模型不符合人类肥胖症的真实发病机制和慢性发病过程。更糟糕的是，由于动物(尤其是非人灵长类动物)厌恶高脂饮食且容易出现腹泻脱肛，造成模型的成功率低；高果糖饮食常常引起动物出现严重的肝损伤；自发性模型成模率低。这些缺陷严重阻碍了非人灵长类肥胖症动物的研发。因此，本发明的目的是提供一种食蟹猴肥胖症模型的建立方法，该方法通过喂食温和饲料，得到了更加接近人类状态的肥胖症模型。
6.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种食蟹猴肥胖症模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：
7.(1)选择年龄为12
‑
21岁雄性食蟹猴；
8.(2)每日喂养四次，第一次喂养含糖饲料，第二次喂养辅食，第三次喂养青料，第四次喂养含糖饲料；
9.(3)按照步骤(2)的方式喂养一年后，检测相应的指标，筛选出bmi＞16.95kg/m2，体重＞9.3kg、腰围＞45cm的食蟹猴；
10.其中，所述喂养辅食为红糖块和饼干交替投喂，每三天交替一次；
11.所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖混合得到。
12.优选地，所述含糖饲料中红砂糖的含量为10
‑
15重量％。
13.优选地，所述常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉。
14.优选地，所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水；
15.优选地，所述饼干的成分包含麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料。
16.优选地，所述第一次喂养含糖饲料的投喂重量为120克；
17.优选地，所述第一次喂养含糖饲料的时间为7：30
‑
8：00。
18.优选地，在辅食喂养中，投喂红糖块时的投喂重量为30克，投喂饼干时的投喂重量为25克；
19.优选地，所述第二次喂养辅食的时间为12：00
‑
12：30。
20.优选地，所述第三次喂养青料的投喂重量为100克；
21.优选地，所述第三次喂养青料的时间为14：00
‑
14：30。
22.优选地，所述第四次喂养含糖饲料的投喂重量为120克；
23.优选地，所述第四次喂养含糖饲料的时间为17：00
‑
17：30。
24.本发明第二方面提供上述食蟹猴肥胖症模型的建立方法在肥胖症治疗中的应用。
25.优选地，将所述方法构建的食蟹猴肥胖症模型用于发现肥胖症的治疗药物。
26.在本发明中，采用温和的喂养方法建立食蟹猴肥胖症模型，可用于肥胖症新药研发过程中的药效评估。目前报道的方法主要通过喂食高果糖高脂肪饮食得到啮齿类肥胖症模型，但是模型的成功率低、且存在肝损伤等副作用。与此相比，本发明所建立的肥胖症食蟹猴模型的主要优点是：
27.1.本发明使用的饲料中，脂肪添加量非常低且不含胆固醇，避免了高脂喂养时动物厌食的弊端以及高果糖喂养引起的肝损伤。
28.2.本发明建立的模型是食蟹猴模型，食蟹猴的遗传背景和生理结构与人类具有高度同源性，能自发发展成肥胖且症状与人类的症状高度相似。
29.3.本发明采用温和的含糖饲料、红糖块和饼干饲养替传统的高果糖饲养，避免了果糖长期喂养对肝脏的损伤作用。
附图说明
30.图1是测试例1中实施例1得到的食蟹猴模型和对比例1中喂养后的食蟹猴的年龄、体重、体长、bmi水平、腰围比较结果示意图。
具体实施方式
31.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
32.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
33.本发明一方面提供一种食蟹猴肥胖症模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：
34.(1)选择年龄为12
‑
21岁雄性食蟹猴；
35.(2)每日喂养四次，第一次喂养含糖饲料，第二次喂养辅食，第三次喂养青料，第四
次喂养含糖饲料；
36.(3)按照步骤(2)的方式喂养一年后，检测相应的指标，筛选出bmi＞16.95kg/m2，体重＞9.3kg、腰围＞45cm的食蟹猴；
37.其中，所述喂养辅食为红糖块和饼干交替投喂，每三天交替一次；
38.所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖混合得到。
39.在优选的实施方式中，所述含糖饲料中红砂糖的含量为10
‑
15重量％。具体的，所述高糖饲料中红砂糖的含量可以为10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％或15重量％。
40.在优选的实施方式中，所述常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉。
41.进一步优选地，所述含糖饲料的营养成分如表1所示。
42.在本发明中，营养成分表中的nrv％值计算方法及格式参考gb28050
‑
2011。
43.表1
44.项目每100g能量≥1590kj蛋白质15
‑
20g脂肪5
‑
7g胆固醇0mg碳水化合物70
‑
80g钠260
‑
300mg
45.在优选的实施方式中，所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水。
46.进一步优选地，所述红糖块的营养成分如表2所示。
47.表2
48.项目每100g能量≥380kj蛋白质0.5
‑
1.5g脂肪0g胆固醇0mg碳水化合物90
‑
110g钠15
‑
25mg
49.在优选的实施方式中，所述饼干的成分包含麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料。
50.进一步优选地，所述饼干的营养成分如表3所示。
51.表3
52.项目每100g能量≥1890kj蛋白质3
‑
8g脂肪15
‑
25g胆固醇0mg
反式脂肪酸0.5
‑
1.5mg碳水化合物50
‑
70g钠250
‑
270mg
53.在优选的实施方式中，所述第一次喂养含糖饲料的投喂重量为120克。
54.在优选的实施方式中，所述第一次喂养含糖饲料的时间为7：30
‑
8：00。
55.在优选的实施方式中，在辅食喂养中，投喂红糖块时的投喂重量为30克，投喂饼干时的投喂重量为25克。
56.在优选的实施方式中，所述第二次喂养辅食的时间为12：00
‑
12：30。
57.在优选的实施方式中，所述第三次喂养青料的投喂重量为100克。
58.在优选的实施方式中，所述第三次喂养青料的时间为14：00
‑
14：30。
59.在优选的实施方式中，所述第四次喂养含糖饲料的投喂重量为120克。
60.在优选的实施方式中，所述第四次喂养含糖饲料的时间为17：00
‑
17：30。
61.在本发明所述的方法中，采用长期温和喂养的方式建立肥胖症模型。温和喂养的特点包括：饲料中的糖和脂肪含量较低，且不含果糖和胆固醇。在保证能够通过温和喂养成功得到食蟹猴肥胖症模型的前提下，还能够避免传统的高果糖和高脂(尤其是高胆固醇)喂养方式带来的隐患。
62.本发明第二方面提供上述食蟹猴肥胖症模型的建立方法在肥胖症治疗中的应用。
63.优选地，将所述方法构建的食蟹猴肥胖症模型用于发现肥胖症的治疗药物。
64.以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
65.实施例1
66.(1)选择年龄为12
‑
21岁雄性食蟹猴31只；其中，所述食蟹猴均来源于湖北天勤生物科技有限公司，采购程序符合中华人民共和国法律法规要求，经湖北省林业厅、广东省林业厅批准。实验猴均通过体格检查，各项指标符合当地检验检疫标准。
67.(2)对步骤(1)中的食蟹猴每日喂养四次，7：30
‑
8：00第一次喂养含糖饲料120克，12：00
‑
12：30第二次喂养辅食红糖块30克或饼干25克，红糖块和饼干交替投喂每三天交互一次，14：00
‑
14：30第三次喂养青料100克，17：00
‑
17：30第四次喂养含糖饲料120克，投放饲料均能全部吃完；其中所述含糖饲料由常规饲料和红砂糖组混合得到，其中含糖饲料中红砂糖的含量为15重量％，常规饲料的成分包含玉米、豆粕和鱼粉，含糖饲料的营养成分如表4所示；所述红糖块的成分包含白砂糖、赤砂糖和水，红糖块的营养成分如表5所示；所述饼干的成分包含小麦粉、奶油、白砂糖、椰丝、食用盐、葡萄糖、碳酸氢铵和食用香料，饼干的营养成分如表6所示。
68.(3)按照步骤(2)的方式喂养1年后，检测相应的指标，筛选出bmi＞16.95kg/m2，体重＞9.3kg、腰围＞45cm的食蟹猴，即为食蟹猴肥胖症模型。
69.表4
70.项目每100g能量1597kj蛋白质18.6g脂肪5.8g胆固醇0mg
碳水化合物74.4g钠281mg
71.表5
[0072][0073][0074]
表6
[0075]
项目每100g能量1898kj蛋白质5.3g脂肪20g胆固醇0mg反式脂肪酸0.9mg碳水化合物61.0g钠264mg
[0076]
在本实施例中，31只食蟹猴的bmi范围为11.95
‑
29.18kg/m2，平均值为17.45kg/m2；体重范围为6.4
‑
14.3kg，平均值为9.2kg；腰围范围为31
‑
66cm，平均值为47cm。其中，有16只食蟹猴同时满足bmi大于16.95kg/m2、体重大于9.3kg以及腰围大于45cm，因此本实施例中肥胖症发生率为51.61％。
[0077]
对比例1
[0078]
(1)选择与实施例1中相同来源的12
‑
21岁雄性食蟹猴30只。
[0079]
(2)对步骤(1)中的食蟹猴每日喂养三次，7：30
‑
8：00第一次喂养常规饲料120克，14：00
‑
14：30第二次喂与实施例1相同成分的青料100克，17：00
‑
17：30第三次喂养常规饲料120克，投放饲料均能全部吃完，常规饲料的营养成分见表7所示。
[0080]
(3)按照步骤(2)的方式喂养，喂养开始和结束的时间与实施例1相同。
[0081]
表7
[0082]
项目每100g能量1539kj蛋白质18.5g脂肪5.8g胆固醇0mg
碳水化合物59.4g钠279mg
[0083]
在本对比例中，采用与实施例1中相同的方法对食蟹猴的肥胖症程度进行评估。对照组30只食蟹猴的bmi范围为9.7
‑
21.33kg/m2，平均值为14.00kg/m2；体重范围为5.1
‑
12.7kg，平均值为7.46kg；腰围范围为27
‑
56cm，平均值为37cm。其中，有2只食蟹猴同时满足bmi大于16.95kg/m2、体重大于9.3kg以及腰围大于45cm，因此，本对比例中肥胖症发生率为6.67％。
[0084]
测试例1
[0085]
将实施例1中得到的肥胖症食蟹猴模型与对比例1中喂养后的食蟹猴的年龄、体重、体长、bmi水平、腰围进行比较。结果如图1所示，hcd表示实施例1中食蟹猴模型的测试结果，con表示对照例1中食蟹猴的测试结果，其中，图1a为年龄对比结果，图1b为体重对比结果，图1c为体长的对比结果，图1d为bmi水平对比结果，图1e为腰围对比结果。ns表示p＞0.05，***p＜0.001。
[0086]
由图可知，实施例1中得到的食蟹猴模型的体重、bmi水平和腰围明显高于对照例1的食蟹猴，实施例1中食蟹猴模型的年龄和体长与对照例1无统计学差异。上述数据表明，采用本发明所述的温和的喂养方法可成功得到类似人类的食蟹猴肥胖症模型。
[0087]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。