一种小鼠胃癌模型的建立方法

1.本发明涉及胃癌模型领域，更具体地说，涉及一种小鼠胃癌模型的建立方法。


背景技术：

2.由于缺乏成熟稳定的鼠源胃癌细胞系，种植人源胃癌细胞又存在构建人源化小鼠的技术及伦理问题，使得利用动物模型展开胃癌免疫相关的实验研究受到了极大限制。诱导小鼠自发胃癌是可行性最高的策略。
3.但目前对小鼠自发胃癌诱导过程中存在以下问题：1.传统的试验采用昆明品种的小鼠，虽然能够诱导胃癌发生，但是胃癌发生率较低，且不便于得到稳定性及一致性较高的模型，不适合用于免疫学研究，而能够得到稳定性及一致性较高模型的c57bl/6小鼠，自发胃癌概率极低，通过化学致癌物进行诱导可能对其他器官带来严重损害；而长期感染幽门螺杆菌的小鼠只能达到慢性胃炎，癌变的概率极低，几乎终生无法进展至胃癌。
4.2.常用的人源幽门螺杆菌菌株虽可以在小鼠中引起一过性胃炎，可在一定程度上模拟人体感染的情况，但难以长期定植，且无法诱导出慢性炎症后期的恶性病变。极少数利用临床分离的幽门螺杆菌菌株，虽为caga和vaga阳性，但仍为人种属特异的菌株。
5.3.亚硝基胍类为较强的致癌化学物，不仅仅会诱导胃黏膜局部发生病变，对于全身各个器官都有一定的致癌作用。
6.4.根据参考文献及预实验结果，mnu的浓度、饲喂方式等均在很大程度上影响最终造模结果。由于小鼠胃部结构不同于人，存在没有腺体结构的“前胃”部分，而已有技术采用的灌胃的方式大概率会诱导前胃产生鳞癌，而不是临床上常见的，由腺上皮恶化而来的腺癌。


技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种小鼠胃癌模型的建立方法。
8.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
9.一种小鼠胃癌模型的建立方法，包括：a.对实验小鼠禁食14～18小时，最好是16小时；b.收集在微需氧环境中培养扩增的h.felis幽门螺杆菌，在脑心浸液（bhi）液体培养基中制成均质菌液，测定od
600
值在1.8～2.2之间，优选2.0；c.待步骤b完成后，对步骤a禁食后的实验小鼠予步骤b中新鲜制备的均质菌液灌胃，每隔1天灌胃1次，共灌胃5次；d.用小鼠饮用水新鲜配置含有n-甲基-n-亚硝基脲浓度为240ppm的饮用液体，盛于避光容器中饲喂步骤c灌胃完成后的实验小鼠，连续饲喂1周记为1次，每隔一周饲喂1次，共5次；
e.待步骤d完成后，确认幽门螺杆菌定植和癌变发生。
10.进一步的，所述步骤a中实验小鼠均为免疫功能健全的5～7周大的c57bl/6雌鼠。体重范围优选为20～25g。
11.进一步的，所述步骤a中实验小鼠灌胃的量为按小鼠体重5ml/kg，灌100
µ
l～130
µ
l/鼠，每隔一天灌胃1次，在第一天时先不灌胃。
12.进一步的，所述步骤b中微需氧环境含有6-12%氧气及5-8%二氧化碳。
13.进一步的，所述步骤d中小鼠饮用液体是用普通高温高压灭菌水配置的浓度为240ppmmnu。
14.进一步的，在小鼠胃癌模型的建立过程中，可以设立处理组和对照组进行效果比对，处理组和对照组分别如下：
①
处理组，先经h.felis幽门螺杆菌至脑心浸液液体培养基中制成均质菌液灌胃进行炎症诱导，炎症诱导后2个月，小鼠进入慢性胃炎阶段，此时予n-甲基-n-亚硝基脲液体化学诱导，确认h.felis幽门螺杆菌定植和癌变发生；
②
处理组，先予n-甲基-n-亚硝基脲液体化学诱导，隔一周进行h.felis幽门螺杆菌诱导炎症，确认h.felis幽门螺杆菌定植和癌变发生；
③
处理组，仅予n-甲基-n-亚硝基脲化学液体诱导；
①
对照组，仅予h.felis幽门螺杆菌诱导炎症。
15.相比于现有技术，本发明的优点在于：（1）本方案先通过h.felis构建稳定的慢性胃炎模型后，再加以n-甲基-n-亚硝基脲（mnu）化学诱导，建立小鼠原发性胃癌模型，模拟了人体中因幽门螺杆菌感染、各类化学物质损伤最终导致胃癌发生发展的correa胃癌模式，相比于常规种植肿瘤细胞系得到的胃癌组织，存在更高的异质性，更加贴近真实状态，更有助于相关的免疫学研究。
16.（2）本方案通过先炎症诱导，再化学诱导的联合诱导方式加快了小鼠成瘤速度，极大的提升小鼠实验时存活率以及胃部肿瘤成瘤的概率，同时保证了胃黏膜局部免疫微环境为幽门螺杆菌特异性，避免了单独mnu化学诱导导致胸腺瘤、肠癌、生殖器官肿瘤等疾病的情况，并且避免了先化学损伤，再细菌感染的策略对胃黏膜造成急性损伤从而影响幽门螺杆菌正常定植的情况发生。
17.（3）本方案中采用了c57bl/6小鼠，有效解决了c57bl/6小鼠自发胃癌概率极低的问题，提高了c57bl/6小鼠自发胃癌的概率，且同时利用其遗传背景一致性较高的特性得到了稳定性及一致性较高的模型，而且试验时采用免疫功能健全的c57bl/6小鼠，为在小鼠体内进行免疫相关的实验提供了便利，还能够避免免疫细胞回输导致的排斥反应，所得实验结果更加可靠。
18.（4）本方案中采用了h.felis菌株，对小鼠的亲嗜性更强，能够在小鼠胃黏膜中长期定植，且长期的感染可自发诱导出腺瘤、腺癌等恶性病变。
19.（5）本发明采用浓度为240ppm的n-甲基-n-亚硝基脲液体，对小鼠进行灌胃，按小鼠体重5ml/kg的方式，灌100
µ
l～130
µ
l/鼠，得到了更优的最终造模结果，更有助于小鼠胃癌模型的建立。
20.（6）.本方案中仅用雌鼠，因为雌鼠对h.felis敏感性更高，胃癌成瘤率更高。
附图说明
21.图1为本发明中幽门螺杆菌在胃黏膜中成功定植的示意图；图2为本发明中幽门螺杆菌感染成功诱发胃炎的示意图（左边图片为正常胃黏膜图片，中间图片为胃粘膜发生急性胃炎的图片，右边为胃粘膜发生慢性胃炎的图片）；图3为本发明中小鼠胃癌标本（左边图片为正常胃黏膜图片，中间图片为胃粘膜发生慢性胃炎的图片，右边为胃发生癌变的图片）。
具体实施方式
22.请参阅图1-3的一种小鼠胃癌模型的建立方法，它选用免疫功能健全的c57bl/6小鼠用作研究；包括以下步骤：a.对实验小鼠禁食；b.收集在微需氧环境中培养扩增的h.felis幽门螺杆菌，在脑心浸液（bhi）液体培养基中制成均质菌液，测定od
600
值在1.8～2.2之间；c.待步骤b完成后，对步骤a禁食后的实验小鼠予步骤b中新鲜制备的均质菌液灌胃，每隔1天灌胃1次，共灌胃5次；d.用小鼠饮用水新鲜配置含有n-甲基-n-亚硝基脲浓度为240ppm的饮用液体，盛于避光容器中饲喂步骤c灌胃完成后的实验小鼠，连续饲喂1周记为1次，每隔一周饲喂1次，共5次；e.待步骤d完成后，确认幽门螺杆菌定植和癌变发生。
23.步骤a中实验小鼠为5～7周大的c57bl/6雌鼠，实验小鼠数量为200～300只，每只体重范围为20～25g。步骤a中禁食时间范围为14小时～18小时。步骤a中实验小鼠灌胃的量为按小鼠体重5ml/kg，灌100
µ
l～130
µ
l/鼠，每隔一天灌胃1次，在第一天时先不灌胃。步骤c中微需氧环境为含6-12%氧气、5-8%二氧化碳的环境。所述步骤d中小鼠饮用液体是用普通高温高压灭菌水配置的浓度为240ppmmnu。
24.具体实施例一：先在微需氧环境中培养扩增的h.felis幽门螺杆菌至脑心浸液液体，然后在培养基中制成均质菌液，测定od
600
值在2.0，然后进行分组：随机选50只6周龄的小鼠，放在温度为19℃，42％湿度的培养设备内，先禁食16个小时，然后予以新鲜制备的菌液灌胃，每隔1天灌胃1次，每次灌100
µ
l/鼠，共灌胃5次，如图1所示，h.felis幽门螺杆菌在胃黏膜中成功定植，两个月后，如图2所示，h.felis幽门螺杆菌成功诱发胃炎，此时予以n-甲基-n-亚硝基脲化学诱导，用小鼠饮用水配置含有n-甲基-n-亚硝基脲的浓度为240ppm的饮用液，连续饲喂1周记为1次，每隔一周饲喂1次，共5次，一共十周，如图3所示，通过h.felis和n-甲基-n-亚硝基脲联合成功诱导原发性胃癌。先h.felis构建稳定的慢性胃炎模型后，再mnu化学诱导，小鼠存活率较高。
25.具体实施例二：先进行动物分组：随机选50只6周龄的小鼠，放在温度为19℃，42％湿度的培养设备内，然后用小鼠饮用水配置含有n-甲基-n-亚硝基脲的浓度为240ppm的饮用液，连续饲喂1周记为1次，每隔一周饲喂1次，共5次，一共十周，间隔一周后，先在微需氧环境中培养扩增的h.felis幽门螺杆菌至脑心浸液液体，然后在培养基中制成均质菌液，测定od
600
值在2.0，先禁食16个小时，然后予以新鲜制备的菌液灌胃，每隔1天灌胃1次，每次灌100
µ
l/鼠，共灌胃5次，如图3所示，通过h.felis幽门螺杆菌和n-甲基-n-亚硝基脲可以联合
成功诱导原发性胃癌，但是这种采用先化学损伤，再细菌感染的策略，易导致小鼠因胃黏膜急性损伤而影响幽门螺杆菌正常定植的情况发生；并且mnu极易诱发胸腺瘤、肠癌、生殖器官肿瘤等疾病，导致小鼠存活率较低，存活时间较具体实施例一的小鼠短，不利于在后续相关的免疫学研究中试验。
26.具体实施例三：先进行动物分组：随机选50只6周龄的小鼠，放在温度为19℃，42％湿度的培养设备内，然后用小鼠饮用水配置含有n-甲基-n-亚硝基脲的浓度为240ppm的饮用液，连续饲喂1周记为1次，每隔一周饲喂1次，共5次，一共十周，随着时间的增加，小鼠其他器官被严重损坏，不能作为后续检测的样本。
27.对比实施例一：先进行动物分组：随机选50只6周龄的小鼠，放在温度为19℃，42％湿度的培养设备内，先在微需氧环境中培养扩增的h.felis幽门螺杆菌至脑心浸液液体，然后在培养基中制成均质菌液，测定od
600
值在2.0，先禁食16个小时，然后予以新鲜制备的菌液灌胃，每隔1天灌胃1次，每次灌100
µ
l/鼠，共灌胃5次，如图1-2所示，幽门螺杆菌定植成功后，胃炎也成功诱发，但是诱发原发性胃癌概率极低。