八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法

1.本发明涉及植物育种技术领域，特别涉及一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法。


背景技术：

2.八月瓜(holboellia latifolia wall.)是近年来兴起的第三代新型果树，为常绿木质藤本，掌状复叶有小叶3片。八月瓜果实营养丰富，果肉乳白色，风味独特，香甜软糯，除鲜食外还可酿酒、制作果桨和饮料。但由于八月瓜目前还处于开发应用之初，缺乏人工选育的优良品种，导致整个产业发展缓慢，因此，选育八月瓜优质高效的新品种势在必行。
3.目前种植的八月瓜最主要的缺点是种子太多，果肉少，可食率低，解决此问题的主要方法是通过染色体加倍处理获得四倍体，然后用四倍体再与二倍体杂交，最终获得无籽的三倍体来实现。但传统的染色体加倍剂处理方法的诱变效率低，畸变率和致死率高，难以取得满意的诱变效果。为此，减轻损伤植株和提高诱变效率的效果，对加速八月瓜育种具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，大大减轻了染色体加倍剂对八月瓜的伤害，诱变效率大幅度提升。
5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
6.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂，所述药剂为水杨酸及硝普钠中其中一种或其混合。
7.进一步优选的，所述水杨酸的浓度为50～200μmol/l，所述硝普钠的浓度为50～200μmol/l。
8.进一步优选的，所述药剂为浓度100μmol/l的水杨酸。
9.进一步优选的，所述药剂为浓度100μmol/l的硝普钠。
10.进一步优选的，所述药剂为浓度100μmol/l水杨酸和浓度100μmol/l硝普钠的混合。
11.本发明还提供一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的方法，包括以下步骤：
12.s1、八月瓜幼苗移栽两周后，待充分缓苗后，用所述药剂浸润栽有八月瓜的营养钵，使营养钵中的栽培基质充分吸收药剂，以后每周处理(浇灌)一次；
13.s2、从药剂处理的当天开始，每天下午18:00喷施一次染色体加倍剂，喷施的量为每株八月瓜苗的叶片和茎干均完全湿润为止。
14.进一步优选的，用所述药剂处理八月瓜共计四周。
15.进一步优选的，所述染色体加倍剂的配方为0.01％二甲戊灵+0.01％氟乐灵+0.01％丙草胺+0.01％秋水仙碱混合液(前三种为体积比，最后一种为质量体积比)。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.其一、本发明采用低浓度长时间染色体加倍剂处理，药剂喷洒在整个八月瓜植株上，药剂与植株接触面积大，通过叶片和茎干幼嫩部位的吸收效果好，且由于根部浇灌了水杨酸和硝普钠，大大减轻了染色体加倍剂对八月瓜的伤害，诱变效率大幅度提升。
18.其二、八月瓜幼苗在染色体加倍剂胁迫下，水杨酸和硝普钠处理可有效提高八月瓜苗的渗透调节物质含量，减缓细胞脱水，从而提高八月瓜苗的抗逆性。
具体实施方式
19.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
20.自2019年以来，在昆明学院农学实践园大棚开展八月瓜的诱变育种，依照本发明所述方法进行八月瓜的诱变处理，进行如下操作：
21.实施例1
22.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，步骤包括：
23.1)八月瓜的育苗
24.采用压条和播种的方式进行育苗。压条的方法为把八月瓜从基部抽生出的新枝条拉到地面上，然后挖土覆盖枝条，采用间隔式压条，每个枝条压土覆盖20cm左右，间隔20cm左右不覆盖，再接着压土覆盖20cm左右，再间隔20cm左右，以此类推至整个枝条。播种的方法为8—9月果实成熟后，采下果实，取出种子和果肉，把种子上的果肉洗净，立即播种于大棚里，每平方米可播种200—300粒种子。一般播种1个月后开始萌芽，冬季应注意保温，幼苗越冬的绝对低温不低于4℃。
25.2)八月瓜的移栽及无土栽培
26.幼苗长至10cm左右时移栽到直径和高均为25cm的营养钵中，营养钵中的栽培基质为泥炭︰蛭石︰珍珠岩＝3︰1︰1(体积比)充分混匀，每个营养钵中移栽3株幼苗。幼苗移栽后每周浇一次hoagland’s营养液(ph值5.6)。
27.3)提高耐化学诱变剂的药剂及处理方法
28.移栽2周后，待充分缓苗后，挑选出来生长健壮的八月瓜苗连同营养钵一起放进不漏水的长条盆中(长条盆的长、宽、高分别为120cm、35m、30cm)，每个长条盆中放入4个营养钵，然后在每个对应的长条盆中分别加入浓度为100μmol/l的水杨酸8l，使营养钵中的栽培基质充分吸收处理液，最后长条盆底部的处理液还剩5cm左右(t9正常管理，不加任何处理液)。以后每周更换一次处理液，即把长条盆中的剩余的处理液倒掉，换入8l新的处理液。重复4次。
29.4)八月瓜的化学诱变剂配方及处理方法
30.在3)处理的当天进行第一次采样，样品为健康、成熟、无病虫害的叶片。从3)处理的当天开始，每天下午18:00喷施一次染色体加倍剂，喷施的量为每株八月瓜苗的叶片和茎干均完全湿润为止，喷施时间为4周(28天)。染色体加倍剂的配方为0.01％二甲戊灵+0.01％氟乐灵+0.01％丙草胺+0.01％秋水仙碱混合液(前三种为体积比，最后一种为质量体积比)。
31.实施例2
32.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例2与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度100μmol/l的水杨酸。
33.实施例3
34.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例3与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度200μmol/l的水杨酸。
35.实施例4
36.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例4与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度50μmol/l的硝普钠。
37.实施例5
38.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例5与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度100μmol/l的硝普钠。
39.实施例6
40.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例6与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度200μmol/l的硝普钠。
41.实施例7
42.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例7与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂为浓度100μmol/l水杨酸和浓度100μmol/l硝普钠的混合。
43.实施例8
44.一种八月瓜染色体加倍减轻损伤和提高诱变率的药剂及方法，实施例8与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：在3)中的药剂换成蒸馏水。
45.设置对照(ck)
46.对照(ck)与实施例1相同的技术方案不再赘述，其不同之处在于：不进行3)的处理，在4)中喷洒的染色体加倍剂换成蒸馏水，喷洒方法和时间同实施例1。
47.实施例1-8以及对照(ck)处理后八月瓜苗的受害情况统计
48.不同处理下喷洒染色体加倍剂对八月瓜苗的受害程度分级标准为：0级植株生长正常，无任何受伤迹象；1级幼叶出现受伤斑点，成年叶无明显变化；2级幼叶受伤斑点扩大并有少量脱落，成年叶亦出现斑点；3级幼叶大量枯萎脱落，成年叶受伤斑点扩大并有少量枯萎脱落；4级大部分成年叶枯死、脱落。
49.受害指数＝[σ(受害株数
×
病级数)/(总株数
×
最高受害级)]
×
100％。
[0050]
表1染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜苗受伤指数的影响(％)
[0051]
[0052][0053]
注:同一列上不同字母表示在p《0.05水平上差异显著；数据为4次重复试验的平均值。下表同。
[0054]
从表1可看出，随着染色体加倍剂胁迫时间的增加，水杨酸和硝普钠处理均能有效减轻染色体加倍剂对八月瓜苗的伤害程度。在处理的第0天，所有处理的受伤指数均为0；在处理的第7天，蒸馏水处理的受伤指数达21.12％，显著高于其他处理，而100μmol/l硝普钠+100μmol/l硝普钠处理的受伤指数仅为5.81％，显著低于其他处理(ck除外)；在处理的第14天、第21天和第28天规律亦如此；到处理的第28天时，蒸馏水处理的受伤指数已高达93.34％，显著高于其他处理，而100μmol/l硝普钠+100μmol/l硝普钠处理的受伤指数也仅为48.47％，显著低于其他处理(ck除外)。
[0055]
可见，尽管50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的水杨酸和硝普钠处理均能有效提高八月瓜耐染色体加倍剂胁迫的能力，但以100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠处理的效果最好。
[0056]
实施例1-8以及对照(ck)处理后八月瓜苗的生理生化指标
[0057]
可溶性糖、脯氨酸和蛋白质是植物体内重要的渗透调节物质，逆境胁迫下，这些物质的大量积累能够减缓细胞脱水而受伤的程度，从而提高作物抗逆性。
[0058]
表2染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜可溶性糖含量的影响(mg/g)
[0059][0060]
从表2可看出，在处理的第0天，各处理的可溶性糖含量相差不大，未达到差异显著性水平，随后各处理的可溶性糖含量大幅度上升(ck除外)。在处理的第7天、第14天和第21天，50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的水杨酸和硝普钠处理后的可溶性糖含量显著高于蒸
馏水处理和ck；到处理的第28天，100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠处理的可溶性糖含量高于其他各处理，而蒸馏水处理则显著低于其他各处理(ck除外)。
[0061]
表3染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜脯氨酸含量的影响(μg/g)
[0062][0063]
从表3可看出，在处理的第0天，各处理的脯氨酸含量相差不大，但随着处理时间的推移，各处理的脯氨酸含量大幅度上升(ck除外)。在处理的第14天、第21天和第28天，100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理后的脯氨酸含量最高，且显著高于蒸馏水处理和ck。
[0064]
表4染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜蛋白质含量的影响(mg/g)
[0065][0066]
从表4可看出，在处理的第0天，各处理的蛋白质含量相差不大，差异不显著，但随着处理时间的推移，各处理蛋白质含量大幅度上升(ck除外)。在处理的第14天、第21天和第28天，100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理后的蛋白质含量最高，且显著高于蒸馏水处理和ck。可见，染色体加倍剂胁迫下，水杨酸和硝普钠处理可有效提高八月瓜苗的渗透调节物质含量，减缓细胞脱水，从而提高八月瓜苗的抗逆性，其中以100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理效果最佳。
[0067]
丙二醛是细胞膜脂过氧化的产物，其含量直接反应细胞受到氧化伤害的程度。逆境胁迫下，植物体内积累的丙二醛越高，证明其细胞膜受到的破坏越严重，其抗逆性越差。
[0068]
表5染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜丙二醛含量的影响(μmol/g)
[0069][0070]
从表5可看出，在处理的第0天，各处理的丙二醛含量相差不大，均未达到差异显著性水平，之后各处理的丙二醛含量便开始上升(ck除外)；在处理的第7天、第14天、第21天和第28天，100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理的丙二醛含量均显著低于其他处理，而蒸馏水处理的丙二醛含量均高于其他处理。
[0071]
超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)是植物体内两种重要的抗氧化酶，其作用是清除氧自由基和过氧化氢，以保护细胞免受氧化伤害。
[0072]
表6染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜sod活性的影响(u/g)
[0073][0074]
从表6可看出，在处理的第0天时，各处理的sod活性相差不大，均达到差异显著性水平，但之后出现不同程度的上升(ck除外)；在处理的第7天、第14天、第21天和第28天时，蒸馏水处理的sod活性最低(ck除外)；而在处理的第21天和第28天时，100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理的sod活性最高，特别是在处理的第28天时与其他处理相比达到差异显著性水平。
[0075]
表7染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理下八月瓜pod活性的影响[u/(mg
·
min)]
[0076][0077]
从表7可看出，在处理的第0天时，各处理的pod活性相差不大，均未达到差异显著性水平，但随后各处理出现不同程度的上升(ck除外)；在处理的第7天、第14天和第28天，蒸馏水处理的pod活性最低(ck除外)；而100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理的pod活性最高。
[0078]
实施例1-8以及对照(ck)处理停止两个月后八月瓜苗的存活率及变异率
[0079]
每个处理的八月瓜苗数均为48株，在喷洒染色体加倍剂28天后，对各处理停止喷洒染色体加倍剂，条盆中也停止浇灌水杨酸和硝普钠，仅对每个营养钵每隔2天浇500ml hoagland’s营养液，让其缓苗并恢复生长。
[0080]
表8染色体加倍剂胁迫下水杨酸和硝普钠处理对八月瓜存活率和变异率的影响
[0081]
处理总株数(株)存活株数(株)存活率(％)变异株数(株)变异率(％)实施例1482041.671225.00实施例2482450.001327.08实施例3482041.67816.67实施例4482450.001122.92实施例5482450.001429.17实施例6482041.671225.00实施例7483266.672041.67实施例848816.67612.50对照(ck)484810000
[0082]
从表8可看出，缓苗和恢复生长两个月后，各处理的存活株数和存活率相差甚大，其中存活株数和存活率最高的是100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理，其存活株数达32株，存活率达66.67％；而存活株数和存活率最低的是蒸馏水处理，存活株数仅为8株，存活率仅为16.67％。根据八月瓜植株的形态特征初步判断各处理的变异株数，并计算变异率。并且100μmol/l水杨酸+100μmol/l硝普钠复合处理的变异株数和变异率均最大，分别为20株和41.67％；而蒸馏水处理的变异株数和变异率均为最小，分别是6株和12.50％。
[0083]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本
发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。